注射劑中熱原在線檢測(cè)儀及應(yīng)用

李存玉, 彭國(guó)平, 鄭云楓, 潘林梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 江蘇 南京 210023)

注射劑中熱原在線檢測(cè)儀及應(yīng)用

李存玉, 彭國(guó)平, 鄭云楓, 潘林梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 江蘇 南京 210023)

針對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中熱原檢測(cè)周期長(zhǎng)、不便于開(kāi)展實(shí)體教學(xué)的問(wèn)題,為了啟發(fā)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)踐能力,以學(xué)生為主體的研發(fā)小組研制一種可實(shí)現(xiàn)熱原在線監(jiān)控的裝置。該裝置基于熱原的光散射特征,在注射劑生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)密閉管路與生產(chǎn)線對(duì)接,杜絕了檢測(cè)環(huán)境中微粒懸浮物對(duì)檢測(cè)過(guò)程的污染,實(shí)現(xiàn)了熱原快速、在線、無(wú)污染檢測(cè)。該裝置的研發(fā)充分發(fā)揮了學(xué)生的潛力與創(chuàng)造性,實(shí)現(xiàn)課堂教學(xué)效果與實(shí)踐能力的雙提升。

熱原； 在線檢測(cè)； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)； 創(chuàng)新能力

中藥制藥行業(yè)中對(duì)于藥品的安全性控制尤為重視,特別是注射劑。因采用靜脈注射進(jìn)入血液,因而對(duì)引起不良反應(yīng)的有害物質(zhì)的多采用限量控制。熱原的檢測(cè)控制方法分為家兔法和動(dòng)態(tài)濁度法,家兔法是根據(jù)動(dòng)物體溫波動(dòng)評(píng)價(jià)制劑安全性,動(dòng)態(tài)濁度法是根據(jù)熱原中的主要成分細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)產(chǎn)生的量化關(guān)系進(jìn)行限量評(píng)價(jià)。兩種方法在具體的實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中均具有一定的局限性,家兔法實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)且對(duì)動(dòng)物穩(wěn)定性要求高[1],學(xué)生難以獲得有效數(shù)據(jù);動(dòng)態(tài)濁度法實(shí)驗(yàn)操作周期長(zhǎng)，試劑成本偏高,且對(duì)操作要求較高[2]。目前在中藥制藥專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)中通過(guò)虛擬仿真系統(tǒng)開(kāi)展教學(xué),但是對(duì)于學(xué)生的技能操作培養(yǎng)有所欠缺。

注射劑安全性控制中熱原的限度要求與其臨床安全性直接相關(guān),而且制劑生產(chǎn)過(guò)程中熱原污染也存在突發(fā)性、偶然性[3],因此如何實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程在線控制是提升注射劑安全性的關(guān)鍵。為了提升教學(xué)效果、鍛煉中藥制藥專業(yè)學(xué)生的自主創(chuàng)新能力,通過(guò)學(xué)生自愿申報(bào)進(jìn)入中藥制藥實(shí)驗(yàn)室課題組,由指導(dǎo)教師引導(dǎo)、學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供科研平臺(tái),開(kāi)展注射劑中熱原在線監(jiān)控裝置研發(fā)。

1 熱原

熱原(pyrogen)又稱細(xì)菌內(nèi)毒素(bacterial endotoxin),是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的脂多糖[4-5],結(jié)構(gòu)為一端是疏水的酯鏈,另一端是親水的糖鏈。類似表面活性劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使細(xì)菌內(nèi)毒素在水溶液中多以團(tuán)聚態(tài)膠體的形式存在[6],在水溶液中呈現(xiàn)出納米膠粒子的光散射特征,可通過(guò)納米粒子檢測(cè)裝置直接檢測(cè)。同時(shí),中藥制劑中成分普遍偏低,其粒徑分布與細(xì)菌內(nèi)毒素有明顯差異,通過(guò)優(yōu)選檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行區(qū)分,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素快速、在線、無(wú)污染檢測(cè),基于此常規(guī)的激光粒徑檢測(cè)設(shè)備開(kāi)展教學(xué)用熱原在線檢測(cè)裝置研制。

