LILIC-Q/TOF對乳粉中羥脯氨酸的確證分析

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

LILIC-Q/TOF對乳粉中羥脯氨酸的確證分析

王駿，胡梅，李恒，徐大瑋，薛霞，祝建華

（山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

建立親水作用色譜-四極桿飛行時間質譜測定乳粉中羥脯氨酸的確證方法。乳粉樣品經鹽酸水解后，以HLB固相萃取柱凈化，經親水作用色譜柱分離后，使用超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜分別進行全掃描和羥脯氨酸的二級質譜掃描分析，以羥脯氨酸的色譜保留時間、母離子和碎片離子的精確質量數對其進行確證分析。方法的檢測限優于0.1mg/kg，可滿足乳粉中非法添加羥脯氨酸的確證分析要求。

親水作用色譜-四極桿/飛行時間質譜；乳粉；羥脯氨酸；確證分析

羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白特有的氨基酸，因其在彈性蛋白中含量極少，且在其他蛋白中不存在，常作為膠原蛋白的特征標記物。動物水解蛋白是一種廉價蛋白原料，是以牛皮及其制品的下腳料等經粗加工后制成的水解蛋白，部分不良廠商在乳粉中摻入廉價的水解動物蛋白來替代乳蛋白，以提高乳中蛋白的質量分數，降低成本。由于水解過程中添加重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等重金屬鹽，具有潛在的致癌和致畸作用，早在2009年就被列入我國“第二批食品中可能違法添加的非食用物質名單”。羥脯氨酸作為這類蛋白特有的氨基酸，現已被作為非法添加動物水解蛋白的檢測標記物。目前報道的羥脯氨酸的檢測方法主要有：分光光度法[1-8]、離子色譜法[9]、液相色譜法[10-18]、液相色譜-質譜法[19-21]、自動氨基酸分析儀法[22-24]等。作為禁用物質標記物的檢測，結果的定性尤為重要，而上述方法在結果的準確確證方面還有不同程度的欠缺，即便使用液相色譜-串聯四極桿質譜檢測，由于奶粉中存在母離子和子離子均相近的亮氨酸和異亮氨酸，仍可能產生假陽性結果。

液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術近年來日趨成熟，通過飛行時間質譜測定目標物和其碎片離子的精確質量數，對目標物進行定性，有助于排除假陽性結果，實現對禁用物質的確證分析。本文建立超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜確證檢測乳粉中羥脯氨酸的方法，對經氯胺-T分光光度法檢測羥脯氨酸為陽性的乳粉樣品進行了確證分析，結果表明方法準確可靠。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器與條件

Acquity UPLC超高效液相色譜儀：美國Waters公司，由二元泵、柱溫箱、自動進樣器組成；Acquity UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）：Waters公司；流動相A為乙腈，流動相B為10 mmol/L乙酸銨水溶液，梯度洗脫程序為0～4min，由85%A線性變化至75%A；4min～6min線性變化至60%A，6min～8min線性變化至85%A，流速為0.4mL/min；柱溫40℃；進樣量為10 μL。

XEVO QTOF型四極桿飛行時間質譜儀：美國Waters公司，配電噴霧電離源（ESI），帶有Masslynx 4.1和Targelynx軟件。操作參數為：電噴霧電離源正離子模式，毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓18 V，提取錐孔電壓4 V；源溫135℃，脫溶劑氣溫度450℃，脫溶劑氣流量800 L/h，錐孔氣流量50 L/h。分別采用MSE和MS/MS兩種掃描模式，MSE采集模式：低能通道碰撞能量為6 eV，高能通道碰撞能量為10 eV～30 eV，質量掃描范圍 50 amu～600 amu；MS/MS采集模式：Q1設定為單位質量分辨，母離子質量數為132.06，碰撞能量為18 eV，二級質譜掃描范圍50 amu～600 amu。采用200 pg/μL亮氨酸-腦啡肽溶液進行實時質量校正（Lockmass），參比質量為556.277 1 amu。

1.1.2 試劑和材料

羥脯氨酸標樣：中國國家標準物質中心；乙腈（色譜純）：美國 Fisher公司；乙酸銨（純度＞99%）：美國Sigma公司；鹽酸（優級純）、苯酚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為Mili-Q超純水機（美國Millipore公司）現制備；HLB固相萃取柱：200mg/6mL，美國Waters公司；0.22 μm有機相微孔濾膜：天津津滕公司；全脂乳粉6批，嬰幼兒配方乳粉5批：分別購自濟南、青島的超市。

