基于便攜式熒光定量PCR儀的豬瘟病毒現場檢測方法的建立及應用

李天芝 ，于新友 ，沈志強 ，，王金良

（1．山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2．山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

基于便攜式熒光定量PCR儀的豬瘟病毒現場檢測方法的建立及應用

李天芝1，于新友1，沈志強1，2，王金良2

（1．山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2．山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

為建立豬瘟病毒疫苗株和強毒株一步法雙重熒光RT-PCR鑒別檢測方法。研究參照GenBank中豬瘟病毒疫苗株以及強毒株特異性基因序列，設計特異引物和TaqMan-MGB探針，通過優化反應條件，建立了同時檢測豬瘟病毒疫苗株和強毒株的雙重熒光RT-PCR方法，并驗證該方法的特異性、敏感性、重復性。本試驗建立的TaqMan-MGB一步法雙重熒光定量RT-PCR檢測方法可對豬瘟病毒疫苗株和野毒株進行快速鑒別診斷，為豬瘟的凈化奠定了基礎。

豬瘟病毒；疫苗株；強毒株；TaqMan-MGB；一步法；雙重熒光RT-PCR

豬瘟(CSF)又稱爛腸瘟，是由豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種重要的急性、熱性、高度接觸、致死性傳染病。臨床上主要以高熱稽留、皮膚和黏膜出現大量出血點和高死亡率為主要特征。豬瘟在世界上許多養豬國家都有不同程度的流行，即能水平傳播又能垂直傳播，給養豬業造成了嚴重的經濟損失[1]。世界動物衛生組織將其列為A類法定傳染病之一[2]，我國也將其列為一類動物疾病。

近年來，豬瘟在我國的流行特點發生改變，以隱性感染和亞病毒感染為主，臨床表現形式多樣，即有散發，又有區域性暴發，既有高死亡率的急性癥狀，又有持續感染的癥狀溫和的慢性病例，出現了所謂的“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”[3]，臨床與病理解剖上不典型[4]，同時存在著與其他病混合感染的狀況，給獸醫對豬瘟的臨床診斷工作帶來了很大的困難。我國研制的豬瘟兔化弱毒株(hog cholera lapinized virus，HCLV) 是世界公認最好的豬瘟疫苗[5]，也是我國唯一一株經批準用于生產的弱毒疫苗，能同時誘導體液免疫和細胞免疫，安全性好，免疫豬可抵抗所有品系的豬瘟強毒株的攻擊，HCLV在我國的大規模應用，對控制豬瘟起到了非常重要的作用，但HCLV能在已接種的豬體內持續存在一段時間，這會干擾實驗室對豬瘟強毒株的檢測，造成未感染免疫豬被誤殺的可能。這些都不利于豬瘟的凈化。需要建立可以準確區分豬瘟強毒和疫苗毒的敏感、特異的鑒別診斷方法。

CSFV是單股正鏈RNA病毒，基因組大小約為12.3 kb，包括5`非編碼區（5`UTR）、3`非編碼區3`UTR、中間是一個大的ORF，編碼多聚前蛋白，多聚前蛋白可裂解為12種蛋白，包括8種非結構蛋白和4種結構蛋白，其中，5`UTR、3`UTR基因序列比較保守[6]。豬瘟病毒基因組5`UTR長374 bp， 3`-UTR長242 bp，HCLV與豬瘟強毒株3`UTR的區別是HCLV基因組3`UTR有12個堿基(CTTTTTTCTTTT)的插入，HCLV與豬瘟強毒株5`UTR的區別是豬瘟強毒株5`UTR 122位點存在一個堿基A缺失，137位點一個堿基A突變為堿基G。本研究根據豬瘟病毒5`UTR基因組特點，設計了一對檢測豬瘟強毒株的引物及探針，根據豬瘟病毒3`UTR基因組特點，設計了一對檢測HCLV的引物及探針，通過優化熒光RT-PCR檢測條件，建立了能區分豬瘟病毒疫苗株與強毒株的TaqMan-MGB一步法雙重熒光RT-PCR檢測方法，為豬瘟的早期快速診斷、流行病學調查、防控和凈化工作奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

豬瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)、豬瘟病毒石門強毒株(Shimen)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV)、豬乙型腦炎病毒（JEV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室保存，臨床檢測病料為2016年10月—2017年9月采自山東省各地豬場臨床診斷為CSFV感染豬的扁桃體、淋巴結和脾臟等。

1.2 試劑和試劑盒

Taq DNA聚 合 酶、M-MLV反 轉 錄 酶、RNasin、dNTPs、pMD18-T載 體、DL2000 Marker、PrimeScript? One Step RTPCR Kit Ver.2等購自寶生物工程(大連)有限公司，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司。

