核桃褐斑病病原菌的分離鑒定和發病規律的調查

楊 莉，楊雙昱，麻文建，周建華

(四川省林業科學研究院，四川 成都 610081)

核桃褐斑病病原菌的分離鑒定和發病規律的調查

楊 莉，楊雙昱，麻文建，周建華*

(四川省林業科學研究院，四川 成都 610081)

目的為了明確四川核桃褐斑病的病原菌及其發病規律。方法采用組織分離法，對四川中江核桃果園自然發病的核桃病原菌進行分離，并回接檢測分離物的致病性；結合孢子形態學、ITS序列和gdp序列分析對病原菌進行鑒定；同時對核桃褐斑病的發病規律進行了調查。結果分離得到6種真菌，回接只有菌株ZJ5能使核桃發病；孢子形態和多序列比較分析將菌株ZJ5鑒定為鏈格孢菌；調查明確了核桃褐斑病的發病規律。結論本文首次報道了四川核桃褐斑病病原菌為鏈格孢菌，并揭示了該病原菌的發病規律。

核桃；褐斑病；病原菌；發病規律

核桃(JuglansregiaLinn.)是世界四大干果之一，果實營養豐富，含有人體所需的多種微量元素，以及不飽和脂肪酸，被認為是有益于健康的食品，也是我國重要的“木本糧油”戰略樹種[1]。四川省是我國核桃生產大省，資源極其豐富，產量居全國第二。近年來四川核產業發展迅猛，全省核桃栽培面積和產量由20世紀50年代的4 600多hm2及年產606 t發展到2000年的6.5萬hm2及年產29 834.39 t[2]，到2016年底核桃種植面積已達1 300萬 hm2，而其病害發生也呈現爆發趨勢。核桃褐斑病的侵染造成核桃果實黑果、爛果、提前掉果，對核桃產業造成巨大的經濟損失，該病害是目前四川地區阻礙核桃產業發展的最重要問題。為此，本文就核桃褐斑病的病原進行分離鑒定，對該病害的發生規律進行了調查，為該病害的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離純化

樣品采集:供試植物樣品采自四川省中江縣雙龍鎮核桃園自然發病的核桃果實。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，自來水1 000 mL。

病原的分離：采用組織分離法[3],將采回的病果用自來水清洗表面，吸水紙擦干。用無菌手術刀在病健交界處取0.5 cm×0.5 cm的組織塊，浸泡于70%酒精中，表面消毒30 s，組織塊轉入5%次氯酸鈉溶液消毒1 min，無菌水沖洗3次，用無菌吸水紙吸干殘留水分，再將組織塊置于PDA平板上，28℃、12 h/12 h光照-黑暗交替培養7 d。

病原的純化：分離得到的真菌，用無菌水將菌孢子洗脫、稀釋到平均每視野只有一個孢子，在顯微鏡下直接將孢子挑取到PDA平板上，28℃、12 h/12 h光照-黑暗交替培養7 d、備用。

1.2 真菌致病性檢測

根據柯赫氏法則，將分離純化得到的真菌回接到健康的核桃果實上。核桃果實表面用酒精、無菌水清洗后晾干，用無菌打孔器把純化好的真菌打成菌餅，核桃綠皮上打孔，用無菌鑷子將真菌菌餅轉入核桃果皮圓孔內，用保鮮膜封閉接種孔，將核桃置于28℃人工氣候箱保濕培養3 d，觀察記錄發病情況。每種真菌接種三個核桃，用空白PDA培養基接種做對照。田間接種方法同室內接種方法相同。接種后發病的果實再用組織分離法進行分離培養病原菌。

1.3 病原菌孢子顯微形態的觀察

將接種發病后再分離得到的病原菌，用PDA培養基28℃、14 d遮光培養，得到的菌孢子用于顯微觀察。

1.4 病原真菌的初步鑒定

本研究選擇了ITS 和gdp (3-磷酸甘油醛脫氫酶)基因序列對分離到的致病菌株進行擴增，所需引物見表1，PCR產物克隆到pMD18后送樣測序。測序結果通過Blast比對，根據比對結果選取與研究菌株序列接近的種的代表菌株序列，用軟件Clustal X1.81與研究菌株的序列進行比對，用PAUP* 4.0 Bata10制作系統進化樹。

表1 引物

1.5 發病規律的調查

根據四川省核桃病害發生特點，在2014年2月—2015年2月，對德陽市中江縣雙龍鎮核桃果園核桃褐斑病進行病害調查。調查隨機選擇5年生以上盛果期核桃樹，在果園內隨機選取5個樣地，每個樣地大小為20 m×20 m，每樣地隨機選擇10棵核桃樹，每株樹隨機選取30個果實進行調查。在果園樹枝上懸掛野外溫度濕度記錄儀，記錄每次采樣的溫度和濕度。

