超高效合相色譜法測定火龍果果酒中游離氨基酸的含量

齊寧利，龔霄，馬麗娜，張蘇慧，龍倩倩，李積華, 2

1(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室，廣東 湛江，524001) 2(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，廣東 湛江,524001)3(華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢，430070) 4(銅仁市食品藥品檢驗所，貴州 銅仁，554300)

超高效合相色譜法測定火龍果果酒中游離氨基酸的含量

齊寧利1，龔霄2*，馬麗娜2, 3，張蘇慧2, 3，龍倩倩2, 4，李積華1, 2

1(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工質量安全風險評估實驗室，廣東 湛江，524001) 2(中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，廣東 湛江,524001)3(華中農業大學 食品科技學院，湖北 武漢，430070) 4(銅仁市食品藥品檢驗所，貴州 銅仁，554300)

建立超高效合相色譜測定食品中游離氨基酸的方法。選取Acquity UPC2Torus Diol(3.0 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱，流動相由A(超臨界二氧化碳)和B(V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1)組成，2.5 mmol/L乙酸銨作為改性劑，流速2.0 mL/min，紫外檢測器波長280 nm，補償范圍330～430 nm，背壓1 800 psi。結果表明，該方法具有良好的線性(R2= 0.999 0～0.999 8)，分離度高于1.22，檢出限和定量限范圍分別為23～57 ng/L和70～178 ng/L，線性范圍為20～400 μg/mL，加標回收率在85.6%～101.2%之間。該方法被成功用于火龍果酒樣品中游離氨基酸含量的測定，也為分析其他食品基質中游離氨基酸分布情況提供了新的方法。

超高效合相色譜(UPC2)；游離氨基酸；測定；火龍果果酒

氨基酸是一類既含氨基(—NH2)又含羧基(—COOH)的有機化合物的統稱，是構成生物體蛋白質的基本單位，也是人體必需的營養物質之一，不僅具有營養保健價值，還具有特殊的生理功效。除了作為重要的營養強化劑外，氨基酸本身也呈現酸、甜、苦、鮮味，被廣泛用于調味、增香、除臭、保鮮等諸多方面[1-3]。幾乎每類食品都含有游離氨基酸，在食品加工過程中，可以與肽、核苷酸、有機酸、糖、無機離子等形成相應的呈味活性物質，賦予每種食物獨特的風味特征[4-6]。

目前，食品中游離氨基酸含量的測定主要采用電位滴定法、茚三酮比色法、消旋光法、氨基酸分析儀法、電噴霧質譜法、色譜法等[7-10]。其中，高效液相色譜法準確度最高，應用最廣，但該方法最主要的缺點是分析時間長、分離度差、有機溶劑用量大。超高效合相色譜(UPC2)在2012年由Waters公司實現了商業化生產，它集成了超臨界流體色譜(SFC)和UPLC技術，以超臨界CO2為主要的流動相，不僅可以與極性/非極性的多種固定相聯用，還可以使用相同的質譜兼容的助溶劑，結合各種色譜柱進行溶劑梯度調控，影響色譜分離，尤其適合結構類似物，同分異構體，對映異構體和非對映體混合物的分離。具有黏度低、傳質性能好、分離效率高、運行時間縮短、綠色環保的優勢，對于確證復雜食品基質中的分析物非常有價值[11-14]。本實驗建立了超高效合相色譜同時測定火龍果果酒中多種游離氨基酸的方法，并對其系統適用性進行了初步考察，以期為氨基酸代謝組學研究提供新途徑和新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火龍果果酒(乙醇體積分數為12%)由湛江中熱科技有限公司提供。

氨基酸單標(140624-201506，純度≥98%)，中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈(色譜純)、乙酸銨(色譜純，≥99%)，美國Sigma公司；乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)、標準硼酸鹽緩沖液，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；高純二氧化碳氣體(≥99.99%)，湛江氧氣廠。