1.2 樣品處理

稱取0.5 g乳粉樣品，精確至0.000 1 g，至20mL水解管中，加入5.00mL濃鹽酸（優級純），滴加3滴50 g/L苯酚水溶液（新蒸餾的苯酚），充氮2min，封口，在110℃水解24 h，取出冷卻，同時做空白試驗。打開水解管，經濾紙過濾到100mL容量瓶中，用超純水反復沖洗濾紙和漏斗，定容、搖勻。

取一支HLB固相萃取柱，先用3mL甲醇、3mL水活化，取水解液5mL上樣，棄去最初的2mL，收集3mL流出液于15mL離心管中，置于氮吹儀上氮吹15min，取 50 μL，加入 950 μL 乙腈混勻，經 0.22 μm有機相微孔濾膜過濾后待測。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法

乳粉樣品的水解采用了通用的氨基酸水解條件，考慮到要采用親水色譜分離、質譜檢測進行確證，還需進一步對樣品水解液進行凈化和處理。乳粉水解液為強酸性溶液，而且含有未充分水解的成分，在進行液質分析前，需去除這些干擾。羥脯氨酸在水解液中為陽離子，具有較強的極性，采用HLB固相萃取柱凈化時，會直接穿過凈化柱，而其余大分子的、極性較弱的組分則會被吸附在HLB柱中，實現羥脯氨酸與干擾組分的分離。因此本試驗采用直接穿透法，取一部分過HLB柱的水解液，再進行氮氣吹掃趕酸，使水解液中的鹽酸大部分揮發，最后以乙腈稀釋、定容。經過這樣的處理步驟，羥脯氨酸水解液得到一定程度的凈化，大量的鹽酸被除去，最終進樣的溶液也調整到適合親水色譜測定的組成，可以獲得較為理想的結果。

2.2 液相色譜條件的優化

由于羥脯氨酸的極性很強，在反相色譜柱上無法保留，難以與其他極性組分分離，無法避免整數質量相同的亮氨酸、異亮氨酸等組分的干擾，即使使用高分辨質譜也會因極強的基質效應無法分辨。羥脯氨酸具有氨基酸典型的兩性特征，在酸性介質中呈陽離子，適合使用親水作用色譜保留和分離。本試驗選用了Wa ters公司的Acquity UPLC BEH HILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）做為分析柱，以乙腈和10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相，進行梯度洗脫，結果表明羥脯氨酸峰形對稱，分析時間短，包括系統平衡在內，僅需6min即可完成一個樣品的確證分析，羥脯氨酸提取離子流圖見圖1。

2.3 質譜參數的優化

圖1 標樣（A）和陽性（B）樣品中的羥脯氨酸提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram for hydroxyproline of Standard sample（A）and positive sample（B）

將100 ng/mL的羥脯氨酸標樣溶液注入質譜儀，對質譜參數進行優化，以獲得最佳的靈敏度，同時采集確認羥脯氨酸的子離子信息。錐孔電壓和碰撞能量是質譜參數中最重要的兩個。錐孔電壓直接影響目標物的靈敏度，隨著錐孔電壓的升高，目標物響應值逐漸增強，但錐孔電壓過高可能導致羥脯氨酸分子離子在離子源內發生碰撞解離，反而影響母離子的靈敏度。經試驗，在錐孔電壓18 V、碰撞能量為6 eV時，可獲得羥脯氨酸最強的準分子離子峰。為得到更多的碎片離子，增強方法的可靠性，同時又不希望損失其準分子離子的靈敏度，采用了MSE的采集模式，即同時采集2個不同碰撞能量通道的數據，低能通道監測準分子離子，高能通道采集碎片離子的信息，相應的質譜圖見圖2、圖3。

圖2 低碰撞能量通道下獲得的羥脯氨酸質譜圖Fig.2 Mass spectrogram of hydroxyproline with a low collision energy

圖3 高碰撞能量通道下獲得的羥脯氨酸質譜圖Fig.3 Mass spectrogram of hydroxyproline with a high collision energy

經試驗優化，低能通道碰撞能量為6 eV，高能通道碰撞能量為10 eV～30 eV為較理想的條件。

2.4 高分辨質譜精確質量測定在羥脯氨酸確證中的優勢

很多嬰幼兒配方奶粉中添加了亮氨酸和異亮氨酸，它們與羥脯氨酸在電噴霧質譜中的母離子和子離子見表1。

表1 羥脯氨酸與亮氨酸、異亮氨酸監測離子精確質量數Table 1 Exact mass for the monitoring ions of hydroxyproline，leucine and isoleucine

