自組裝雙親短肽氨基酸組成及連接肽對其融合酶表達量的影響

趙偉欣，劉松，劉立明，陳堅，堵國成

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

自組裝雙親短肽氨基酸組成及連接肽對其融合酶表達量的影響

趙偉欣1,2，劉松1,2，劉立明3*，陳堅1,2，堵國成1,2

1(江南大學，工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

自組裝雙親短肽(self-assembling amphipathic peptides，SAPs)是一類親疏水氨基酸按一定規律分布，具有自聚合效應的氨基酸短肽，融合在酶蛋白N端時，具有促進表達和穩定化的功能。以自組裝雙親短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)為出發序列，與來源于Bacillussp.WSHB04-02 的堿性果膠酶(alkaline polygalacturonate lyase，PGL)組成的融合酶為模式蛋白，考察SAPs的氨基酸組成及SAPs融合蛋白內部連接肽(linker peptide)對PGL-SAP融合酶的表達量的影響。結果顯示，含有較弱疏水性的甘氨酸和丙氨酸殘基的PGL-S1突變體可使融合酶正常表達，其中，含有組氨酸的PGL-S1v1具有相對最高的胞外酶活，較野生型提高了9倍，較PGL-S1提高了1.5倍。連接肽方面，與剛性連接肽相比，含有柔性連接肽的融合酶具有更高的胞外酶活，含有(GGGGS)3的PGL-F-S1融合酶胞外酶活是野生型的14倍。上述結果表明，SAPs的氨基酸組成及融合蛋白之間的連接肽對PGL融合酶的表達具有重要影響。

自組裝雙親短肽；融合蛋白；連接肽；氨基酸極性；表達量；堿性果膠酶

近年來，基于蛋白質工程的融合蛋白技術已逐漸應用于多功能酶構建和酶靠近效應研究中，是目前獲得高催化效率或高表達量酶蛋白的重要且有效的方法[1]。其中，末端融合功能肽的技術對酶蛋白的催化性質或表達量的改造已取得廣泛應用[2-4]。在無酶結構信息和大量突變體篩選的條件下，能夠快速獲得正向的酶蛋白突變體，較傳統分子改造技術的效率顯著提高。融合短肽對酶熱穩定性或催化效率的影響最初由日本大阪大學URABE 教授在研究嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)中的過氧化氫酶的性質時發現[5]。此后，大阪大學KANAYA 團隊發現C-端融合嗜熱古菌(Sulfolobustokodaii)核糖核酸酶C-端七肽(IGCIILT)，可以不同程度地提高希瓦氏菌(Shewanellaoneidensis)核糖核酸酶、大腸桿菌(Escherichiacoli)核糖核酸酶和S.tokodaii脂酶的熱穩定性[2]。

由親疏水氨基酸按照一定規律分布組成的自組裝雙親短肽(self-assembling amphipathic peptides,SAPs)被LU等首次應用于脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC 1.13.11.12)的表達量及熱穩定性改造[3]。其中具有特殊電荷分布的S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)短肽最早是來源于畢赤酵母的Zuotion蛋白。其中一個重要的假設是[6]，Zuotion蛋白與單鏈結合蛋白Ssb在核糖體上共同作用于初始肽鏈或是Zuotion蛋白單獨激活ATPsae(ATP合成酶)的活性，促使Ssb與新生肽鏈結合，其中Ssb是連接新生肽鏈與核糖體連接的重要蛋白。蛋白表達過程中，蛋白質自身的穩定性對其表達量也起到關鍵作用，S1的穩定化功能也可在一定程度上提高其表達量。隨后，末端融合S1對環糊精轉移酶[7]，腈水合酶[8]、堿性淀粉酶[9]及堿性果膠酶[10]的蛋白表達量、熱穩定性及催化效率均有正向促進作用。清華大學LIN等利用與S1氨基酸組成類似的SAP(LELELKLKLELELKLK)融合在酶蛋白末端，可促進生成活性包涵體[11-12]。說明氨基酸組成對SAPs融合蛋白的分泌表達有重要影響。

研究將以易表達及酶活檢測精準方便的堿性果膠酶(PGL，E.C.4.2.2.2)[23]和綜合作用效果最好的短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)[6]組成的融合蛋白PGL-S1為模式蛋白，參照前期SAPs對PGL融合酶表達量、酶學性質及催化效率等影響[10,24]，系統地考察SAPs的氨基酸組成及連接肽的剛柔性對融合蛋白表達量的影響，為SAPs類融合蛋白的設計提供參考。其中，PGL是一種在堿性環境下具有高活性的一類果膠裂解酶，可以通過反式消去作用切斷聚乳糖醛酸的 α-1，4-糖苷鍵并釋放出不飽和的寡聚半乳糖醛酸[23]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及質粒