2 實驗結果

2.1 核桃褐斑病癥狀

核桃褐斑病主要發生于果實，也危害葉片。發病初期，果實出現大小不均勻，形狀不規則的多個小黑點，隨著病程的推移，小黑點逐漸變大連成一片，形成較大黑斑，到發病后期，果實上的黑斑更大、凹陷，黑斑中部潮濕，大多有黑水流出，并且在黑斑上可見白色菌絲，果實提前掉落。葉片感病后，出現不規則黑色病斑，后期病斑變大，葉片掉落。該病在四川一般6月中下旬開始發病，隨著氣溫的升高和降雨的增多到8月中旬開始大量落果，造成巨大損失。

2.2 病原菌的獲得

采自四川中江雙龍鎮核桃果園自然發病的核桃樣品，通過組織分離，從形態上判斷，初步得到了6種真菌，根據菌落形態統計，類似菌株ZJ5的分離率可達70%。將6種真菌純化后，回接到核桃上，菌株ZJ5回接后表現的癥狀與自然發病表現的典型癥狀相同，在田間和室內接種均能讓核桃產生典型癥狀，如圖1，再次通過組織分離法，從發病的核桃果實上分離得到了該病原菌。而其他5種真菌接種后無明顯癥狀發生，表現和空白對照一致。

2.3 病原菌的初步鑒定

菌株ZJ5在PDA培養基上28℃，光照/黑暗(12 h/12 h)交替培養4 d后，可見白色菌落，繼續培養3 d，菌落由白色轉為灰色，菌落背面為褐色，繼續培養，最后變成深灰色，背面深褐色。該菌在PDA上培養，菌落圓形，菌絲疏松，氣生菌絲旺盛。

a.實驗室接種實驗；b.田間接種實驗；c.接種無菌PDA的對照。a. The walnut fruit inoculated with wild strain ZJ5 in laboratory experiment； b. The walnut fruit inoculated with wild strain ZJ5 in field experiment；c. The walnut fruit inoculated with a sterile PDA.圖1 核桃褐斑病病原菌致病性檢測Fig. 1 Pathogenicity assay on walnut fruit of the walnut brown spot disease pathogen

圖2 核桃褐斑病病原菌孢子的顯微形態Fig.2 Micro-morphology of the pathogenic spore of walnut brown spot disease

泳道1：Marker；泳道2：gdp基因擴增產物，大小為460 bp；泳道3：ITS序列擴增產物，大小為550 bp。lane 1, Marker; lane 2, gdp sequences of wild strain ZJ5, 460 bp; lane 3, ITS sequences of wild strain ZJ5, 550 bp.圖3 PCR擴增菌株ZJ5 ITS序列和gdp序列電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of ITS sequences and gdp sequences of wild strain ZJ5

圖4 菌株ZJ5 ITS序列和gdp序列聯合系統進化分析Fig.4 Neighbour-joining phylogenetic tree based on ITS sequences and partial gdp gene sequence of strain ZJ5

通過PCR擴增得到了ZJ5菌株的ITS序列和gdp基因序列(圖3)，聯合兩個基因進行系統進化樹分析發現該病原與鏈格孢屬的鏈格孢菌處于同一分支，ZJ5鑒定為A.alternata。(圖4)。

2.4 病原菌的侵染循環

2014年2月中旬在該果園采集干枯病葉病果，實驗室顯微觀察發現鏈格孢以分生孢子在枯死病葉病果上越冬(圖5)。3月初，從野外溫度記錄儀讀取的溫度顯示，當日間氣溫達到16℃時采回的枯枝落葉上可見孢子開始萌發侵染核桃葉片(圖6)，由此可見鏈格孢分生孢子是核桃褐斑病初侵染來源。直到6月中旬核桃果實可見黑色小病斑，實驗室分離能得到鏈格孢菌落，但此時病果病葉上極少見到鏈格孢菌的分生孢子。7月下旬8月初感病嚴重的核桃病葉病果開始掉落干枯，可在干枯掉落的病葉上檢查到鏈格孢的分生孢子(圖7)，即為再侵染來源。此后鏈格孢分生孢子不斷反復侵染核桃葉片和果實，直到秋季掉葉為止，病原又以分生孢子在干枯的病果病葉上越冬，準備來年的侵染。

圖5 病葉上越冬的鏈格孢Fig.5 The overwintering spores of Alternaria alternata on diseased leaves