2 檢測(cè)原理

傳統(tǒng)的衍射和散射原理的激光粒度儀測(cè)試亞微米級(jí)范圍的顆粒,由于其散射光信號(hào)的空間分布趨于一致,其分辨率很低,如果采用偏振光、雙光源、雙鏡頭等信號(hào)的信噪比也偏低,達(dá)不到測(cè)試納米的分辨率和精度。激光照射到顆粒產(chǎn)生的散射光的強(qiáng)度因顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)而發(fā)生變化。這種光強(qiáng)與顆粒的粒徑相關(guān)。通過(guò)探測(cè)器(常用光電倍增管)在特定光學(xué)結(jié)構(gòu)下,將這一起伏漲落的光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為電信號(hào),經(jīng)自相關(guān)運(yùn)算得到相關(guān)曲線,再由專用軟件分析出平移擴(kuò)散系數(shù),最后經(jīng)Stoken-Einstein公式,計(jì)算出粒度分布[7-9]。

3 激光粒徑檢測(cè)儀改造

3.1 熱原在線檢測(cè)構(gòu)造

熱原在線檢測(cè)儀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，主要由光學(xué)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和預(yù)警系統(tǒng)組成。光學(xué)系統(tǒng)包括平行雙激光源、短焦透鏡、光柵、長(zhǎng)焦透鏡、光柵濾波器和多點(diǎn)散射光接收器；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)包括光電轉(zhuǎn)換器、信號(hào)放大器、信號(hào)處理器、數(shù)據(jù)采集器、粒子辨識(shí)及定量運(yùn)算器和數(shù)據(jù)顯示器；在線及預(yù)警系統(tǒng)包括在線流動(dòng)檢測(cè)池、超聲探頭和報(bào)警器。

圖1 熱原在線檢測(cè)儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖

3.2 技術(shù)性能

結(jié)合中藥制藥專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)的主體內(nèi)容[10],以丹參注射液生產(chǎn)線檢測(cè)為例,進(jìn)行以內(nèi)毒素在線監(jiān)測(cè)為目標(biāo)的新型內(nèi)毒素檢測(cè)儀器的樣機(jī)開(kāi)發(fā),對(duì)其性能進(jìn)行全面考察,檢驗(yàn)儀器性能與在線監(jiān)控的可行性,并設(shè)定一系列指標(biāo),以反映儀器應(yīng)用性能,保證儀器檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

3.2.1 技術(shù)性能

檢測(cè)不消耗試劑,對(duì)藥液無(wú)任何污染,可以對(duì)制劑中的內(nèi)毒素濃度實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè),并與中藥成分進(jìn)行有效區(qū)分,以及檢測(cè)微生物的污染；在3 min內(nèi)可以完成樣品取樣、檢測(cè)、結(jié)果輸出;儀器可實(shí)現(xiàn)連續(xù)檢測(cè),并通過(guò)預(yù)警曲線反映制劑中細(xì)菌內(nèi)毒素的水平,其檢測(cè)最低限度達(dá)到0.50 EU/mL,以確保制劑內(nèi)毒素含量在安全范圍之內(nèi)。

3.2.2 技術(shù)參數(shù)

適用范圍:注射用水或注射劑生產(chǎn)的在線監(jiān)控,離線快速檢測(cè),注射劑生產(chǎn)設(shè)備的潔凈度監(jiān)控、超濾膜完整性檢測(cè)等。技術(shù)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 技術(shù)參數(shù)

3.3 研制方法

3.3.1 在線檢測(cè)技術(shù)改進(jìn)

檢測(cè)池的優(yōu)化：實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)線的同步連接、監(jiān)控,增加了超聲混勻裝置,使檢測(cè)溶液均勻混合,檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確,富有代表性。根據(jù)注射劑品種設(shè)置采樣點(diǎn)間隔,關(guān)閉進(jìn)液口和出液口,使待檢測(cè)溶液呈現(xiàn)靜止?fàn)顟B(tài),對(duì)注射劑內(nèi)毒素污染狀況進(jìn)行監(jiān)控。通過(guò)在線檢測(cè)池與生產(chǎn)線的對(duì)接,實(shí)現(xiàn)對(duì)注射劑生產(chǎn)線的在線檢測(cè)(見(jiàn)圖2)。

