熒光法測定蒲公英中總黃酮的含量

高生平，吳曉紅，張雅欣，張玉婷

（1.南京工業大學浦江學院，江蘇南京211134；2.江蘇經貿職業技術學院，江蘇南京211168）

熒光法測定蒲公英中總黃酮的含量

高生平1，吳曉紅2，張雅欣1，張玉婷1

（1.南京工業大學浦江學院，江蘇南京211134；2.江蘇經貿職業技術學院，江蘇南京211168）

根據黃酮類化合物能與鋁離子形成穩定的熒光絡合物，建立一種測定蒲公英中總黃酮的新方法。用60%乙醇加熱回流提取蒲公英有效成分，以蘆丁為標樣，選擇激發波長419 nm，發射波長506 nm，采用熒光法測定蒲公英中總黃酮含量，并進行加標回收試驗。結果表明，該方法檢出限低，回收率在90%～104%之間，線性回歸方程為y=179.69x+145.13，相關系數 R2為 0.995 1。

熒光法；蒲公英；總黃酮

蒲公英是一種常見的藥食同源植物[1]。蒲公英中 除含有蛋白質、微量元素、維生素、氨基酸、礦物質外，還含有多糖、多酚、綠原酸、咖啡酸和黃酮類物質等活性成分[2-6]。蒲公英全草具有清熱解毒、利尿、緩瀉等傳統功效[5]，是常用重要中藥之一。最近研究表明，蒲公英還具有抗氧化[7]、抗炎抑菌[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10]等作用，也有研究表明蒲公英的藥用價值與其所含黃酮類物質有著極大的關系[11]，這引起了人們的關注。我國資源十分豐富，但其黃酮含量因產地不同而差別較大[12]，因此準確測定蒲公英中總黃酮含量對蒲公英的開發利用具有重要意義。

目前植物中總黃酮的測定方法主要是分光光度法[13-14]、薄層色譜法[15]和高效液相色譜法[16]，薄層色譜法常用于定性，高效液相色譜法需要所有黃酮單體的標樣才能定量測定總黃酮含量，成本高且難度大。分光光度法因其不需要復雜的儀器設備，且所需試劑便宜易得，故常被用于測定植物中的總黃酮含量。但現有研究[17-18]顯示，用硝酸鋁分光光度法測定總黃酮時，植物中綠原酸的存在可能對結果有干擾，因鄰二酚類結構與Al3+形成穩定結構，并使測定的總黃酮含量偏高。本文根據黃酮類化合物能與鋁離子形成穩定的熒光絡合物的特性，采用熒光分析法測定了蒲公英中的總黃酮含量，并考察了綠原酸對測定結果的影響，旨在準確測定蒲公英中總黃酮含量，為鑒定其質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

F-280型熒光分光光度計：天津港東科技發展股份有限公司；TGL-16型高速臺式離心機：江蘇省金壇市友聯儀器研究所；KQ-50B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA2004電子天平：上海精密儀器儀表有限公司。

1.2 材料

蘆丁標準對照品（≥98%）、綠原酸標準對照品（≥98%）、硝酸鋁、乙酸鈉、無水乙酸、無水乙醇：分析純試劑；蒲公英：自采低溫烘干后粉碎備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的制備

精密稱取蘆丁標準品20mg于100mL容量瓶中，用60%的乙醇溶解定容，濃度為200μg/mL，準確吸取此溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 分別置于 10mL 容量瓶中，加入5%的Al（NO3）3溶液1.0mL，pH=6.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液3.0mL。用60%乙醇定容，搖勻，即配成標準工作溶液。

1.3.2 樣品處理

蒲公英洗凈，自然風干后在烘箱中60℃烘12 h，粉碎機將其粉碎至粉狀，置于密封袋中備用。分別按以下3種方式處理。

1）靜置浸提：準確稱取1 g蒲公英于錐形瓶中，加入100mL 60%乙醇，保鮮膜密封24 h，離心8min取上清液。

2）超聲浸提：準確稱取1 g蒲公英于錐形瓶中，加入100mL 60%乙醇，60℃保鮮膜密封超聲2 h，離心取上清液。

3）索式提取：準確稱取1 g蒲公英于濾紙中，用細線包扎好塞進抽提筒中，加入100mL 60%乙醇，使樣品完全浸沒在乙醇中，連接好抽提各部分，接通冷凝水，溫度達到60℃時開始計時提取4 h，離心取上清液。