1.2 儀器與設備

超高效合相色譜儀(配有紫外檢測器),美國Waters公司；Milli-Q超純水制備系統,美國默克密理博公司；冷凍離心機，UNIVERSAL公司；旋渦振蕩器，德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

分別精確稱取0.1 g 各氨基酸標準品，用0.1 mol/L的HCl溶液準確定容至100 mL，配制成1.0 mg/L的標準儲備液，通過梯度稀釋制備質量濃度為0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/L的系列標準工作液，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 樣品前處理

取果酒樣品10 mL，1 500×g室溫下離心5 min，取上清液用0.22 μm水相膜過濾，待衍生化處理。

1.3.3 衍生化方法

參考REDRUELLO等報道的方法[15]，并做了修改。吸取490 μL標準硼酸鹽緩沖液(pH 9.0±0.1)于具塞離心管中，依次加入340 μL無水甲醇、450 μL標品或樣品、15 μL的DEEMM，旋渦振蕩30 s后超聲水浴處理30 min，然后轉移到80 ℃水浴中恒溫反應2 h，以保證過量的衍生化試劑和副產物完全降解，待反應體系冷卻至室溫后加入等體積甲醇，用0.22 μm水相膜過濾后進樣分析。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Acquity UPC2Torus Diol(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相A為CO2，B為添加2.5 mmol/L乙酸銨的甲醇和乙腈(1∶1，v/v)混合溶液；流速1.0 mL/min；進樣量2.0 μL；柱溫40 ℃；檢測波長280 nm，補償范圍330～430 nm；背壓1 800 psi；梯度洗脫：0～0.2 min 98% A，0.2～5.0 min 98%～70% A，5.0～15.0 min 70% A，15.0～17.5 min 70%～98% A。

1.3.5 系統適用性實驗

按照徐莉等[16]的方法進行線性、檢測限和定量限、靈敏度和精密度、回收率等系統適用性考察。

2 結果與分析

2.1 色譜柱篩選

色譜的分離效果很大程度上取決于色譜填料及其鍵合方式[12]。本實驗選擇Acquity UPC2BEH (3.0 mm×100 mm，1.7 μm)、HSS C18SB(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)、Torus Diol(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)和Torus PIC(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)四款UPC2色譜柱，以選擇性、分離度為主要指標進行篩查，結果見圖1。

圖1 不同色譜柱分離氨基酸混標衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of amino acid derivatives separated with different chromatography columns

色譜柱Acquity UPC2Torus Diol填料為高密度二醇，其表面鍵合相的色譜性能與傳統的未鍵合硅膠固定相相當，可以有效改善酸性或堿性化合物分離過程中的整體穩定性。由圖1可知，Torus Diol色譜柱能夠將多數氨基酸衍生物有效分離，具有較好選擇性。

2.2 改性劑的選擇

氨基酸是一類含有堿性氨基和酸性羧基的有機物，在水溶液中通常以兼性離子或偶極離子的形式存在，表現出典型的兩性電解質特征。改變流動相pH環境會影響氨基酸衍生物的電離特性，進而有助于改善峰形[16]。

本實驗選擇三氟乙酸或乙酸銨作為改性劑，以考察改性劑對氨基酸衍生物峰形的影響。結果發現乙酸銨對氨基酸衍生物的拖尾峰形有較好的改善，圖2分別為添加改性劑前后氨基酸標品衍生物的色譜圖。鑒于乙酸銨本身是一種強電解質鹽，容易對超臨界系統造成影響，輕則損傷色譜柱、降低柱效，重則堵塞系統管路、引起壓力激烈波動，故將2.5 mmol/L的乙酸銨作為改性劑。

圖2 添加改性劑分離氨基酸標品衍生物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of amino acid derivatives separated with or without mobile phase modifier

2.3 助溶劑選擇

超臨界流體色譜是以超臨界CO2為主體，以少量甲醇、乙腈或異丙醇等有機溶劑為助溶劑，通過調整流動相的極性改變對分析物的溶解性，進而達到改變目標物洗脫順序和優化分離效果的目的[17]。本實驗比較了甲醇、乙腈、甲醇和乙腈混合溶液等作為助溶劑對氨基酸衍生物的分離效果。

