豬瘟診斷技術

張乾義，徐 璐，孫駿翔，王 琴

（中國獸醫藥品監察所，OIE/國家豬瘟參考實驗室，北京 100081）

檢測診斷

豬瘟診斷技術

張乾義，徐 璐，孫駿翔，王 琴

（中國獸醫藥品監察所，OIE/國家豬瘟參考實驗室，北京 100081）

中國是世界生豬養殖大國，生豬年出欄量占到世界總量的48%。豬瘟在中國被列為一類動物疫病，影響著養豬業生產安全，在其他很多國家也是動物疫病防控的重點。有效防控豬瘟疫病，既是保護國內養豬業健康發展的需要，也是中國對世界養豬業發展責無旁貸的貢獻。當前，中國正處在大力發展現代畜牧業的關鍵時期，隨著集約化、規?；?、標準化養殖的加快推進，受生態環境、飼養模式、市場流通等多方面因素的影響，重大動物疫病防控新情況、新特點不斷出現，防控難度也在不斷增加。2012年5月，作為一項重要的民生工程，中國政府發布了《國家中長期動物疫病防治規劃（2012—2020年）》，這標志動物疫病防控從過去的有效控制邁入到了逐步凈化消滅的嶄新階段。診斷檢測是動物疾病防控的重要手段，準確而快速的診斷是疾病控制的前提保障。早期確診并快速清除感染豬是控制豬瘟的關鍵所在。在典型性豬瘟流行的早期，人們通過典型臨床癥狀及剖檢病理變化即可進行豬瘟的診斷。然而近30年來隨著非典型豬瘟越來越常見，僅靠臨床癥狀和病理剖檢變化已經難以對豬瘟進行確診，必須依賴實驗室分子生物學等診斷技術進行快速確診。中國獸醫藥品監察所豬瘟實驗室是OIE/國家豬瘟參考實驗室，承擔農業部下達的大量流行病學調查任務，每年獲得病原學樣本約2 000余份、血清學樣本約5 000余份，在豬瘟診斷技術方面積累了一些經驗和檢測方法。因此本文就豬瘟臨床表現、病理剖檢、實驗室診斷3個方面展開對豬瘟診斷技術的概述。

1 臨床表現

豬瘟的臨診癥狀和死后病變，因毒株、宿主因素不同和病程長短有很大差異。在臨床上根據病情、病毒的毒力、病程長短、臨床癥狀和感染時期（出生前或出生后）表現不同，可將豬瘟分為最急性型、急性型、亞急性型、慢性型、持續感染型5種類型。最急性型豬瘟病程一般為1～6 d，突然發病，全身痙攣，四肢抽搐，皮膚和黏膜發紺，倒臥，很快死亡；急性型病程一般為6～20 d、亞急性型為21～30 d，二者在臨床上并沒有太大的癥狀區分，主要表現是高稽留熱常超過40 ℃，腹部皮下、鼻鏡、耳尖、四肢內側均可出現紫色或大小不等的出血斑點，指壓不褪色，眼結膜和口腔黏膜可見出血點，早期有結膜炎，眼睛內有多量淡黃色的濃性分泌物，食欲下降，精神沉郁，瀕死期呈犬坐姿勢（見圖1和2）。

慢性豬瘟多發生于老疫區或接種豬瘟疫苗但免疫水平不高的豬群，病程通常在一個月以上，繼發感染嚴重，病豬食欲減退或食欲時好時壞；體溫有時正?；虺霈F周期性發熱；便秘與腹瀉交替發生，病豬腹瀉時間較長則出現毛色粗亂，生長停滯，貧血，日益消瘦。皮膚呈現紫色出血斑、丘疹或壞死，以耳尖壞死最為明顯。病豬難以完全康復，常成為僵豬。