1.3.3 總黃酮含量測定

考慮到試驗條件對測定結果產生一定的影響，進行了緩沖溶液pH值、乙醇濃度、5%Al（NO3）3溶液加入量、靜置時間幾個單因素試驗，選擇最佳試驗條件測定總黃酮含量。

準確移取一定量的蘆丁標準溶液置于10mL的容量瓶中，加入5%Al（NO3）3溶液1.0mL、pH 6.3 HAc-NaAc緩沖溶液3.0mL，以60%的乙醇定容搖勻，靜置10min后，選擇419 nm作為激發波長，測定系列標準溶液和樣品溶液的熒光光譜，以506 nm處熒光強度對濃度作標準曲線，建立回歸方程。

2 結果與討論

2.1 試驗條件的研究

2.1.1 測定波長的確定

按試驗方法配制成標準溶液，用熒光分光光度計測定其熒光激發光譜和發射光譜，激發和發射狹縫均為20 nm，掃描速度為240 nm/min，所得激發光譜如圖1，發射光譜如圖2，可見最大激發波長與最大發射波長分別為419 nm和506 nm，故以此作為測定波長。

圖1 蘆丁標準溶液的激發光譜Fig.1 Excitation spectra of rutin standard solution

2.1.2 溶液pH值的影響

圖2 蘆丁標準溶液的發射光譜Fig.2 Emission spectra of rutin standard solution

不同酸度溶液對黃酮類化合物與鋁離子生成配合物的穩定性以及熒光強度產生影響。在6個10mL容量瓶中，按照試驗方法配制標準溶液，采用pH值分別為 3.6、3.9、4.7、4.9、5.5、6.3、6.6 的 HAc-NaAc 緩沖液，并進行熒光強度測定。如圖3所示，pH值對熒光強度的影響很大且隨著pH值的增加，熒光強度也一直在增大，pH=6.3時熒光強度達到頂點，pH=6.6時測定溶液中有沉淀出現，熒光強度降低，原因可能是黃酮類化合物在偏中性環境中與鈉鹽生成了螯合物，故試驗中選擇pH 6.3作為測定溶液的酸度。

圖3 溶液pH值對熒光強度的影響Fig.3 Effect on fluorescence intensity of pH

2.1.3 溶劑濃度的影響

選擇了提取黃酮常用的乙醇作為溶劑，主要考察乙醇和水的混合比例對體系熒光強度的影響。在7個10mL容量瓶中，按照試驗方法，分別用不同體積分數乙醇溶液定容，測定其熒光強度值，測定結果見圖4。

從圖4可以看出溶劑乙醇的體積分數對蘆丁熒光強度影響非常大，熒光強度隨乙醇體積分數的增大而變大。考慮到乙醇體積分數越大，揮發越嚴重，試驗操作中對測定產生影響也會變大，本試驗選擇了60%的乙醇溶液作為溶劑，與文獻[19]一致。

2.1.4 Al（NO3）3加入量的影響

黃酮類化合物與鋁離子可生成穩定的熒光配合物，Al（NO3）3的用量可對熒光強度有一定的影響。在7個10mL容量瓶中，按照試驗方法，分別加入5%Al（NO3）3溶液為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，配制溶液后，測定各溶液的熒光強度值，結果如圖5。

圖5Al（NO3）3加入量對熒光強度的影響Fig.5 Effect on the fluorescence intensity of adding amount of Al（NO3）3

從圖5可以看出，蘆丁熒光值先隨硝酸鋁增加而增加，超過1.0mL后開始下降，當5%Al（NO3）3溶液用量為1.0mL時熒光強度較大。本試驗選擇采用加入5%Al（NO3）3為1.0mL。

2.1.5 靜置時間的影響

將蘆丁測定溶液靜置于室內，并避免陽光直射，在不同時間測定溶液的熒光強度。由圖6可以看出，在靜置70min內熒光強度先變大后變小，但熒光強度變化不大，這說明本試驗的溶液比較穩定。考慮到試驗一致性，統一選擇熒光強度最強的時候即溶液配好10min后進行測定。

2.1.6 綠原酸的影響

圖6 靜置時間對熒光強度的影響Fig.6 Effect on fluorescence intensity of static time

蒲公英提取物中含有綠原酸，綠原酸分子結構中含有鄰二酚羥基，也可與Al3+形成配合物而發出熒光，從而使黃酮含量測定結果偏高。為了考察綠原酸對黃酮測定的影響，比較了419 nm作為激發光時蘆丁標液和樣品溶液的熒光光譜，根據圖7可以看出樣品與蘆丁標準的發射波長只相差2 nm，說明樣品中提取物發光物質與蘆丁標液基本一致。為進一步驗證綠原酸的干擾情況，在同等條件配制綠原酸溶液，用激發波長419 nm進行熒光掃描，如圖8，可以看出此激發波長下綠原酸在500 nm之后幾乎沒有熒光，20倍濃度條件下可以忽略綠原酸的干擾。