圖2 在線檢測(cè)示意圖

3.3.2 檢測(cè)專屬性

光源采用波長(zhǎng)632.8 nm的He-Ne激光器,只選擇顆粒真正產(chǎn)生的單散射信號(hào)部分,去除干擾信號(hào),激光源在降低對(duì)樣品熱效應(yīng)的同時(shí),加大功率,并針對(duì)樣品,選擇合適的發(fā)射功率,自動(dòng)調(diào)節(jié)激光衰減；散射光接收器為光電二極管(APD)檢測(cè)器,多角度多點(diǎn)接收,暗基數(shù)小,靈敏度高,速度快,性能穩(wěn)定,通過(guò)光電二極管將散射光信號(hào)接收并轉(zhuǎn)換成電信號(hào),并配有相應(yīng)的電信號(hào)放大器。數(shù)據(jù)處理器是將光強(qiáng)轉(zhuǎn)化為電信號(hào),經(jīng)運(yùn)算得到相關(guān)曲線,再由數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算出平移擴(kuò)散系數(shù),最后經(jīng)Stokes-Einstein公式,計(jì)算出粒徑分布。

4 測(cè)定結(jié)果及可行性分析

4.1 檢測(cè)結(jié)果

對(duì)所研制的熱原在線檢測(cè)儀進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)限實(shí)驗(yàn),采用注射用水清洗檢測(cè)器的循環(huán)檢測(cè)管路以及檢測(cè)池,進(jìn)而采用臨床常用注射液——丹參滴注液為例進(jìn)行設(shè)備的功能性驗(yàn)證。以丹參滴注液為空白,并分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,配制成濃度為0.25、0.50、5.00、25.00 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素溶液進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3—圖7。

由于細(xì)菌內(nèi)毒素在溶液中是以團(tuán)聚狀態(tài)存在,其粒徑大于丹參成分的粒徑分布,而儀器的檢測(cè)原理是以溶液中顆粒的體積進(jìn)行數(shù)據(jù)模型轉(zhuǎn)換成粒徑,所以細(xì)菌內(nèi)毒素的粒徑分布強(qiáng)度將丹參滴注液中成分的粒徑分布峰掩蓋[11]。

丹參滴注液中加入細(xì)菌內(nèi)毒素后,粒徑分布峰有明顯變化,當(dāng)內(nèi)毒素濃度降低時(shí),內(nèi)毒素是以低分子量團(tuán)聚態(tài)存在,隨著濃度升高,逐步呈現(xiàn)出高分子團(tuán)聚態(tài),濃度與粒徑分布呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性,也為熱原的在線檢測(cè)提供了可行性。圖5中粒徑分布細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)限已達(dá)到0.50 EU/mL,可以滿足丹參滴注液中細(xì)菌內(nèi)毒素的限度檢測(cè)要求。

圖3 丹參滴注液粒度分布

圖4 0.25 EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素污染粒度分布

圖5 0.50 EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素污染粒度分布

圖6 5.00 EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素粒徑污染粒度分布

圖7 25.00 EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素污染粒度分布

4.2 檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性

以丹參滴注液為例,依據(jù)圖2的在線檢測(cè)裝置連接內(nèi)毒素檢測(cè)系統(tǒng)與藥液管路,對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素污染后的丹參滴注液進(jìn)行檢測(cè),測(cè)試不同污染條件下滴注液中細(xì)菌內(nèi)毒素污染特征峰分布,多次進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。在不同內(nèi)毒素污染環(huán)境下的丹參滴注液粒徑分布的D50(累計(jì)粒度分布百分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑)的RSD均低于4%,結(jié)果較穩(wěn)定,數(shù)據(jù)重現(xiàn)性好。

表2 不同內(nèi)毒素污染的丹參滴注液粒徑分布

4.3 誤差分析

研發(fā)的熱原在線檢測(cè)儀旨在拓展中藥制藥專業(yè)對(duì)注射劑生產(chǎn)過(guò)程的控制,開(kāi)發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新實(shí)踐能力。初步構(gòu)建的在線檢測(cè)系統(tǒng)不可避免地存在檢測(cè)誤差,可能導(dǎo)致誤差的原因有:檢測(cè)環(huán)境的潔凈度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,空氣中懸浮微粒的介入導(dǎo)致粒徑出現(xiàn)突發(fā)性的增長(zhǎng)；注射劑中成分的干擾,目前發(fā)現(xiàn)皂苷類成分與內(nèi)毒素的粒徑特征存在相似性,分析原因是其在溶液中因表面活性以膠束狀態(tài)存在,從而引起檢測(cè)誤差的出現(xiàn)。