1.3 引物和探針

應用DNAStar軟件對GenBank中收錄的CSFV基因組序列進行比對分析，應用生物學軟件分別設計2對引物及相應TaqMan-MGB探針，其中1對引物及相應的探針擴增豬瘟兔化弱毒疫苗毒株，引物序列為CSFV-F1：5′-GGTAACCCGGGATCTGAAC-3′和CSFV-R1：5′-ACCAGTTCTTACTCATTCAA-3′，特異性探針為P1：5′- FAM-ACACTACTTTTCTTTTTTCTTTTTTATTMGB-3′，另1對引物及相應的探針擴增豬瘟強毒株，引物序列為CSFV-F1：5′-CGACGGCCGAACTGGGCTA-3′和 CSFV-R1：5′ -TCGAACTACTGACGACTGTCCTG-3′，特異性探針為P2：5′- HEX-CAAACGGAGGGACTAGCCG-MGB-3′。

1.4 病毒核酸的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取HCLV和CSFV石門強毒株的RNA，作為模板。

1.5 熒光RT-PCR檢測方法的建立和優化

按 照 PrimeScript? OneStep RTPCR Kit Ver.2說明配置反應體系，體系 總 體 積 為 25μL：2×1 Step Buffer 12.5μL，CSFV-F1、CSFV-R1和 P1、CSFV-F2、CSFV-R2和 P2各 若 干，PrimeScript? 1 step Enzyme Mix 1.0μL，模板RNA 2μL，其余用RNase free dH2O補齊。離心數秒后，放入MyGo mini熒光定量PCR儀實時熒光定量PCR儀進行實時PCR擴增，對熒光RT-PCR的程序進行優化，同時對反應體系中的引物和探針濃度進行篩選，以獲得最低的CT值和較高的熒光強度增加值。

1.6 熒光RT-PCR的靈敏度

參照文獻[7]測定HCLV和CSFV石門強毒株TCID50。將病毒培養液進行10倍系列稀釋，各取100μL病毒稀釋液，經AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒抽提核酸后，進行熒光RT-PCR檢測，重復3次，確定最低的檢測靈敏度。

1.7 熒光RT-PCR的特異性、重復性試驗

利用建立起的熒光RT-PCR法分別對HCLV、CSFV石門強毒株、BVDV、PRRSV、JEV、PPV、PRV、PCV2進行檢測，驗證其特異性。對HCLV和CSFV石門強毒株的細胞培養液分別10倍系列稀釋，每個梯度同時重復檢測3次后，記錄CT值，然后分別計算對HCLV和CSFV石門強毒株組內檢測的變異系數。

1.8 臨床樣品檢測

用建立的雙重熒光定量RT-PCR法對從山東省各地收集的臨床疑似病料165份進行CSFV檢測，同時用常規RT-PCR法及單重熒光定量RT-PCR法進行檢測，并比較三者檢測結果。

2 結果

2.1 熒光RT–PCR反應條件的優化

優化結果表明，在25μL反應體系中，擴增效果最佳的引物和探針濃度分別為：1μL CSFV-F1(15μmol/L)，1.2μLCSFV-R1(15μmol/L)，0.8μLP1(5μmol/L)， 1 μ L C S F V-F 2(1 5 μ m o l/L)，1.5μLCSFV-R2(15μmol/L)，1μLP2(5μmol/L)優化后的反應程序如下：50 ℃反轉錄10 min，95 ℃預變性2 min，95 ℃變性 10 s，55 ℃退火 10 s，72 ℃延伸10 s(此處收集熒光)。

2.2 熒光RT-PCR的靈敏度

HCLV和CSFV石 門 強毒株細胞培養液病毒滴度分別 為 1 05.8T C I D50/1 0 0 μ L 及104.25TCID50/100μL。 當 經 典 毒 株等比稀釋到10-7，即病毒滴度稀釋到0.12TCID50/100μL時， 熒 光 RTPCR擴增結果仍為陽性，當高致病毒株等比稀釋到10-4，即病毒滴度稀釋到1.78TCID50/100μL時，熒光RTPCR擴增結果仍為陽性。

2.3 特異性檢驗

按建立方法對HCLV、CSFV石門強毒株、HCLV和CSFV石門強毒混合 毒、BVDV、PRRSV、JEV、PPV、PRV、PCV2的陽性樣品進行熒光定量RT-PCR檢測，HCLV樣品孔FAM熒光檢測出現了單一的s型擴增曲線，檢測結果說明豬瘟疫苗毒株陽性，CSFV石門強毒株樣品孔HEX熒光檢測出現了單一的s型擴增曲線，檢測結果說明豬瘟疫苗毒株陽性，HCLV和CSFV石門強毒株混合毒樣品孔FAM和HEX熒光檢測均出現了單一的s型擴增曲線，檢測結果說明豬瘟疫苗毒株和強毒株均為陽性。其余樣品孔FAM和HEX熒光檢測均沒有s型擴增曲線，表明建立的熒光RT-PCR檢測方法特異性良好。