持續感染型是目前引起豬瘟流行的最主要原因之一。感染豬本身無任何臨床癥狀，死亡率低，但長期帶毒和排毒，母豬可正常返情，但久配不孕，并發展成繁殖障礙“帶毒母豬綜合征”，產木乃伊胎、死胎、畸形胎，出現新生仔豬顫抖病。國家豬瘟參考實驗室的研究人員進行了人工豬瘟病毒持續感染動物模型的建立和研究，發現懷孕母豬可連續帶毒750 d，母豬可正常返情，但久配不孕（《豬瘟》王琴、涂長春主編，中國農業出版社）。持續感染性豬瘟給我國養豬業帶來的危害極大，“健康”的先天性病毒感染的帶毒仔豬均不能消除體內的病毒，產生免疫耐受，疫苗免疫之后不產生抗體導致免疫失敗。帶毒仔豬如果逃避病原監測而進入后備豬群體，經水平傳播不斷排向外界，引起易感豬感染、發病和死亡并污染環境，導致在一個豬群內病毒持續存在，難以清除帶毒仔豬進入后備豬群體成為種豬，形成惡性循環，成為主要的傳染來源，這是目前對我國規模豬場養豬業危害最大的感染形式。

2 病理剖檢

急性亞急性的病理剖檢結果相似，脾的邊緣或脾體表面可見從粟粒至黃豆大、數目不等的紫紅色或紫黑色出血性梗死灶。梗死灶組織堅實、表面稍凸出于周圍正常組織，切面呈楔形，其檢出率約占總病例的30%～40%，見圖3。腎臟病變明顯，表現為顏色淡，有時呈土黃色，有針尖大至米粒大出血點，量少時出血點稀疏散甚至只有少數幾個，量多時密布整個腎臟表面，如麻雀蛋外觀，見圖4。

圖1 全身出現紫色或大小不等的出血斑點

圖2 瀕死期病豬呈犬坐姿勢

圖3 脾邊緣出血性梗死

圖4 腎臟點狀出血

全身淋巴結病變具有一定的特征性，幾乎全身淋巴結都有出血性病變。主要表現淋巴結出血、腫脹，表面呈深紅色至紫黑色，見圖5。切面呈紅白相間的大理石狀外觀，這是因為淋巴竇內積聚血液，而其余淋巴組織呈灰白色，兩者相互鑲嵌形成大理石樣花紋，見圖6。在頜下、咽背、耳下、支氣管、胃門、腎門、腹股溝及腸系膜等淋巴結病變最明顯，見圖7。

圖5 腸系膜淋巴結出血

圖6 頜下淋巴結大理石樣變

圖7 頜下淋巴結出血

全身多組織器官表現出血、喉頭和會厭軟骨上多數有小出血點，見圖8；腸道淋巴濾泡常腫大，直接從漿膜面即可明顯觀察；膀胱黏膜呈片狀或散在點狀出血；胃大彎內黏膜常見明顯的充血和出血斑和出血點，表面糜爛、潰瘍，見圖9。扁桃體明顯腫大，表面因繼發細菌感染而出現的潰瘍壞死灶，見圖10。

圖8 喉頭和會厭軟骨出血

圖9 胃大彎黏膜出血、潰瘍

圖10 扁桃體潰瘍、壞死

慢性豬瘟剖檢見腸黏膜充血、出血，回盲瓣呈“紐扣狀”潰瘍，見圖11、12和13。

圖11 腸黏膜充血、出血

圖12 回盲瓣出血、潰瘍

圖13 回盲瓣呈“紐扣狀”

持續性感染無癥狀或癥狀不明顯，仔豬先天性感染豬瘟病毒，導致發生死胎、木乃伊胎、胎兒皮下水腫，腹腔積水以及畸形胎兒，出生后很快死亡的胎兒通常在皮膚和內臟器官呈現點狀出血。