E．coliJM109，E．coliBL21(DE3)及含有堿性果膠酶基因的質粒pET-22b(+)/pgl及pET-22b(+)/pgl-S1均由本研究室獲得。

1.1.2 試劑

PrimeSTAR DNA高保真聚合酶、DNA片段回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA片段連接酶及大腸桿菌感受態制備試劑盒均購自于Takara(大連)公司。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和氨芐青霉素均購買于生工生物工程(上海)股份有限公司。Nu PAGE? Novex? Bis-Tris預制凝膠及所用標準蛋白購自 Life Technologies公司。堿性果膠酶底物聚半乳糖醛酸(PGA)購自于Sigma公司。其他常規試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

種子培養基：酵母粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L,葡萄糖20 g/L，pH 7.0。

發酵培養基：酵母粉 24 g/L，胰蛋白胨 12 g/L，甘油 5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L，pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 PGL-S1融合酶突變體的構建

自組裝雙親短肽S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)由非極性疏水的丙氨酸及極性親水的谷氨酸和賴氨酸組成，對其氨基酸組成進行研究，分為3個方面：疏水氨基酸突變、親水氨基酸突變和親疏水氨基酸同時改變。改造策略如表1所示。以質粒pET-22b(+)/pgl-S1為模板，以表2中引物進行PCR獲得含有PGL及S1突變體基因的DNA片段，純化回收后，經DpnⅠ快切酶將質粒模板消化后柱回收，末端磷酸化連接后轉化至E．coliBL21(DE3)中進行發酵表達。

表1 S1突變體Table 1 S1 variants

表2 S1突變基因擴增引物序列 Table 2 Oligonucleotides used for mutagenesis

1.2.2 PGL-linker-S1融合酶的構建

選用具有代表性的柔性(GGGGS)3和剛性(EAAAK)3兩種連接肽，構建融合蛋白，考察剛柔性融合酶表達量的影響。片段(GGGGS)3和(EAAAK)3由上海生工公司按照大腸桿菌密碼子偏好性合成，以質粒pET-22b(+)/pgl-S1為模板，PGL-S1-F和PGL-S1-R為引物PCR獲得DNA片段，DpnⅠ快切酶消化，純化回收后，與(GGGGS)3和(EAAAK)3片段用ClonExpressTMII試劑盒(Vazyme)進行同源重組。將上述重組質粒轉化至E．coliBL21(DE3)進行發酵表達。

1.2.3 重組菌發酵

種子培養：將重組質粒轉化獲得的重組菌單菌落接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的種子培養基中，37 ℃，220 r/min條件下培養10 h。

搖瓶發酵：以3%的接種量接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的發酵培養中，37 ℃，220 r/min條件下培養至菌濃0.6～0.8，加入終濃度為0.04 mmol/L的IPTG，于30 ℃，220 r/min條件下誘導發酵48 h。

1.2.4 堿性果膠酶的酶活測定

堿性果膠酶反應體系為：酶稀釋液 20 μL，含 0.2% PGA 的甘氨酸-NaOH 緩沖液 (0.2 mol/L，0.44 mmol/L的 CaCl2，pH 9.4)2 mL，無活性的酶液為空白對照。堿性果膠酶反應條件為：45 ℃水浴 15 min，使用 3 mL 磷酸溶液 (0.03 mol/L) 終止反應，235 nm 處測定反應物吸光度值。

單位堿性果膠酶酶活的定義為：單位時間內裂解聚半乳糖醛酸產生1 μmol 的寡聚半乳糖醛酸所用的酶量。計算方法如下：

(1)

式中：b，比色皿厚度，cm；4 600，不飽和半乳糖醛酸于235 nm處的摩爾吸光系數，L/(mol·cm)；t：酶促反應時間(在酶促反應線性范圍之內)，min。

1.2.5 堿性果膠酶的蛋白電泳分析

SDS-PAGE凝膠電泳分析，使用Life technologies公司預制膠Nu PAGE?Novex?Bis-Tris，操作步驟詳見說明書。以0.1%考馬斯亮藍R-250進行染色。

2 結果與分析

2.1 PGL-S1突變體表達質粒的構建

S1(AEAEAKAKAEAEAKAK)是一類親疏水氨基酸交替分布的含有兩親性質的短肽，能夠在水中自發組成有序的納米結構。為研究不同氨基酸組成對該類雙親短肽融合蛋白的表達量及分泌的影響，對組成S1的氨基酸進行不同類型的突變(表1)。采用PT linker(PTPPTTPTPPTTPTPT)連接自組裝雙親短肽及PGL(圖1A)。將構建得到的9種SAPs融合酶的表達質粒轉化至E．coliBL 21(DE3)中表達。