2.4 熒光RT-PCR重復性試驗

利用建立起的熒光RT-PCR法分別對HCLV和CSFV石門強毒株的細胞培養液分別10倍系列稀釋，每個梯度同時重復檢測3次后，記錄CT值，然后分別計算對HCLV和CSFV石門強毒株組內、組間檢測的變異系數，結果樣品的Ct值批內重復性試驗CV值均小于2.0%，批間重復性試驗CV值均小于1.0%，表明本方法的重復性好（表1）。

表1 實時熒光RT-PCR的組內和組間重復性實驗結果

2.5 臨床樣品檢測

分別用建立雙重熒光定量RTPCR和普通RT-PCR方法，對臨床收集的165份疑似CSFV樣品進行檢測，并與常規RT-PCR檢測方法進行比較。雙重熒光定量RT-PCR結果顯示165份病料中有5份為CSFV疫苗毒陽性，檢出率為3%；23份CSFV強毒陽性，檢出率為13.9%；其中1份CSFV疫苗毒和強毒均為陽性。常規RT-PCR結果顯示165份病料中有4份為CSFV疫苗毒陽性，檢出率為2.4%；18份CSFV強毒陽性，檢出率為10.9%；其中1份CSFV疫苗毒和強毒均為陽性；雙重熒光定量RT-PCR與常規RTPCR符合率為96.4%。雙重熒光定量RT-PCR與單重熒光定量RT-PCR的結果相同，二者的符合率為100%。從臨床檢測結果看出，雙重熒光定量RT-PCR檢出率高于普通RT-PCR。

3 討論

根據《國家中長期動物疫病防治規劃（2012-2020）》，豬瘟已被列入其中[8]，要做到優先防治，到2020年全國所有種豬場達到凈化標準。近年來，我國已出臺一系列政策來支持開展豬瘟凈化，同時將豬瘟列入優先防治病種之一。王偉等[9]建立了鑒別檢測CSFV強毒株與疫苗株的雙重SYBR Green I實時熒光定量RTPCR方法，應用該方法對CSFV強毒和疫苗株的最低檢出量為10拷貝/μL，檢測BVDV、PRRSV、PRV、PCV-2均呈陰性，批內、批間重復試驗的變異系數均低于3%。劉俊等[10]等建立了豬瘟強毒株一步TaqMan-MGB RT-PCR診斷方法，該法能檢測5.3×102pgCSFV病毒核酸；能檢測除HCLV以外的豬瘟流行強毒株，對牛病毒性腹瀉病毒及其他多種豬常見病毒等檢測結果均為陰性。趙建軍等[11]建立能區分豬瘟強毒、疫苗弱毒的實時熒光定量RT-PCR方法，并且與BVDV、TGEV、PEDV、PRV、PCV2、PRRSV、PPV不發生反應，該方法對CSFV強毒和豬瘟弱毒疫苗RNA的最低檢出限分別為41.8拷貝/μL和81.5拷貝/μL。

傳統CSFV診斷方法主要包括病毒的分離鑒定、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金試紙條、熒光抗體試驗、常規RT-PCR、環介導等溫擴增技術、橫向流動試紙條技術、膠體檢測法等。這些方法在敏感性、特異性、時效性等方面都存在各自的不足，尤其不適于CSFV強毒感染的早期快速診斷。比如當病毒分離鑒定耗時一長、血清學方法可能會出現一定的交叉反應，且敏感性低不能早期檢測，常規RT-PCR技術不能對病毒定量，環介導等溫擴增技術易出現假陽性結果等缺點，橫向流動試紙條技術目前還不太成熟，沒有大規模推廣應用，膠體金檢測雖然方便，但敏感性太低，有時特異性不好，容易出現假陽性結果。熒光定量PCR技術經過20多年發展已經成熟，筆者以為熒光PCR檢測是當前最適合臨床應用檢測的技術，現已到了大規模推廣應用熒光PCR檢測病料樣品的最佳時期。

熒光定量PCR技術分為染料法和探針法兩種，與染料法相比探針法檢測特異性好，敏感性高，本實驗采取的是一種新型探針即TaqMan MGB探針，其優點是①探針背景的本底信號更低，使檢測結果更準確。②能顯著提高探針Tm值，因此，可以減少探針設計長度，尤其對AT富含區基因序列，設計探針更有利。③探針與模板結合的特異性更高，即使一個堿基不匹配都能正確區分。由于豬瘟疫苗毒與豬瘟強毒基因組序列差別不大，同源性96%左右，因此，TaqMan MGB探針較適用于二者的鑒別檢測。