由圖3可以看出，在助溶劑甲醇中加入等體積乙腈，極性相對降低，流動相的溶解能力也得到相應改變，部分氨基酸衍生物的保留變弱，出峰時間推遲，使得部分氨基酸衍生物之間的分離效果提高。雖然超臨界流體系統中采用的助溶劑比例不高，但對目標化合物的保留強度即出峰時間快慢有著重要影響，這對于超臨界流體色譜方法開發、色譜條件優化具有非常重要的意義。

圖3 不同助溶劑分離的氨基酸衍生物標品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of amino acid derivatives separated with different co-solvents

2.4 其他色譜條件優化

超高效合相色譜技術結合了亞2 μm填料和高效超臨界流色譜兩項技術的優點，具有較高的擴散系數和傳質速率，分析時間更短，分離效能更高。由于溫度、壓力和流速的微小變化都能引起流動相密度改變，進而改變對分析物的溶解能力，所以調節柱溫、自動調節備壓都可以調節目標化合物的分離效果[16-17]。本實驗考察了自動調節背壓(1 500～2 200 psi)、柱溫(30～60 ℃)和流速(1.0～3.0 mL/min)對樣品中目標峰峰形及分離效果、色譜柱壓力及系統壓力、分析時間的影響。為保證系統安全，盡可能實現不同種類氨基酸衍生物及其與樣品雜質的良好分離，優化后色譜條件為：背壓1 800 psi，柱溫50 ℃，流速2.0 mL/min，結果見圖3。需要強調的是，與色譜柱、助溶劑及改性劑相比，這些色譜條件對目標物分離不起關鍵作用，且它們之間相互影響，在實際方法開發過程中應予以考慮。

2.5 線性、檢測限和定量限、靈敏度和精密度、回收率

選取1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL的氨基酸標準溶液，按照1.2.3方法進行衍生化，考察線性、檢測限和定量限、靈敏度和精密度、回收率等指標[18-19]。在上述優化后的色譜條件下進行測定，根據氨基酸單標衍生物的保留時間進行定性(如圖4A所示)。以氨基酸衍生物質量濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程，線性范圍在20～400 μg/mL；根據信噪比(S/N=9)計算出氨基酸的檢出限在23～57 ng/L，定量限在70～178 ng/L；通過加標(添加水平分別為0.5、0.2、0.05 mg/mL)回收實驗得到加標回收率在85.6%～101.2%之間，相對標準偏差0.48%～1.36%，結果見表1。由表1可知，該方法分離效果好(R=1.22～21.38)、靈敏度和精密度高，準確性和再現性好。

1-亮氨酸；2-異亮氨酸；3-纈氨酸；4-丙氨酸；5-蛋氨酸；6-甘氨酸；7-苯丙氨酸;8-脯氨酸;9-絲氨酸; 10-酪氨酸;11-谷氨酸;12- 組氨酸;13-天冬氨酸;14-賴氨酸;15-精氨酸;16-半胱氨酸)圖4 氨基酸標品(A)和樣品(B)中氨基酸衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatogram of the derivatives of standard amino acids (A) and selected sample (B)

表1 氨基酸的線性、靈敏度、精密度及回收率Table 1 Linear ranges,sensitivity,precision and recovery of standard amino acids

注：x，氨基酸的質量濃度(μg/mL)；y，氨基酸積分峰面積；1)檢出限(ng/L)：信噪比(S/N)為3；2)定量限(ng/L)：信噪比(S/N)為10。

2.6 樣品分析

取紅心火龍果酒1 mL，按照1.2.3方法進行衍生化，用0.22 μm水相膜過濾，利用優化后的色譜條件進樣測定，色譜圖如圖4B所示。

火龍果酒中游離氨基酸含量見表2。由表2可知，火龍果酒中的主要氨基酸有組氨酸(12.17 mg/L)、酪氨酸(5.02 mg/L)、絲氨酸(4.37 mg/L)、蛋氨酸(3.85 mg/L)、甘氨酸(3.76 mg/L)、苯丙氨酸(3.28 mg/L)和丙氨酸(3.22 mg/L)；其次為異亮氨酸(2.46 mg/L)、精氨酸(2.37 mg/L)、亮氨酸(2.03 mg/L)；此外，還有少量的賴氨酸(1.72 mg/L)，脯氨酸(1.53 mg/L)。