2.2 PGL-linker- S1突變體表達質粒的構建

以PGL-S1為出發菌株，選取具有代表性的柔性(GGGGS)3，剛性(EAAAK)3及PTPPTTPTPPTTPTPT三種連接肽，研究不同剛柔性的連接肽對對該類SAPs融合蛋白的表達量的影響(圖1B)。將構建得到的3種融合酶的表達質粒轉化至E．coliBL 21(DE3)中表達。

圖1 PGL-S1 融合酶突變體表達質粒的構建(A)；含有不同連接肽的PGL-S1融合酶表達質粒的構建(B)Fig.1 The plasmids construction of PGL-S1 variants(A);The plasmids construction of PGL-S1 with different linker(B)

2.3 不同氨基酸組成的S1 variants對PGL融合酶表達量的影響

將野生型PGL，PGL-S1及9種PGL-S1突變體表達菌株分別在上述條件下進行發酵，發酵液處理，測定胞外酶活，結果如圖2所示。

M-蛋白質標準相對分子質量；0-PGL；1-PGL-S1；2-PGL-S1v1；3-PGL-S1v2；4-PGL-S1v3；5-PGL-S1v4；6-PGL-S1v5；7-PGL-S1v6；8-PGL-S1v7；9-PGL-S1v8；10-PGL-S1v9圖2 PGL及其融合酶突變體胞外酶的SDS-PAGE電泳分析(A)；胞外酶活測定結果(B)Fig.2 The SDS-PAGE analysis of PGL and the fusion enzymes(A)；The crude enzyme activity analysis of PGL and the fusion enzymes(B)

結果顯示，N端融合S1后，PGL-S1的胞外酶活提高至野生型的3倍。親水的極性氨基酸方面，當將帶有正電荷的賴氨酸突變為側鏈帶有咪唑基團的帶有正電荷的組氨酸后，表達量顯著提高，PGL-S1v1的胞外酶活是PGL的10倍，PGL-S1的2.5倍。S1v2中將谷氨酸突變為側鏈更短的帶有同樣負電荷的天冬氨酸后，表達量下降至與野生型相近，但將賴氨酸突變為相似性質帶有胍基的精氨酸時，相較于PGL-S1表達量變化不明顯。在此基礎上，結合S1v2和S1v3，設計S1v4，PGL-S1v4胞外表達量相較于PGL-S1提高了0.7倍。氨基酸的疏水性對融合酶的可溶表達起決定性作用，丙氨酸替換為疏水性更強的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及苯丙氨酸后，蛋白質表達量明顯降低，但突變為甘氨酸后表達量有所增加。說明S1類自組裝雙親短肽的氨基酸組成對自組裝雙親短肽N端融合酶的蛋白表達量及胞外分泌有重要影響。

2.4 不同剛柔性的連接肽對PGL融合酶表達量的影響

為比較不同剛柔性連接肽對PGL融合酶表達量的影響，以PGL-S1為出發菌，成功構建PGL-F-S1及PGL-R-S1融合酶，分別以柔性(GGGGS)3和剛性連接肽(EAAAK)3連接。測定胞外酶活，結果如圖3所示，柔性連接肽對融合酶表達及分泌表達促進效果更為明顯，在相同發酵條件下，PGL-F-S1胞外酶活較PGL-S1提高了2.39倍，較PGL提高了近13倍。而含有剛性連接肽(EAAAK)3的PGL-R-S1的胞外酶活與PGL-S1相近。

M-蛋白質標準相對分子質量；1-PGL-S1；2-PGL-R-S1；3-PGL-F-S1圖3 含有不同連接肽的PGL融合酶胞外酶的SDS-PAGE電泳分析(A)；胞外酶活測定結果(B)Fig.3 The SDS-PAGE analysis of PGL and PGL-S1 with different linker(A); The crude enzyme activity analysis of the PGL and PGL-S1 with different linker peptide

3 討論

為提高異源蛋白的表達量，研究者通常融合較大的可溶性蛋白標簽，如麥芽糖結合蛋白[25]等，但此類蛋白由于分子量過大導致影響原始酶學性質等原因，常常需要后續處理將其除去。PFEFFER[26]等在大腸桿菌中表達目的蛋白的同時表達分子伴侶蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表達比例。但在原核生物中，分子伴侶加速或減緩蛋白質正確表達的過程往往不穩定，在缺乏組裝所需要的空間位置時，有可能產生不正確的副反應。與多種蛋白質融合技術對比[13,27]， N端融合分子量較小的自組裝雙親短肽，在無需了解酶或蛋白質結構信息的基礎上，可作為一種便捷、高效的酶蛋白改造策略。