5 熱原在線檢測(cè)儀器的創(chuàng)新性

(1) 新穎的檢測(cè)原理。利用激光散射檢出細(xì)菌內(nèi)毒素膠體特征而研制的內(nèi)毒素新型檢測(cè)儀,具有能快速檢測(cè)及在線檢測(cè)的優(yōu)勢(shì),彌補(bǔ)了現(xiàn)有熱原檢測(cè)技術(shù)的缺陷,可通過(guò)進(jìn)一步設(shè)備優(yōu)化實(shí)現(xiàn)注射液生產(chǎn)過(guò)程中的內(nèi)毒素在線檢測(cè),有效控制微生物在生產(chǎn)線中的污染問(wèn)題,提升注射劑安全性。

(2) 檢測(cè)過(guò)程無(wú)污染。不需要添加檢測(cè)探針,針對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素不同濃度的粒徑分布區(qū)別可以實(shí)現(xiàn)半定量檢測(cè),避免了檢測(cè)試劑的消耗。同時(shí),在生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)密閉管路與生產(chǎn)線對(duì)接,杜絕了檢測(cè)環(huán)境中微粒懸浮物對(duì)檢測(cè)過(guò)程的污染。

(3) 數(shù)據(jù)在線分析。因檢測(cè)原理不同,避免了傳統(tǒng)檢測(cè)方法需離線分析的問(wèn)題,通過(guò)與在線生產(chǎn)管路直接對(duì)接,實(shí)時(shí)分析注射劑中細(xì)菌內(nèi)毒素的污染情況,符合“藥品質(zhì)量是生產(chǎn)出來(lái)的而不是檢驗(yàn)出來(lái)的”藥品生產(chǎn)管理要求與理念,解決注射生產(chǎn)過(guò)程因微生物污染而帶來(lái)的不明不良反應(yīng)等安全性問(wèn)題。

6 創(chuàng)新實(shí)踐能力鍛煉

熱原在線檢測(cè)儀的研發(fā)是起始于滿足專業(yè)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)需求。該熱原在線檢測(cè)儀的研制成功,豐富了小組成員在物理化學(xué)專業(yè)知識(shí)，鍛煉了制藥領(lǐng)域創(chuàng)新能力,所研發(fā)的熱原在線檢測(cè)儀器通過(guò)委托加工的方式,進(jìn)行了設(shè)備組裝,并申請(qǐng)了專利保護(hù)。以此為切入點(diǎn)，參加了挑戰(zhàn)杯全國(guó)大學(xué)生課外學(xué)術(shù)作品競(jìng)賽并獲得特等獎(jiǎng),目前研發(fā)的熱原在線檢測(cè)設(shè)備已在中藥制藥專業(yè)綜合實(shí)驗(yàn)得到應(yīng)用,學(xué)生根據(jù)專業(yè)特長(zhǎng)及其個(gè)人愛(ài)好,對(duì)設(shè)備的硬件及其檢測(cè)軟件進(jìn)行了優(yōu)化。該研制以制藥過(guò)程中存在的問(wèn)題為導(dǎo)向,發(fā)揮專業(yè)特色、解決實(shí)際問(wèn)題為出發(fā)點(diǎn)的大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新能力鍛煉,不僅為現(xiàn)代大學(xué)生的培養(yǎng)提供了基礎(chǔ),也為科學(xué)合理的教學(xué)改革指引了方向[12-13]。

7 結(jié)語(yǔ)

教學(xué)用熱原在線檢測(cè)儀的研發(fā)是以解決實(shí)際生產(chǎn)中存在的技術(shù)難題為出發(fā)點(diǎn),結(jié)果快速、穩(wěn)定,不僅提高了檢測(cè)效率,而且有效提升了注射劑生產(chǎn)技術(shù)水平,保障了制劑安全性。利用該裝置多次開(kāi)展注射用水、丹參滴注液中內(nèi)毒素污染水平在線監(jiān)控,測(cè)定結(jié)果表明,誤差小于5%,結(jié)果重現(xiàn)性好。此外,通過(guò)采用經(jīng)典的鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法驗(yàn)證了結(jié)果準(zhǔn)確可靠。目前雖然中藥注射劑中皂苷類成分對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響,后續(xù)仍對(duì)針對(duì)內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)與光散射特征的相關(guān)性展開(kāi)研究,以期提升設(shè)備檢測(cè)的專屬性。

該設(shè)備滿足了中藥制藥專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求,實(shí)現(xiàn)了“從學(xué)生中來(lái)、到學(xué)生中去”的啟發(fā)式實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)備研發(fā)思路。在教學(xué)過(guò)程中,本專業(yè)前輩學(xué)長(zhǎng)的科研精神激勵(lì)學(xué)生自發(fā)地開(kāi)展實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革創(chuàng)新,實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供科研平臺(tái),從而有效促進(jìn)了學(xué)生自主研發(fā)能力,鍛煉了學(xué)生的綜合素質(zhì)。

References)

[1] 張媛,錢德明,劉群麗,等.熱原檢查實(shí)驗(yàn)次數(shù)對(duì)家兔致熱靈敏度的影響[J].中國(guó)藥事,2012,26(2):152-154.

