趨化因子CC配基2對-Synuclein誘導的小膠質細胞增殖及神經元凋亡的影響

張黎軍 趙盼盼 趙建華 王超偉 李 青 隨瑞斌 袁 彬

新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，河南 新鄉 453100

·論著科研之窗·

張黎軍 趙盼盼 趙建華 王超偉 李 青 隨瑞斌 袁 彬△

新鄉醫學院第一附屬醫院神經內科，河南 新鄉 453100

目的探討趨化因子CC配基2(CCL2)對-突觸核蛋白(-Synuclein)介導的小膠質細胞增殖及神經元凋亡的影響。方法體外分離培養原代小膠質細胞和原代神經元。小膠質細胞分為4組，依次為對照組、CCL2組、-Synuclein組、CCL2+-Synuclein組。對照組中加入等量的PBS，CCL2組細胞中加入含有CCL2濃度為0.05 ng/μL的培養液。-Synuclein組細胞中加入含有-Synuclein濃度為0.2 ng/μL的培養液。CCL2+-Synuclein組中加入含有0.05 ng/μL CCL2、0.2 ng/μL-Synuclein的細胞培養液。培養24 h后，檢測小膠質細胞增殖情況及細胞中-Synuclein蛋白水平，同時檢測細胞培養液中TNF-、IL-1、NO含量。用各組小膠質細胞培養液培養原代神經元，觀察神經元凋亡情況及神經元中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt水平。結果CCL2組、-Synuclein組、CCL2+-Synuclein組小膠質細胞增殖活性及分泌TNF-、IL-1、NO水平明顯高于對照組(P<0.05)。CCL2組、CCL2+-Synuclein組小膠質細胞中-Synuclein水平明顯高于對照組(P<0.01)。CCL2組、-Synuclein組、CCL2+-Synuclein組小膠質細胞培養液作用后的神經元凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白水平明顯高于對照組，p-Akt水平低于對照組(P<0.01)。結論CCL2促進-Synuclein引起的小膠質細胞增殖和分泌TNF-、IL-1、NO的能力，對-Synuclein引起的神經元凋亡也具有促進作用，促凋亡作用機制可能與Akt信號通路有關。

小膠質細胞；神經元；CCL2；凋亡；信號通路；小鼠

小膠質細胞是中樞神經系統中的重要免疫防線，是神經膠質細胞的成員之一，在腦組織和脊髓中的作用類似于巨噬細胞[1]。腦組織中神經膠質細胞中有20%為小膠質細胞[2]。阿爾茲海默病、帕金森病等疾病中都存在小膠質細胞的過度增殖活化，而小膠質細胞的過度活化會引發神經毒性[3]。趨化因子CC配基2是趨化因子家族成員之一，由人血管內皮細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、平滑肌細胞等多種細胞分泌，具有調控巨噬細胞趨化、激活嗜堿性粒細胞、參與細胞增殖凋亡過程等作用[4-5]。-Synuclein是一種廣泛存在于腦組織中的神經蛋白，在維持突觸功能中發揮重要作用[6]。-Synuclein的過度聚集會導致路易小體功能障礙，引發學習記憶等功能缺失[7]。有研究表明，CCL2能夠促進小膠質細胞的增殖，促進炎癥因子分泌，進而導致-Synuclein的過度聚集產生毒性[8]。本研究以小膠質細胞為研究對象，探討CCL2在-Synuclein介導的小膠質細胞增殖和神經元凋亡中的作用，以期為治療神經系統疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1．1材料

1．1．1 實驗動物：出生24 h以內的SPF C57/BL6小鼠購自于新鄉醫學院動物實驗中心。

1．1．2 主要儀器及試劑：DMEM/F12培養基、胰蛋白酶均購自于美國Sigma；胎牛血清(FBS)購自于美國 Gibco；雙抗購自于北京鼎國生物技術有限公司；HERAcell 150i CO2培養箱、MK3酶標儀均購自于美國Thermo；-Synuclein單克隆抗體、Cleaved Caspase-3單克隆抗體、Akt單克隆抗體、p-Akt單克隆抗體均購自于美國R&D；BCA Protein Quantification Kit購自于上海翊圣生物科技有限公司；TNF-、IL-1檢測試劑盒購自于上海百蕊生物科技有限公司；NO含量檢測試劑盒購自于北京普利萊(APPLYGEN)基因技術有限責任公司。