核酸提取是PCR檢測的重要步驟，核酸提取的時間和質量對PCR檢測的總時間和檢測的效果均有重要的影響，本研究采用商品化核酸試劑提取核酸，其主要采用吸附柱式，操作簡單、快速，提取時配合小型高速離心機，半小時即能完成提取過程。筆者將經典的Triol法與該法進行比對，結果檢測結果一致，說明提取的RNA質量完全能滿足檢測要求，最重要的該法核酸提取的時間遠少于傳統的Triol法。與磁株相比的優勢是所需要的試劑少，操作簡單，試劑常溫保存即可，貯存和運輸不需要低溫，適合現場檢測。

本研究采用豬瘟病毒疫苗株和野毒株一步法雙重熒光RT-PCR鑒別檢測方法。只需在PCR反應中加入反轉錄試劑即可，無需單獨反轉錄時間，可大幅縮減反應所需的時間，可在55 min完成擴增反應，得出檢測結果。不需特定實驗室，無需電泳，至少可節省1/2的時間和費用，該法操作簡單，避免了由于多次操作及電泳而造成的污染問題，可檢測微量病毒，將人為因素對結果的印象降到最低。試驗所用的熒光定量PCR儀尺寸小，重量輕，便于攜帶，適合用于現場快速檢測，從而節省送樣的時間和樣品運送途中的損耗，進一步提高檢測的準確性，提早采取相應的防控措施，減少養殖場的經濟損失。為了更進一步滿足現場檢測的需求，筆者下一步工作中將對檢測試劑的保存方式進行優化，將所用檢測試劑配制完成后，加入凍干保護劑，并分裝到8聯管中凍干保存，常溫保存和運輸即可，使用時，只需要加入滅菌純化水和模板，即能進行擴增反應。簡化加樣步驟，避免了操作過程的污染。

本實驗建立了豬瘟病毒疫苗株和野毒株一步法雙重熒光RT-PCR鑒別檢測方法，可用于現場檢測豬瘟病毒，特異性好、靈敏度高、穩定性好，配合AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，從核酸提取到報告檢測結果僅需1.5 h，檢測速度快，操作簡便，適合現地檢測，下一步可開發組裝成試劑盒，市場前景很好，適合基層臨床豬瘟的快速診斷，從而制定相應的防治措施，使損失降到最低，也可用于精準評估和診斷母豬豬瘟病毒帶毒排毒、仔豬潛在感染情況，臍帶血中豬瘟病毒含量情況，從而為豬瘟的預警、疫苗免疫效果評估及豬瘟防控凈化工作提供有力的條件。

[1] 殷震，劉景華.動物病毒學[M]. 2版.北京：科學出版社，1997：652-664.

[2] 仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗——半個世紀的回顧[J].中國農業科學，2005，38 (8)：1675-1685.

[3] 于新友，李天芝，苗立中，等.分子生物學技術在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進展[J].豬業科學，2015，32(1)：76-78.

[4] 涂長春.豬瘟國際流行態勢、我國現狀及防制對策[J].中國農業科學，2003，36(8)：955-960.

[5] 陳鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗替代方法的研究與應用[J].中國農業科學，2013，46(1)：162-169.

[6] 張改平，何文博，王德國，等.豬瘟強毒株與兔化弱毒疫苗株的LAMP鑒別檢測[J].鄭州大學學報(理學版)，2014，46(3)：85-90.

[7] 戴志紅，蔣卉，李翠，等.用間接免疫熒光檢測方法評價豬瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究[J].中國獸藥雜志，2014，48(1)：34-37.

[8] 王長江，王琴，沙依蘭古麗，等.動物疫病凈化的基本要求和方法探討[J].中國動物檢疫，2013，30(8)：40-43.

[9] 王偉，符芳，陳欣，等.豬瘟病毒野毒株與疫苗株雙重SYBR Green I 實時熒光定量檢測方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2010，32(11) ：854-857.

[10] 劉俊，王琴，范學政，等.豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應用[J].中國農業科學，2009，42(12)：4366-4371.

[11] 趙建軍，成丹，李娜，等.豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株復合實時熒光定量 RT-PCR 鑒別方法的建立[J].中國獸醫科學，2007，37(5)：406-412.?

豬瘟耐熱凍干保護劑活疫苗免疫及檢測技術的研究與示范項目；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-08-17 )

李天芝(1985-)，女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷及防控研究.

2017-11-09）