以S1為出發短肽，研究自組裝雙親短肽的氨基酸組成對其融合酶表達量的分析，將包括S1在內的10種雙親短肽融合至PGL的N端，考察其對蛋白表達量的影響。最終確定SAPs內的疏水氨基酸組成對蛋白質表達量有重要影響，其中疏水性最小的丙氨酸和甘氨酸可以使得融合蛋白進行正常的可溶性表達。與PGL相比，PGL-S1v1胞外粗酶活提高了9倍。其中較為特殊的是，將丙氨酸替換為疏水性更強的亮氨酸后，胞內不溶部分蛋白量顯著增加，且含有一定的酶活(胞內酶活測定結果未列出)，這也與前期清華大學LIN等[11-12]的報道一致，其中S1v6(LELELKLKLELELKLK)由于具備可大量生成活性包涵體的特點，前期已被開發成可作為蛋白質純化生產的“pull-down”標簽。

連接肽作為該類融合蛋白的重要組成部分，其長度及剛柔性對SAPs與蛋白之間相互作用起到關鍵作用。研究發現，在大腸桿菌表達系統中，相較于剛性連接肽，柔性連接肽(GGGGS)n能更有效促進SAPs對PGL的分泌效果，這類沒有形成特定二級結構的能力的連接肽，在空間上一般是以無規卷曲的形式存在能增加蛋白的可溶性，抗蛋白酶降解，并能提供催化過程中蛋白所需的柔性空間，使各個結構域不相互干擾，因此得到非常廣泛的應用[28-29]。且前期研究表明，對(GGGGS)n連接肽進行密碼子優化后，在大腸桿菌中表達量可大幅度提高[16]，這也與本研究結果相符。相同長度剛性(EAAAK)n系列連接肽與PT linker具有相近的結果，其中(EAAAK)n類連接肽自身能夠形成α螺旋[30]，能有效隔開兩個結構域，在中間形成相對穩定的二級結構，從而在一定程度上減少蛋白酶攻擊的可能性，這對真核表達體系的SAPs的融合酶尤為重要。

氨基酸的組成及連接肽的屬性對該類融合酶的設計仍然是個案處理(case by case)，結合實驗研究結果，與現有功能多肽的應用[31-32]及對連接肽二級結構的設計[33-34]等，為SAPs類融合酶或其他融合酶的設計提供參考。

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Analysisofthefactorsinfluencingtheexpressionofenzymesfusedwithself-assemblingamphipathicpeptides

ZHAO Wei-xin1,2,LIU Song1,2,LIU Li-ming3*,CHEN Jian1,2,DU Guo-cheng1,2

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 3(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Self-assembling amphipathic peptides (SAPs) are a kind of functional peptides,which have alternating hydrophilic and hydrophobic residues and can affect the thermal stability and catalytic properties of the fused enzymes.In this study,several SAPs fusion protein comprising S1 peptide (AEAEAKAKAEAEAKAK) derivatives andBacillussp.WSHB04-02 alkaline polygalacturonate lyase (PGL) or PGL-S1 with different linker peptides were constructed,and the effect of the linker peptides and the amino acids composition of SAPs on expression quantity the fusion enzymes were examined.The results showed that the hydrophobicity of hydrophobic amino acids make a critical contribution on the expression of PGL.The SAPs containing the weaker hydrophobic alanine and glycine residues could lead to normal expression of fusion protein.The PGL-S1v1 possessed relative high crude enzyme activity.Compared with the PGL and PGL-S1,the extracellular enzyme activity of PGL-S1v1 was increased by 9-fold and 1.5-fold,respectively.As for the linker peptides,the flexible linkers efficiently enhanced the extracellular expression of the fusion protein compared with the rigid counterparts.The crude enzyme activity of PGL-F-S1 with flexible linker peptide was increased 14-fold compared with PGL.These results suggested that the amino acids composition of SAPs and the flexibility of the linker peptides could effectively affect the expression quantity the fusion protein.

self-assembling amphipathic peptides; fusion enzymes; linker peptides; polarity of amino acid; catalytic efficiency; alkaline polygalacturonate lyase

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014923

博士研究生(劉立明教授為通訊作者，E-mail：mingll@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31401638)；江蘇省重點研發計劃社會發展項目(BE2016629)；國家自然科學基金(31771913)

2017-06-08，改回日期：2017-09-03