圖6 開始萌發的鏈格孢Fig.6 Germinating spores of Alternaria alternate

圖7 鏈格孢再侵染來源Fig.7 The secondary source of infection Alternaria alternate

3 討論

核桃褐斑病，又稱褐色頂端壞死病，現已成為四川地區阻止核桃產業發展的瓶頸問題，但到目前為止該病害真正的病原菌還存在爭議。1999年Belisario 等首次報道了意大利和法國核桃果園中的褐色頂端壞死病[6]，但是并沒有確定引起該病害的病原，只是從該病害中分離到了鐮刀菌屬(Fusariumsp.)、鏈格孢菌屬(Alternariasp.)、枝孢菌屬(Cladosporiumsp.)、擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、炭疽菌屬(Colletotrichumsp.)的真菌各1種和核桃黃單胞菌(Xanthomonasarboricolapv.Juglandis)。Belisario等認為[7]，該病害是由幾種病菌復合侵染造成的，并且鐮刀菌屬(Fusariumsp.)真菌可能是引起該病害最主要的病原，但其他真菌與該病害的關系尚不清楚，核桃黃單胞菌(X.arboricolapv.Juglandis)則是引起細菌性黑斑病的病原，與褐色頂端壞死無關。又經過近十年的研究，Belisario發現，該病害是由鐮刀菌(Fusariumsp.)和鏈格孢菌(Alternariasp.)復合侵染造成的[8]，但是Moragrega等則認為[9-10]，核桃黃單胞菌(X.arboricolapv.Juglandis)才是核桃褐色頂端灰色病的主要病原，鐮刀菌(Fusariumsp.)可能與細菌共同作用引起核桃頂端壞死病，鏈格孢菌(Alternariasp.)則有可能是在細菌侵染造成組織壞死后產生的。在國內，2011年曲文文對山東核桃病果進行分離鑒定，得到了鏈格孢(Alternariaspp.)、成團泛菌(Pantoeaagglomerans)和核桃黃單胞菌(X.arboricolapv.juglandis)，她認為核桃褐色頂端壞死病和黑斑病(Walnut blight)是復合侵染的兩種病害，在同一果實上都能分離得到這3種病原菌[11-12]。而朱英芝等[13]報道核桃日規殼(Gnomonialeptostyla)是引起核桃褐斑病葉部病害的病原菌，盧宏林[14]等則認為核桃褐斑病是由核桃盤二孢菌(Marssoninajuglandis(Lib.)Magn.)引起的。Scotton等[15]的最新研究證明了核桃褐斑病是鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢菌(Alternariaspp.)與環境相互作用的結果，是與溫度，濕度，種植坡向等環境因素相關，而并不是單個的鐮刀菌(Fusariumsp.)或者鏈格孢菌(Alternariaspp.)侵染發生。本研究從核桃自然發病果實中分離到的能致病的菌株ZJ5被鑒定為鏈格孢屬鏈格孢菌(A.alternate)，但并未從發病果實中分離得到鐮刀菌(Fusariumsp.)、核桃黃單胞(X.arboricolapv.juglandis)、成團泛菌(P.agglomerans)、日規殼(G.leptostyla)、核桃盤二孢(M.juglandis(Lib.)Magn.)等其他可能的致病菌，并且將ZJ5菌株單獨接種核桃果實即可致病，由于本研究完成了柯赫氏法則，所以可以判斷ZJ5是核桃褐斑病的病原菌。本研究也是首次分離鑒定了四川地區核桃褐斑病的病原菌為鏈格孢菌(A.alternate)。

另外，本研究對該病害進行了發病規律的調查，該病害一年至少發生兩次侵染循環，這與曲文文報道的發病規律是一致的。這對核桃褐斑病的防治打下了基礎。

4 結論

本研究分離并鑒定了四川地區核桃褐斑病的病原菌為鏈格孢菌(A.alternate)。對核桃褐斑病的發病規律進行了調查，明確了四川地區核桃褐斑病一年兩次的侵染循環規律。

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IdentificationofPathogenofWalnutBrownSpotandInvestigationoftheDiseaseOccurrence

YANGLi,YANGShuang-yu,MAWen-jian,ZHOUJian-hua

(Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, Sichuan, China)

ObjectiveThe purpose of this study is to identify the pathogen of walnut brown spot disease and reveal its pathogenesis in Sichuan.MethodTo isolate the pathogenic bacteria through tissue separation in diseased walnut from walnut orchard in Zhongjiang of Sichuan Province, and its pathogenicity was tested by inoculation back to walnut. The isolated strain was identified by the combination of spore morphology and the multiple sequence analysis of ITS and gdp sequence. And the pathogenesis regularity of walnut brown spot disease was investigated.Result6 fungi were isolated, and just the strain ZJ5 could cause walnut brown spot disease. The strain ZJ5 was identified asAlternariaalternataaccording to the spore morphology and multiple sequence analysis. Beside, the pathogenesis regularity of walnut brown spot disease was revealed by investigation.ConclusionThis is the first report thatA.alternatais the pathogen of walnut brown spot disease in Sichuan and its pathogenesis regularity was studied.

walnut; brown spot disease; pathogen; pathogenesis regularity

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.017

2017-02-06

川中核桃褐斑病生物學特性及防治研究(ZL2014-15)

楊 莉(1982—)，女，博士研究生，主要研究植物病原微生物和生物防治細菌。E-mail：51943884@qq.com。

* 通訊作者.

S664.1

A

1001-1498(2017)06-1004-05

崔 貝)