劉 佳，李曉莉，屈長青,2*

（1.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽 236037；2.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

藏靈菇乳清對雞血細(xì)胞的保護(hù)作用的探究

劉 佳1，李曉莉1，屈長青1,2*

（1.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽 236037；2.阜陽師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

本文研究了藏靈菇乳清對經(jīng)過氧化氫處理的雞血細(xì)胞的保護(hù)作用。用藏靈菇乳清粉配制的三種不同濃度的乳清溶液（1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL）作為實(shí)驗(yàn)組，0.75%的生理鹽水處理作對照組，孵育后臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存活狀態(tài)，MTT法測定雞血細(xì)胞的成活率及測定細(xì)胞溶血度。結(jié)果顯示不同濃度的乳清處理后的雞血細(xì)胞的存活率均高于對照組，細(xì)胞溶血度均低于對照組，并且經(jīng)3 mg/mL的乳清處理的細(xì)胞成活率和細(xì)胞溶血度與其他各組差異均顯著，表明乳清對氧化損傷的雞血細(xì)胞具有保護(hù)作用。

藏靈菇乳清；過氧化氫；MTT；保護(hù)作用；成活率

“西藏靈菇”（Tibetan mushroom）又名“西藏雪蓮”，是源自西藏藏南的林芝地區(qū)和新疆天山天池以上海拔山區(qū)的特有珍稀菌種，是西藏林芝和新疆天山土生土長的有生命的菌類[1]。藏靈菇是一種非水溶性的呈乳白色、膠質(zhì)狀的顆粒，直徑0.3～3.5 cm，其外形酷似米粒[2-3]，不同來源的藏靈菇顆粒的菌群和組成成分有所不同，通常含有乳酸菌和酵母菌，少數(shù)含有由蛋白脂質(zhì)多糖復(fù)合體固體基質(zhì)包裹的乙酸菌，是一個(gè)微型共生菌落體[4]。用藏靈菇發(fā)酵酸奶的進(jìn)程當(dāng)中，只用藏靈菇和鮮牛奶，無需加熱，不會(huì)影響酸奶中有效成份的活性，使發(fā)酵所得的酸奶含有100%的乳酸活菌，發(fā)酵進(jìn)程不需添加任何添加劑（如增稠劑，添加劑，甜味素，防腐劑，調(diào)味素等）另外，藏靈菇有多種益生作用，藏靈菇中的微生物和多糖等活性成份具備調(diào)理腸道微生態(tài)平衡，改良腸道功效，其廣譜的抑菌特征可以抑制病菌傳染腸道，加強(qiáng)免疫調(diào)理等。藏靈菇菌群共生發(fā)酵發(fā)生的益生作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其所含的任何菌，所以在推重康健保健，免疫綜合防治的當(dāng)今，藏靈菇乳及其相干產(chǎn)物是優(yōu)質(zhì)的自然奶制飲品[5-6]。

乳清（Whey）是在酸奶生產(chǎn)過程當(dāng)中，牛奶固結(jié)成凝乳塊后分出的呈綠色的、半透明的液體，其構(gòu)成成份最類似于母乳，利于人體的吸收。乳清中含有的營養(yǎng)成分基本上都是可溶的，如乳清卵白、磷脂、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等。新鮮的乳清經(jīng)巴氏殺菌之后，再經(jīng)過冷凍干燥成粉末狀，這就是乳清粉[7-8]。乳清粉中除水分以外的其他成分的比例與新鮮的乳清一致。在美國，大約有2/3的乳清直接噴霧干燥成乳清粉或制成乳清濃縮液，其余的1/3的乳清進(jìn)一步加工成其他的乳清產(chǎn)品，如脫鹽乳清粉、低乳糖乳清粉、高乳糖乳清粉、乳糖、乳清濃縮蛋白（WPC）和乳清分離蛋白（WPL）。藏靈菇在發(fā)酵酸奶的過程中會(huì)產(chǎn)生大量的抗氧化類物質(zhì)，這些物質(zhì)分布于乳清中可使乳清具有抗氧化作用，而這是其他酸奶發(fā)酵工藝制備的酸奶所不具有的。正常情況下，生物體中的自由基能保護(hù)生物體避免有害微生物、細(xì)菌等侵害[9-11]，但自由基過量時(shí)會(huì)與細(xì)胞中的蛋白，脂質(zhì)和DNA等生物大分子反應(yīng)，產(chǎn)生毒害效應(yīng)，加速細(xì)胞的氧化衰老，縮短機(jī)體壽命[10]，雖然正常細(xì)胞內(nèi)存在清除自由基的防御系統(tǒng)，一定程度上可降低自由基對細(xì)胞的損傷，但這些系統(tǒng)不能完全有效的防止傷害。已有研究表明用抗氧化劑處理細(xì)胞則會(huì)減少細(xì)胞在代謝過程中自由基的形成，從而延緩細(xì)胞的衰老，所以通過適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充抗氧化劑可以減少機(jī)體氧化損傷，而藏靈菇乳清中的乳酸菌等抗氧化類物能減輕自由基對細(xì)胞危害[12-14]。