1．2方法

1．2．1 小膠質細胞和神經元原代分離培養：參照參考文獻[9]取出生24 h以內的小鼠(小鼠數量根據每次試驗需求數量不同)，用75%酒精消毒后，取出腦組織，將血管剝離，放在DMEM/F12培養基中，剪碎后，加入0.125%的胰蛋白酶10 mL，放在37 ℃的水浴鍋中震蕩消化反應5 min，加入胎牛血清終止消化，放在室溫下靜置3 min，觀察組織沉淀到下層，吸取上清液至EP管中，過70 μm的網篩，濾液經1 000 rpm離心10 min后，棄掉上清液，加入含有15% FBS，100 U/mL雙抗的DMEM/F12細胞培養液，種植到用賴氨酸提前包被的細胞培養瓶中，放在37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h后，更換細胞培養液。培養10 d后，小膠質細胞位于上層，下層細胞為神經元。取細胞瓶震蕩培養60 min，吸除培養基，加入PBS洗滌細胞后，收集洗滌下來的細胞，接種到6孔細胞培養板中，每孔中加入3×105個細胞，培養30 min后，貼壁細胞為小膠質細胞，培養5 d后，可以收集原代小膠質細胞。

1．2．2 實驗分組：細胞實驗分為3組，依次為對照組、CCL2組、-Synuclein組和CCL2+-Synuclein組。對照組中加入等量的PBS，CCL2組細胞中加入含有CCL2濃度為0.05 ng/μL的培養液。-Synuclein組細胞中加入含有-Synuclein濃度為0.2 ng/μL的培養液。CCL2+-Synuclein組中加入含有0.05 ng/μL CCL2、0.2 ng/μL-Synuclein的細胞培養液。

1．2．3 MTT檢測細胞增殖：將震蕩后洗滌下來的細胞接種到96孔細胞培養板中，每孔中加入100 μL的細胞懸浮液，貼壁后，放在37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h。按照1.2.2實驗分組更換細胞培養液培養24 h后，在每孔中加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，放在 CO2培養箱中孵育4 h，加入150 μL的DMSO溶液，震蕩反應10 min后，酶標儀檢測450 nm每孔的吸光度。

1．2．4 Griess法檢測NO含量：NO在水中可以生成NO2-，而在酸性環境中，NO2-能夠與重氮鹽磺胺生成重氮化合物，并與萘基乙烯二胺偶合。反應生成的化合物越多在540 nm處的吸光度越多，吸光度越高則NO含量越高。取各組細胞，按照1.2.2實驗分組培養細胞24 h。按照NO含量檢測試劑盒說明書檢測細胞培養液中NO含量。

1．2．7 原代神經元培養：原代神經元培養方法參照1.2.1中小膠質細胞分離培養方法，過篩后，濾液經離心后，用含有10% FBS、2% B27、100 U/mL雙抗的DMEM/F12細胞培養液懸浮細胞，接種至賴氨酸包被的細胞瓶中，24 h后更換為不含有胎牛血清的細胞培養培養細胞。分離培養后3 d即可獲得原代神經元。

1．2．8 流式細胞儀檢測凋亡：取各組細胞，按照1.2.2實驗分組培養小膠質細胞24 h。吸取細胞培養液，加入到神經元中培養24 h，棄培養液，加入0.125%的胰蛋白酶消化后，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS洗滌一次，加Binding buffer懸浮混勻，調整濃度為3×106個/mL，每100 μL的懸浮液中加入5 μL的 Annexin V和PI，放在室溫條件下反應10 min，流式細胞儀檢測凋亡情況。

1．2．9．Western blot檢測神經元中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt水平：取各組細胞，按照1.2.2實驗分組培養小膠質細胞24 h。吸取細胞培養液，加入到神經元中培養24 h，棄培養液，收集神經元蛋白，Western blot檢測神經元中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt水平，步驟同1．2．6。