圖7 蘆丁和樣品的發射光譜Fig.7 Emission spectras of rutin and sample

圖8 綠原酸標液的發射光譜Fig.8 Emission spectra of chlorogenic acid standard solution

2.2 線性方程與檢出限

試驗結果表明，蘆丁標液的熒光強度與濃度在1.3×10-7mol/L～3.3×10-7mol/L 范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程為y=179.69x+145.13，相關系數R2為0.9951，式中：y為熒光強度；x為蘆丁的濃度，μg/mL。對空白對照液進行11次平行測定，根據公式C=3S/K（式中：C 為檢出限，mol/L；S為空白標準偏差，mol/L；K為校正曲線斜率）計算，方法的檢出限為2.4×10-7mol/L。

2.3 樣品測定與回收率

吸取0.5mL提取液在10mL容量瓶中，按照試驗方法測定出樣品中總黃酮含量，平行測定5次，測定結果見表1，說明該測定方法精密度較好，索氏提取法較靜置浸提與超聲提取法提取效果好。

表1 樣品測定結果（n=5）Table 1 Results of sample detection（n=5）

根據試驗方法處理樣品，加標做回收率試驗，試驗結果見表2，可見樣品加標回收率在90%～104%之間，說明此方法的準確度較高。

表2 樣品回收率試驗結果Table 2 Results of sample recovery test

3 結論與討論

建立了熒光法測定蒲公英中總黃酮含量的方法，分別從測定波長、溶液pH值、乙醇體積分數、Al（NO3）3加入量、放置時間、提取方法等方面考察了測定條件對測定結果的影響。試驗結果表明采用索式提取法提取黃酮效果較好；溶液酸度pH 6.3，5%Al（NO3）3加入量1.0mL，該測定方法靈敏度較高；20倍濃度綠原酸對測定結果無影響；蘆丁標液的熒光強度與蘆丁濃度（在 1.3×10-7mol/L～3.3×10-7mol/L范圍內）呈現良好的線性關系，檢出限低。本法靈敏度高，穩定性好，準確度高，可以作為測定蒲公英中總黃酮含量的參考方法。

黃酮類化合物的溶解度因它的結構和狀態的不同而不同[20]，大多數黃酮易溶于水、甲醇、乙醇等強極性溶劑，由于乙醇無毒、溶解性好，目前，針對黃酮類化合物的提取一般采用乙醇浸提的方法[21-23]，本試驗用60%乙醇作為溶劑，采用靜置浸提、超聲輔助浸提和索氏提取法3種提取方式對照，發現索氏提取法提取黃酮效果優于另外兩種，操作時注意溫度不能過高，防止黃酮類化合物被破壞。

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Determination of Total Flavonoids in Dandelion by Fluorescence Spectrometry

GAO Sheng-ping1，WU Xiao-hong2，ZHANG Ya-xin1，ZHANG Yu-ting1
（1.Nanjing Tech University Pujiang Institute，Nanjing 211134，Jiangsu，China；2.Jiangsu Vocational Institute of Commerce，Nanjing 211168，Jiangsu，China）

On the basis of flavonoids with aluminum ions to form stable fluorescent complexes，a new method for determination of total flavonoids in dandelion was established.Dandelion was heated with 60%ethanol to extract active ingredients.Rutin was selected as standard sample.The excitation wavelength was 419 nm，and the emission wavelength was 506 nm.The total flavonoids in dandelion was determined by fluorescent spectrometry and the recovery experiments were taken.The results showed that the detection limit of this method was low，the recovery was between 90%and 104%.The linear regression equation was y=179.69x+145.13.The correlation coefficient R2was 0.995 1．

fluorescence spectrometry；dandelion；total flavonoids

高生平，吳曉紅，張雅欣，等.熒光法測定蒲公英中總黃酮的含量[J].食品研究與開發，2018，39（1）：117-121

GAO Shengping，WU Xiaohong，ZHANG Yaxin，et al.Determination of Total Flavonoids in Dandelion by Fluorescence Spectrometry[J].Food Research and Development，2018，39（1）：117-121

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.023

江蘇省高校自然科學研究面上項目資助（16KJB430019）

高生平（1979—），男（漢），講師，博士，主要從事納米材料合成與食品分析。

2017-05-19