表2 火龍果酒樣品中游離氨基酸含量 單位：mg/LTable 2 Content of free amino acids of the selected pitaya wine

3 討論與結論

超高效合相色譜主要以超臨界CO2為主，具有黏度低、傳質性能高和分離效率好等優點。同時，助溶劑使用量大大降低，降低了運行成本并減少了對環境的污染。結合色譜柱亞 2 μm顆粒填料技術，使其在手性化合物、同分異構體、結構類似物等分析中具有明顯優勢，被公認為是一種高效液相色譜和氣相色譜的補充技術或替代技術。

前期對幾種不同試劑的衍生效果進行了比較實驗，最終選擇操作過程簡單、衍生化產物穩定的DEEME作為氨基酸柱前衍生化試劑[20-23]，建立了基于超臨界流體色譜法測定食品中多種游離氨基酸的方法，結果表明該方法具有分析時間短、準確性高、重現性好等優點。本實驗雖然針對火龍果果酒樣品進行了方法驗證，理論上對于固體及半固體食品同樣適用，只要對樣品增加必要的預處理步驟，然后采用0.1 mol/L的HCl溶液進行均質，離心取上清液即可。針對游離氨基酸含量較高的食品基質需要進行適當稀釋，必要時，也要對方法的洗脫程序進一步優化，以使目標峰和雜質峰得到有效分離。當然，進一步開展與HPLC色譜法的對比實驗也是今后研究的重要內容[24]。總之，超高效合相色譜法對分析火龍果果酒中游離氨基酸種類及含量具有重要意義[25]，也為開展傳統發酵食品加工過程中氨基酸代謝組學研究提供了新途徑和新方法。

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Determinationoffreeaminoacidsinpitayawinebyultraperformanceconvergencechromatography

QI Ning-li1,GONG Xiao2*,MA Li-na2,3,ZHANG Su-hui2,3,LONG Qian-qian2,4,LI Ji-hua1,2

1(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment on Agro-products Processing,Ministry of Agriculture,Zhanjiang 524001,China) 2(Agricultural Products Processing Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524001,China) 3(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China) 4(Tongren Institute for Food and Drug Control,Tongren 554300,China)

A new method based on ultra performance convergence chromatography (UPC2) was developed for analysis of free amino acids in fruit wine.They were separated on an Acquity UPC2Torus Diol (3.0 mm×100 mm,1.7 μm) with a mobile phase consisted of supercritical CO2and methanol ∶acetonitrile (1∶1v/v,with 2.5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase modifier).The flow rate was 2.0 mL/min and DAD detection was set at 280 nm with a compensation range of 330-430 nm.Back pressure was 1 800 psi.The results showed good linearity (R2=0.999 0-0.999 8) and high resolution (>1.22).The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) ranged from 23-57 ng/L and 70-178 ng/L,respectively.The linear range was between 20 and 400 μg/mL.The spiked recoveries were ranged from 85.6% to 101.12%.It was applied for the free amino acids analysis of selected pitaya wine,which could also provide a new method for the analysis of free amino acid distribution in other food matrix from different sources.

ultra performance convergence chromatography (UPC2); free amino acids; determination; pitaya wine

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015034

講師(龔霄副教授為通訊作者，E-mail:yiyesuifeng@126.com)。

中國熱帶農業科學院基本科研業務費專項資金(1630122017021);湛江市科技計劃項目(2016A03012);農業部公益性行業(農業)科研專項(201303077)

2017-06-26，改回日期：2017-08-30