2 結果

2．1細胞增殖檢測結果分離培養的小膠質細胞經CCL2、-Synuclein、CCL2+-Synuclein作用后，MTT檢測細胞增殖情況。結果顯示，-Synuclein組細胞增殖能力顯著高于對照組，差異顯著(P<0.05)。CCL2組和CCL2+-Synuclein組細胞增殖能力明顯高于對照組，差異顯著(P<0.01)。見圖1。

注：1：對照組；2：CCL2組；3：-Synuclein組；4：CCL2+-Synuclein組；*P<0.05 vs 對照組；**P<0.01 vs 對照組圖1 小膠質細胞細胞增殖檢測結果

2．2 NO含量及TNF-、IL-1檢測結果取培養24 h的各組細胞培養液，檢測上清液中NO含量及 TNF-、IL-1水平。結果發現，CCL2組、-Synuclein組、CCL2+-Synuclein組細胞中NO水平均明顯高于對照組，差異顯著(P<0.01)。CCL2組、-Synuclein組細胞中TNF-、IL-1水平明顯高于對照組，差異顯著(P<0.05)。CCL2+-Synuclein組細胞中TNF-、IL-1水平明顯高于對照組，差異顯著(P<0.01)。見圖2。

注：1：對照組；2：CCL2組；3：-Synuclein組；4：CCL2+-Synuclein組；A：NO含量；B：TNF-含量；C：IL-1含量；*P<0.05 vs 對照組；**P<0.01 vs 對照組圖2 NO含量及 TNF-、IL-1檢測結果

2．3細胞中-Synuclein水平檢測結果取培養24 h后的各組細胞，提取細胞總蛋白，Western blot檢測細胞中-Synuclein水平。結果顯示，CCL2組和CCL2+-Synuclein組細胞中-Synuclein水平均明顯高于對照組，差異顯著(P<0.01)。見圖3。

注：1：對照組；2：CCL2組；3：-Synuclein組；4：CCL2+-Synuclein組；A：Western blot結果圖；B：蛋白相對表達水平；**P<0.01 vs 對照組圖3 細胞中-Synuclein水平檢測結果

2．4神經元凋亡檢測結果各組細胞培養24 h后，將小膠質細胞培養液加入到神經元中，流式細胞術檢測24 h細胞凋亡情況，Western blot檢測24 h神經元中Cleaved Caspase-3蛋白水平。結果顯示，CCL2組、-Synuclein組和CCL2+-Synuclein組凋亡率均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。CCL2組、-Synuclein組和CCL2+-Synuclein組中Cleaved Caspase-3蛋白水平均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

注：1：對照組；2：CCL2組；3：-Synuclein組；4：CCL2+-Synuclein組；A：流式細胞儀結果圖；B：凋亡率；C：Western blot結果圖；D：蛋白相對表達水平；**P<0.01 vs 對照組圖4 神經元凋亡檢測結果

2．5細胞中Akt、p-Akt水平檢測結果各組細胞培養24 h后，將小膠質細胞培養液加入到神經元中，Western blot檢測24 h細胞中Akt、p-Akt蛋白水平。結果顯示，CCL2組、-Synuclein組、CCL2+-Synuclein組細胞中Akt水平與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。CCL2組、-Synuclein組和CCL2+-Synuclein組細胞中p-Akt蛋白水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

注：1：對照組；2：CCL2組；3：-Synuclein組；4：CCL2+-Synuclein組；A：Western blot結果圖；B：蛋白相對表達水平；#P>0.05 vs 對照組；**P<0.01 vs 對照組圖5 細胞中Akt、p-Akt水平檢測結果

3 討論

小膠質細胞起源于神經外胚層，當神經中樞系統受到損害時，小膠質細胞能夠吞噬清除神經系統內的有害物質[10]。在成熟的腦組織中，小膠質細胞處于靜止狀態，能夠感受周圍環境中的異常病理變化。小膠質細胞能夠促進神經元的增殖，保護大腦的組織結構。小膠質細胞活化后能夠分泌多種免疫因子及NO[11]。而NO一方面具有殺死病原菌的作用，另一方面對神經元具有一定的毒性作用。有研究表明[12]，神經性退變相關疾病中小膠質細胞異?；罨?，產生炎癥因子，而這些炎癥因子對神經系統具有一定的毒性。