但由藏靈菇發(fā)酵所得的含有抗氧化成分的乳清在抗疲勞、抗氧化和免疫方面的研究較少，其抗氧化能力及效果等目前還尚不清楚，所以該產(chǎn)品的開發(fā)利用都受到了一定的影響，這些都使實(shí)驗(yàn)的研究具有一定的研究意義。其主要目標(biāo)就是利用研究結(jié)果開發(fā)出對人體更加有利的保健產(chǎn)品。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藏靈菇菌種；伊利無菌磚純牛奶；雞血樣本，清晨于菜市場采取新鮮的雞血，置于4℃冰箱中保藏。DMEM高糖培養(yǎng)基美國Hyclone公司；DMSO美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉，西隴化工有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

AR224CN電子天平奧豪斯儀器上海有限公司；酶標(biāo)儀美國BioTek公司；定溫恒溫干燥箱上海愛朗儀器有限公司；高壓滅菌鍋日本HIRAYAMA公司；低溫離心機(jī)BECKMANCOULTER公司；ZD-9556-A水平脫色搖床太倉市科教器材廠；普通冰箱海爾集團(tuán)有限公司；個(gè)人高速離心機(jī)德國eppendorf公司；冷凍干燥機(jī)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 乳清的制作與提取

2.1.1 發(fā)酵劑的制備

將藏靈菇放置于3%（w/v）無抗純牛乳中，37℃條件下發(fā)酵24 h，濾出藏靈菇菌，濾出液即為用于提取乳清的酸奶[21]。

2.1.2 乳清的提取

將發(fā)酵好的酸奶于55℃水浴30 min，呈現(xiàn)出上層酪蛋白與下層黃綠色乳清鮮明的兩層，過濾出下清液至于真空抽濾泵粗提，再將粗提液于真空抽濾泵中細(xì)提取便可得到所需乳清。

2.1.3 乳清粉的制作

將提純的乳清倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，保證高度不超過1 cm，-80℃急凍8 h之后，轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥箱內(nèi)，進(jìn)行真空冷凍干燥12 h，收集凍干的乳清，用粉碎機(jī)將凍干樣品打粉30 s，收集乳清粉用真空包裝，放在通風(fēng)干燥環(huán)境中保存。

2.2 紅細(xì)胞懸液的制備

首先全血1 500 r/min離心5 min（離心后去上清液，加0.85%生理鹽水，混勻，再棄去上清液后再離心，可重復(fù)這個(gè)操作，不超過3次，直至離心后上清液透亮）制備壓積紅細(xì)胞，然后取100 μL加入到9.9 mL的生理鹽水中，緩慢吹打混勻，即是1%的紅細(xì)胞懸液[22]。

2.3 臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞生死狀態(tài)

取 200 μL、0.5%的 H2O2，加入到等體積的 1%的紅細(xì)胞懸液中，并設(shè)置無H2O2的對照組混勻，室溫條件下保溫30 min。分別取400 μL的不同濃度的乳清溶液和生理鹽水，加入到等體積的紅細(xì)胞處理液中混勻，室溫條件下保溫30 min后，2 000 r/min，5 min離心兩次。向沉淀中加入500 μL、0.85%生理鹽水，輕輕吹打幾次，制成細(xì)胞懸液。分別向每組懸液中加入2～3滴0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液，混合，染色2 min后鏡檢拍照。