3 實驗室診斷

豬瘟實驗室診斷一般分為動物接種、病毒抗原檢測、病毒分離、病毒核酸檢測這4種方法，其中以病毒核酸檢測最為常用。

3.1 動物接種

動物接種法診斷豬瘟主要包括兔體交互實驗和本體動物回歸實驗。受診斷成本及時間限制，動物接種實驗現在極少使用。兔體交互實驗的主要原理是豬瘟強毒不會引起兔的體溫反應，但能使其產生免疫力，豬瘟兔化弱毒苗能使家兔產生定型熱反應，但對已產生免疫力的家兔則不產生體溫反應，因此根據試驗組兔不發生定型熱反應，來檢測樣本中是否含有豬瘟病毒。通過本動物接種分離鑒定豬瘟病毒是檢測豬瘟病毒最敏感的方法，但試驗成本高，耗時長，動物個體差異大，存在生物安全隱患且須在動物生物安全三級實驗室進行，散毒風險高。

3.2 豬瘟病毒抗原檢測

如果樣本是血液或者組織研磨液，可以選用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，該方法具有操作簡便，檢測時間短的優點，但存在靈敏度低，田間感染很難檢測。若是組織切片/抹片可選用免疫熒光/過氧化物酶實驗，該種方法的優點是特異性高、檢測時間短，但對檢驗人員要求高，敏感性低。

3.3 豬瘟病毒分離

目前用于豬瘟病毒分離的組織主要有：血液、扁桃體、淋巴結、脾臟、腎臟和回腸等組織。血液（抗凝血、脫纖血）、扁桃體和淋巴結等組織也是國家豬瘟參考實驗室開展豬瘟流行病學監測在養豬場和屠宰場常用的采樣組織，也是豬瘟病毒的嗜性組織。脾臟：健康脾臟為飽滿的紅棕色，豬瘟病毒感染后蒼白、柔軟、邊緣梗死，適宜在梗死灶之間進行采樣。腎臟：健康腎臟為蒼白紅棕色豬瘟病毒感染后表面有針狀出血點，采樣時采集皮質和髓質交界處?；啬c：回腸底部潰爛是急性豬瘟的典型癥狀，但只見于回腸內壁，潰爛周圍組織是病毒富集區適宜進行采樣。

豬瘟病毒分離實驗室操作主要分為4個步驟：組織處理（修剪、研磨）、接種（敏感細胞系：PK15或ST）、結果判定（細胞、核酸染色法）、鑒定（RTPCR、測序）。上述檢測步驟也存在一定的優缺點。優點：特異性好，可用于病毒的進一步鑒定和毒種保存；缺點：靈敏度低，檢測周期長，易出現假陰性。

3.4 病毒核酸檢測

目前豬瘟病毒核酸檢測法主要是熒光RT-PCR和RT-nPCR，且這兩種方法都已申請國標為我所豬瘟組自主開發產品，見圖14和圖15。

熒光RT-PCR用于豬瘟病毒野毒、疫苗毒等所有毒株的診斷和監測，適用于豬活體及其臟器、血液、排泄物和細胞培養物中CSFV核酸的檢測。原理是在PCR擴增體系中加入一條特異熒光探針，該探針為一寡核苷酸鏈，兩端分別標記一個報告熒光基團(R)和一個淬滅熒光基團(Q）。探針完整時，兩者發生熒光共振能量轉移，R基團發射的熒光信號被Q基團淬滅，PCR擴增進行時，Taq酶發揮5`～3`外切酶活性，將探針降解，實現R基團與Q基團分離，Q基團淬滅作用隨即消失，R基團釋放熒光信號，被熒光監測系統接收，即每完成一次擴增，就有一個熒光信號累積，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。在操作過程中應設置陰性對照，包括樣本陰性對照與體系陰性對照；由于該方法的靈敏性很強，需要注意實驗污染，因此最好將實驗分區，將試劑配置、樣本處理、核酸擴增等步驟區分開來，避免污染。在大規模檢測時，建議使用UNG防污染體系。