CCL2是一種單核細胞趨化因子。近年來的研究表明，CCL2在神經退行性相關疾病患者的外周血和腦脊液表達升高，而抑制CCL2表達的小膠質細胞活性減弱，生物機體認知功能有所恢復[18-19]。CCL2還參與中樞神經系統的炎癥反應，與生物體內NO含量和氧自由基水平有關[20]。之前的研究結果表明0.05 ng/μL的CCL2能夠明顯促進小膠質細胞的增殖[21-22]。本研究中用0.05 ng/μL的CCL2蛋白處理小膠質細胞，結果發現，CCL2能夠促進小膠質細胞的增殖，對細胞分泌NO、TNF-、IL-1也具有一定的促進作用。

為了進一步研究CCL2對神經元的作用，本研究通過體外培養原代神經元，并用CCL2和-Synuclein處理后的小膠質細胞培養液培養原代神經元，結果發現，CCL2和-Synuclein刺激后的小膠質細胞培養液都能夠促進神經元凋亡。而CCL2和-Synuclein共同作用后的神經元凋亡更多。進一步檢測神經元中促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Akt信號通路相關蛋白表達水平，結果發現Cleaved Caspase-3蛋白增多，而磷酸化的Akt減弱，這提示，CCL2促進-Synuclein誘導的小膠質細胞增殖導致的神經元凋亡增多與可能與Akt信號通路有關。

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StudyontheeffectofCCL2ontheproliferationofmicrogliaandapoptosisofNeuroninducedby-Synuclein

ZHANGLijun，ZHAOPanpan，ZHAOJianhua，WANGChaowei，LIQing，SUIRuibin，YUANBin

DepartmentofNeurology，XinxiangMedicalCollege，Xinxiang453100，China

ObjectiveTo investigate the effects of CCL2 on the proliferation of microglia and apoptosis of Neuron induced by-Synuclein．MethodsPrimary microglia and primary neurons were isolated and cultured in vitro．The microglia were divided into 4 groups，which were the control group，the CCL2 group，the-Synuclein group，the CCL2+-Synuclein group．In the control group，the amount of PBS was added，and the cells in the CCL2 group were added with the culture solution containing 0.05ng/μL concentration of CCL2.-Synuclein group cells were added to culture medium containing a 0.2ng/μL concentration of-Synuclein．CCL2+-Synuclein group were added with CCL2 0.05ng/μL，0.2ng/μL-Synuclein．After 24h culture，the proliferation of microglia and the level of-Synuclein，the contents of TNF-，IL-1and NO in cell culture medium were detected．The primary neurons were cultured with cell culture medium in each group，the neuron apoptosis was observed and the levels of Cleaved Caspase-3 Akt，p-Akt and were observed．ResultsThe proliferation activity and secretion of TNF-，IL-1，NO in the CCL2 group，the-Synuclein group，the CCL2+-Synuclein group were significantly higher than that in control group (P<0.05)．The level of-Synuclein in CCL2 group and CCL2+-Synuclein group was significantly higher than that in control group (P<0.01)．The apoptosis rate and Cleaved Caspase-3 protein level of CCL2 group，-Synuclein group and CCL2+-Synuclein group were significantly higher than those in control group，the level of p-Akt was lower than that of control group (P<0.01)．ConclusionCCL2 promotes the proliferation of the microglia and secretion of TNF-，IL-1，NO induced by-Synuclein，and can promotes the apoptosis of neuron，the mechanism may be related to Akt signaling pathway．

Microglia；Neuron；CCL2；Apoptosis；Signal pathway；Rat

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.24.002

河南省科技廳科技攻關項目，編號：172102310685

△通信作者：袁彬(1972—)，博士，主任醫師。研究方向：腦血管病基礎與臨床。Email：smith20081558@163.com

R-332

A

1673-5110(2017)24-0007-06

(收稿2017-03-17)

王喜梅

信息：張黎軍，趙盼盼，趙建華，等．趨化因子CC配基2對-Synuclein誘導的小膠質細胞增殖及神經元凋亡的影響研究[J]．中國實用神經疾病雜志，2017，20(24)：7-12．