[2] 楊勝富,覃芳,陳飛.動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定復(fù)方丹參注射液和丹參注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素[J].中藥材,2016,39(3):590-592.

[3] 支興蕾,李存玉,李紅陽(yáng),等. 含黃芩苷注射劑中突發(fā)性熱原污染的去除研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,29(6):567-571.

[4] Grisman S E, Hornick R B. Comparative pyrogenic reactivity of rabbit and man to bacterial endotoxin[J]. Proc Soc Exp Biol Med, 1969, 131(4):1154-1158.

[5] Sasaki S. Biological activity of lipopolysaccharides isolated from bacteria in human periodontal lesions[J]. Bull Tokyo Dent Coll, 1979, 20(4):159-174.

[6] Yosuke S, Reiko F, Ikuo I, et al. Removal of Endotoxin from Water by Microfiltration through a Microporous Polyethylene Hollow-Fiber Membrane[J]. Appl Environ Microbiol, 1986, 51(4):813-820.

[7] 李向召,謝康,黃志凡,等.激光粒度儀的技術(shù)發(fā)展與展望[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2009(4):146-148.

[8] 隋修武,李瑤,胡秀兵,等.激光粒度分析儀的關(guān)鍵技術(shù)及研究進(jìn)展[J].電子測(cè)量與儀器學(xué)報(bào),2016, 30(10):1449-1459.

[9] 于雙雙,杜吉,史宣.激光粒度儀光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)方法[J].紅外與激光工程,2014,43(6):1735-1739.

[10] 李存玉,彭國(guó)平.中藥制藥綜合實(shí)驗(yàn)教程的探索與建設(shè)[J].中醫(yī)教育,2015,34(4):4-7.

[11] 李存玉,支興蕾,李賀敏,等.丹參滴注液生產(chǎn)過(guò)程中的內(nèi)毒素水平監(jiān)控[J].中成藥,2014,36(11):2421-2423.

[12] 陳發(fā)堂,熊慧萍,陳東生.加強(qiáng)自制儀器的研發(fā)實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新能力的培養(yǎng)[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2009,28(2):46-47,51.

[13] 李勇軍,張海燕.大學(xué)生創(chuàng)新能力訓(xùn)練模式探索與實(shí)踐[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2014,31(11):17-19.

On-line detector for pyrogen in injection and its application

Li Cunyu, Peng Guoping, Zheng Yunfeng, Pan Linmei

(College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

In view of the problems that the detection cycle of pyrogen is long and it is difficult to carry out solid experimental teaching, and in order to enlighten the college students’ innovative awareness, a device which can realize the on-line monitoring of pyrogen is developed by the student R&D group. The device is based on the light scattering characteristics of pyrogen, and in the process of injection production, the pollution by the suspended particulate matter in the detection environment is eliminated through the connection between the sealed pipeline and the production line, and the rapid, on-line and non-pollution detection of pyrogen is realized. The R&D of the device can give full play to the students’ potential and creativity, and realize the double promotion of classroom teaching effect and practical ability.

pyrogen; on-line detection; experimental teaching; innovative ability

10.16791/j.cnki.sjg.2017.12.024

2017-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81503258)；江蘇省高等教育教改研究立項(xiàng)課題基金項(xiàng)目(2013JSJG036)；南京中醫(yī)藥大學(xué)教師教學(xué)發(fā)展課題基金項(xiàng)目(NZYJSFZ2016-05)

李存玉(1985—),男,江蘇徐州,博士,講師,研究方向?yàn)橹兴幹扑幑に囇芯?/p>

E-mail：licunyuok@163.com

彭國(guó)平(1963—),男,江蘇金壇,博士,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向?yàn)橹兴幾⑸鋭┌踩栽u(píng)價(jià)等.

E-mail：guopingpeng@126.com

R917

A

1002-4956(2017)12-0097-05