2.3 MTT比色法測定雞紅細(xì)胞成活率

取 200 μL、0.5%的 H2O2，加入到等體積的 1%的紅細(xì)胞懸液中，并設(shè)置無H2O2的對照組混勻，室溫條件下保溫30 min。分別取400 μL的不同濃度的乳清溶液和生理鹽水，加入到等體積的紅細(xì)胞處理液中混勻，室溫條件下保溫30 min后，2 000 r/min，5 min離心兩次。最后使用微量吸樣器，在96孔酶標(biāo)板中，在含有樣品的各孔中加入20 μL 的 MTT 液和 100 μL 的血細(xì)胞樣本液，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中放置4小時(shí)后取出，再向各孔加入200 μL的二甲亞砜（DMSO），用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm和530 nm處掃描測定OD值，測量前于水平振蕩儀上振蕩10 min[15-17]。

2.4 雞紅細(xì)胞溶血度的測定

將配成濃度為1%的紅細(xì)胞懸液，于37℃溫育5 min，然后加入終濃度為5%的H2O2引發(fā)溶血，再置37℃溫育30 min。取反應(yīng)混合液1 mL，用不同濃度的乳清2 mL稀釋，2 000 r/min，離心10 min，取上清液再540 nm處測吸光值A(chǔ)；同樣取1 mL反應(yīng)混合液，用蒸餾水2 mL稀釋使紅細(xì)胞完全溶血，同樣條件下離心后在540 nm處測吸光值B，按公式（A/B）×100%計(jì)算百分溶血度。

2.5 數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS18.0做差異性分析。采用Excel繪圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 臺(tái)盼藍(lán)染色

臺(tái)盼藍(lán)為無毒染料，其氧化型為藍(lán)色，還原型為無色。活細(xì)胞因具有較強(qiáng)的還原能力所以可以將藍(lán)色的臺(tái)盼藍(lán)還原成無色狀態(tài)，因此鏡檢時(shí)可見死細(xì)胞被染成藍(lán)色。用不同濃度的乳清對0.5%H2O2處理的紅細(xì)胞的保護(hù)作用的結(jié)果如圖1，藍(lán)色細(xì)胞所占比例越小說明細(xì)胞受損傷死亡越少。結(jié)果顯示在不同處理下細(xì)胞均有死亡而當(dāng)乳清濃度為3 mg/mL時(shí)，不論是在生理鹽水處理組還是在0.5%H2O2處理藍(lán)色比例均小于其他實(shí)驗(yàn)組，表明一定濃度的乳清對雞血細(xì)胞的成活具有保護(hù)作用。

圖1 不同濃度的乳清對H2O2損傷的保護(hù)作用 A～D為生理鹽水對照組，其乳清樣液濃度依次為0 mg/mL、1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL；E～H 為 H2O2處理組，其乳清樣液濃度依次為 0 mg/mL、1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL

3.1 MTT測定

用不同濃度的乳清對0.5%H2O2處理的紅細(xì)胞的保護(hù)作用的比較，在490 nm和530 nm處測OD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，橫坐標(biāo)表示不同條件下的乳清濃度，縱坐標(biāo)表示不同條件下的光吸收值即OD值（間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量），OD值越大表明活細(xì)胞數(shù)量越多，也就表明了此條件下的乳清抑制了過氧化氫對細(xì)胞的氧化損傷。圖中結(jié)果表明，在過氧化氫氧化損傷的情況下，不同濃度的藏靈菇乳清均能抑制過氧化氫對雞紅細(xì)胞的氧化損傷作用，但1 mg/mL、3 mg/mL的乳清與空白組無顯著性差異，5 mg/mL的乳清與其他各組均差異顯著。綜上所述，一定濃度的乳清可以提高雞紅細(xì)胞的抗氧化能力。

3.2 細(xì)胞溶血度的測定

圖2 不同濃度的乳清對抗H2O2誘導(dǎo)的氧化活性

溶血表明紅細(xì)胞損傷破裂，血紅蛋白逸出，而OD值即吸光值越大表明紅細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。如表 1，可以看出經(jīng)濃度 1 mg/mL、3 mg/mL、5 mg/mL藏靈菇乳清處理的雞血細(xì)胞的吸光值分別為0.791、0.623和 0.699，均低于空白組的吸光值0.833，證明經(jīng)不同濃度的藏靈菇乳清處理后，雞血細(xì)胞的細(xì)胞溶血度降低，且3 mg/mL組的細(xì)胞溶血度較空白組有顯著性差異。但1 mg/mL組與5 mg/mL組的細(xì)胞溶血度與空白組無顯著性差異，綜上表明，濃度為3 mg/mL的藏靈菇乳清顯著降低雞血細(xì)胞的溶血度，即藏靈菇乳清對氧化損傷的細(xì)胞具有保護(hù)作用。