表1數據分析可知，亮氨酸、異亮氨酸的母離子、子離子完全相同，雖與羥脯氨酸的母離子、子離子化學組成不同，但精確質量數相差均在0.05 amu以內，在單位質量分辨的四級桿等低分辨質譜[1，14，22]中無法區分，即便兩個子離子的相對豐度比與羥脯氨酸不一致，也不能完全排除假陽性的結果，無法實現對結果的確證。

本研究建立了基于高分辨質譜的方法，對母離子和子離子質量測定的精度均可達2ppm以內，在羥脯氨酸的質量數上，能區分不超過0.000 3 amu的質量差異，因此可以輕松識別羥脯氨酸與亮氨酸、異亮氨酸，從而實現對羥脯氨酸檢測結果的準確確證。

2.5 線性范圍和檢出限

在確定的試驗條件下，用陰性奶粉試樣制備空白基質提取液，配制系列不同濃度（0.005μg/mL～2μg/mL）的羥脯氨酸標準溶液進行測定，以各組分的峰面積（y）對其濃度（x，μg/mL）繪制標準曲線，線性方程為y=1 368.21x+38.2，相關系數（r）為 0.985，表明羥脯氨酸在0.005μg/mL～2μg/mL 濃度范圍內具有較好的線性關系。在空白奶粉中添加不同水平的羥脯氨酸混合標準溶液，按照本方法進行處理，當添加量為0.1mg/kg時羥脯氨酸仍可準確定性，低于此水平時，由于碎片離子[M-CO3H4]+質譜信號強度不足，因此將本方法的最低檢測限定為0.1mg/kg。由于添加羥脯氨酸的標樣進行回收率測定不能反映膠原蛋白水解的過程，考慮到本方法為定性確證的方法，所以沒有進行加標回收的試驗。

2.6 方法的應用

應用本方法測定了全脂乳粉、嬰幼兒配方乳粉等疑似陽性樣品11批，其中6批樣本經確證結果為陽性，結果見表2，陽性樣品譜圖見圖4。

表2 全脂乳粉、嬰幼兒配方乳粉樣品確證結果Table 2

圖4 MS/MS模式得到的陽性樣品中羥脯氨酸母離子和子離子提取色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram for hydroxyproline of positive sample with MS/MS mode

進一步分析樣品的配料并與生產商確認，這些產品中添加了深海魚膠原蛋白，檢出羥脯氨酸為合理結果，這也進一步表明本方法對結果的確證準確可靠。

3 結論

研究結果表明，超高效液相色譜-四極桿/飛行時間質譜測定乳粉中羥脯氨酸的方法具有操作簡單、分離效率高、定性確證準確可靠等顯著特點，是一種對乳粉中羥脯氨酸疑似結果進行準確確證的有效技術。

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Confirmatory Analysis of Hydroxyproline in Milk Powder by LILIC-Q/TOF

WANG Jun，HU Mei，LI Heng，XU Da-wei，XUE Xia，ZHU Jian-hua
（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，Shandong，China）

A confirmatory analytical method was developed for the determination of hydroxyproline in milk powder using hydrophilic interaction chromatography coupled with quadrupole-time of flight-mass spectrometry（HILIC-Q/TOF）.The samples were hydrolyzed with hydrochloric acid，and cleaned up by solid phase extraction，and the protein was precipitated with acetonitrile subsequently.After separated on an Acquity UPLC BEH HILIC column，hydroxyproline was carried out in the full scan and daughter ion scan mode.The hydroxyproline was confirmed by the retention time，accurate mass of parent ion and fragment ions，and the detection limit was better than 0.1mg/kg.The method was suitable for the confirmation of hydroxyproline in milk powder．

HILIC-Q/TOF（Hydrophilic interaction chromatography coupled with quadrupole-time of flightmass spectrometry）；milk powder；hydroxyproline；confirmatory analysis

王駿，胡梅，李恒，等.LILIC-Q/TOF對乳粉中羥脯氨酸的確證分析[J].食品研究與開發，2018，39（1）：113-117

WANG Jun，HU Mei，LI Heng，et al.Confirmatory Analysis of Hydroxyproline in Milk Powder by LILIC-Q/TOF[J].Food Research and Development，2018，39（1）：113-117

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.022

山東省重點研發計劃項目（2015GSF120018）

王駿（1972—），男（漢），研究員，學士，研究方向：食品安全分析及風險預警。

2017-03-14