圖14 豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒

RT-nPCR即套式聚合酶鏈式反應，用于豬瘟的診斷和監測，適用于豬活體及其臟器、血液、排泄物和細胞培養物中豬瘟病毒核酸的檢測。RT-nPCR使用兩對PCR引物擴增完整目的片段，第二對引物特異性的擴增位于首輪PCR產物內的一段DNA片段，彌補RT-PCR的不足，可檢測病毒含量低的樣品。在RT-nPCR擴增的特定基因（E2基因）片段的基礎上，擴增產物可以進行基因序列測定，因此該方法可進一步鑒定流行毒株的基因型，從而追蹤流行毒株的傳播來源。

3.5 豬瘟抗體檢測

進行豬瘟抗體監測是國家豬瘟參考實驗室開展流行病學調查的主要內容之一?？贵w檢測既可以用于免疫豬的抗體水平監測，從而篩選出免疫耐受豬或者對疫苗免疫效果進行監測和評價，也可用于非免疫豬的感染篩查。目前豬瘟抗體檢測方法主要有細胞中和試驗、兔體中和試驗、正向間接血凝試驗、ELISA、免疫層析技術以及其他的新型檢測技術。

1)細胞中和試驗常用于豬血清中具有中和作用的豬瘟抗體效價的測定，主要采用固定病毒含量（通常病毒含量為100TCID50/50μL），稀釋待測血清的方法進行抗體效價測定。該方法是豬瘟抗體檢測中的金標準但操作復雜，檢測時間久，影響因素較多。

2)兔體中和試驗也是豬瘟抗體檢測中的金標準，其原理是利用工作濃度的豬瘟兔化弱毒抗原，與不同稀釋度的被檢血清等量混合作用后，耳靜脈注射家兔，據家兔體溫反應結果定性定量判定被檢血清。該方法同樣操作復雜，檢測時間久。

圖15 豬瘟病毒RT-nPCR檢測試劑盒

3)豬瘟正向間接血凝試驗是利用豬瘟病毒致敏紅細胞，將待檢血清梯度稀釋后進行抗原抗體反應，根據紅細胞的凝集判斷結果。這種方法能夠測出豬瘟抗體效價，簡便易操作，常用于免疫抗體的監測。

4)酶聯免疫吸附試驗即ELISA技術，是國際貿易指定標準診斷方法之一，該方法又分為間接ELISA、阻斷ELISA、競爭ELISA。中國獸醫藥品監察所國家豬瘟參考實驗室制成了具有自主知識產權的豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒，適合我國全面免疫的防控策略，具有敏感性高特點。

5)免疫層析技術其原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細層析作用，使抗原抗體在固相膜上反應，由膠體金標記的抗體顯色，陽性反應在膜上呈現紅色，陰性反應則不顯色。操作簡便、快速，全程只需5 min左右，肉眼直接觀察和判斷檢測結果；可采用儀器進行相對定量，但是該方法敏感性低，不適合大量的樣品檢測。隨著科技發展，化學發光技術、熒光微球檢測技術、鑭系高敏熒光定量免疫層析技術等新興技術逐漸用于豬瘟抗體的檢測。

相信隨著分子生物學技術的發展和高新技術的一次次突破，越來越多的新技術、新方法被研發并應用于生產實踐當中，當然也包括我們獸醫界在豬瘟診斷領域的突破和創新。豬瘟參考實驗室將按照OIE參考實驗室的職能和國家豬瘟防控需求，努力完善豬瘟流行病學的研究，進一步提升診斷水平和標準化建設，開展相關基礎研究以及新型診斷試劑及疫苗的研發，加強實驗室建設，進一步增強在國際社會中的交流與合作，建立長期聯系機制，深入探討豬瘟防控中的技術問題，共同為在全球控制和消滅豬瘟做出更大的貢獻。

國家自然科學基金面上項目“豬瘟病毒RNA在體內外細胞中的復制動態研究”（編號：31372434）；《“十二五”農村領域國家科技計劃課題》項目“豬瘟和豬偽狂犬病防控凈化技術集成研究與示范”，項目編號：2015BAD12B04。

2017-10-30）