表1 不同乳清濃度對細(xì)胞溶血度的影響

4 討論

1993年Yamaguchi T[18]等人就有相關(guān)研究，正常情況下，Hb在紅細(xì)胞內(nèi)主要以游離狀態(tài)存在，也有小部分與紅細(xì)胞膜結(jié)合，當(dāng)Hb異常或者膜脂異常暴露以及藥物作用時(shí)，均可引起Hb不可逆地與脂質(zhì)層結(jié)合而導(dǎo)致細(xì)胞膜變形扭曲，紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化是最常見的紅細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞溶血，因此一定濃度的氧化物如過氧化氫處理紅細(xì)胞后Hb釋放增加。

同時(shí)，也有大量研究表明，無論是體內(nèi)還是體外，過多的氧自由基可引發(fā)紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，繼而導(dǎo)致細(xì)胞氧化溶血，是發(fā)生溶血性疾病的重要原因之一。2003年劉慧明等基于此做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)[19]，研究槲皮素對過氧化氫誘導(dǎo)的人紅細(xì)胞氧化損傷的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素對H2O2引發(fā)的紅細(xì)胞氧化損傷有明顯的保護(hù)作用。凌玉芳研究乳清蛋白酶解物對過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷的保護(hù)作用，表明了乳清具有抗氧化作用[20]。

在此基礎(chǔ)上，研究了藏靈菇乳清對雞血細(xì)胞的保護(hù)作用。可以看出，與生理鹽水對照組相比較，當(dāng)乳清濃度為1、3、5 mg/mL時(shí)，雞血細(xì)胞損傷均有不同程度的降低，但3 mg/mL的乳清對細(xì)胞的保護(hù)作用更為顯著，由此說明一定濃度的藏靈菇乳清對氧化損傷的細(xì)胞具有保護(hù)作用。

藏靈菇乳清是一種很好的抗氧化劑，一定濃度的藏靈菇乳清能夠有效的清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，降低細(xì)胞的損傷，進(jìn)一步證明了乳清對細(xì)胞抗氧化具有一定的增強(qiáng)效果。但由于乳清成分多樣復(fù)雜，提高細(xì)胞的抗氧化作用的具體成分還有待于進(jìn)一步研究。

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Protective effect ofTibetan mushroomwhey on chicken blood cells

LIU Jia1,LI Xiao-li1,QU Chang-qing1,2*
(1.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine,Fuyang Anhui236037,China;2.School of Biological Science and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang Anhui236037,China)

In this paper,the protective effect ofTibetan mushroomwhey on chicken blood cells treated with hydrogen peroxide was studied.Three different concentrations of whey solution(1 mg/mL,3 mg/mL and 5 mg/mL)were prepared from the whey powder as the experimental group,and 0.75%saline were used as control group.The survival status of the cells was determined by trypan blue staining method,and the method of MTT assay was used to determine the survival rate of the blood cells and the determination of hemolysis.The results showed that the survival rate of chicken blood cells in the experimental group of different concentrations was higher than those in the control group and 3 mg/mL of whey.Same concentration of whey cell hemolysis are lower than that in the control group,3 mg/mL whey difference with other groups,which shows that the whey's blood cells with oxidative damage are protective.

Tibetan mushroomwhey;H2O2;MTT;protective effect;survival rate

TQ929.2文獻(xiàn)識(shí)別碼：A

1004-4329（2017）04-045-05

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）04-045-05

2017-10-20

安徽省省級科研平臺(tái)委托專項(xiàng)項(xiàng)目（2014KSLZX01ZD）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201610371060，201610371062）；安徽省教育廳高校創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目（2016）資助。

屈長青（1972－ ），男，博士，教授，研究方向：中草藥抗衰老機(jī)理。Email：qucq518@163.com。