清開靈注射液對老年癡呆小鼠血液、腦組織Aβ含量及神經(jīng)遞質(zhì)的影響?

常佩芬，唐蓓蕾，郭 寧，趙紅霞，趙 勇，高永紅，朱海燕△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所，北京 100700； 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 4. 國家中醫(yī)藥管理局心脈病證益氣活血重點研究室，北京 100700； 5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合氣血研究實驗室，北京 100700)

【實驗研究】

清開靈注射液對老年癡呆小鼠血液、腦組織Aβ含量及神經(jīng)遞質(zhì)的影響?

常佩芬1,2，唐蓓蕾1，郭 寧1，趙紅霞3，趙 勇1,2，高永紅4,5，朱海燕1,2△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100700； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)心血管病研究所，北京 100700； 3. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 4. 國家中醫(yī)藥管理局心脈病證益氣活血重點研究室，北京 100700； 5. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合氣血研究實驗室，北京 100700)

目的：觀察清開靈注射液對老年癡呆小鼠血液和腦組織中β-淀粉樣蛋白(Aβ)含量以及神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)、一氧化氮(NO)水平的影響，探討清開靈防治老年癡呆的部分作用機制。方法：采用轉(zhuǎn)基因快速老化癡呆小鼠Sam P8模型，按隨機數(shù)字表法分為模型組、清開靈注射液組、陽性藥對照組，以正常老化小鼠Sam R1為正常對照組。實驗組小鼠腹腔注射清開靈注射液1個月后比較各組血清及腦組織中Aβ水平，并檢測腦組織中Ach、NO含量。結(jié)果：清開靈可明顯降低癡呆小鼠血液中Aβ含量，增加腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)Ach、NO水平。結(jié)論：清開靈注射液改善老年癡呆的作用可能與清除血液中Aβ、增加神經(jīng)遞質(zhì)Ach、NO水平有關(guān)。

清開靈注射液；老年癡呆；β-淀粉樣蛋白；神經(jīng)遞質(zhì)

雖然阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)的病因及發(fā)病機制尚不完全明確，但淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)在其病理發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)中心地位已是不爭的事實。新近的研究提示，AD患者腦中可溶性Aβ可能主要來源于血液[1-2]，可溶性Aβ通過病理狀態(tài)下的血腦屏障，在腦內(nèi)聚集形成有毒物質(zhì)對神經(jīng)元造成損傷，同時影響正常神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生及代謝，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。本研究小組前期實驗證實，清開靈注射液能明顯改善老化癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3]。為此，本實驗采用轉(zhuǎn)基因老化癡呆小鼠模型，通過檢測小鼠血液及腦組織中Aβ含量和腦實質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)活性，探究AD的可能發(fā)病機制，并觀察清開靈注射液的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2月齡快速老化癡呆雄性小鼠Sam P854只，2月齡正常老化癡呆雄性小鼠Sam R118只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號 SCXK(京)2012-0001)。

1.2 藥物及試劑

清開靈注射液(河北神威藥業(yè)有限公司，批號13052061)、安理申片(衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司，批號130330 A)、小鼠β淀粉樣蛋白1-40酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(AMEKO，貨號AE91032Mu)、乙酰膽堿(Ach)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A105-1)、一氧化氮(NO)測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號A013-2)。

1.3 儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(中國泰斯特，型號HH.W21.420)、全自動酶標(biāo)儀(Thermo公司，型號MK3)、Olympus BX60型顯微鏡和SPOT-Ⅱ(Diagnostic Instrumens.Inc)圖像采集軟件。

1.4 動物分組及給藥

1.4.1 分組 快速老化癡呆雄性小鼠Sam P854只，按隨機數(shù)字表法分為模型組、清開靈組、安理申(陽性藥)組，正常老化雄性小鼠Sam R1為對照組，每組18只。

1.4.2 給藥 清開靈注射液用生理鹽水稀釋成20%的注射液，安理申用純凈水配置成0.07 mg/ml的溶液。清開靈組按3 ml/kg腹腔注射20%的清開靈稀釋液，同時按100 ml/kg灌服純凈水；安理申組按15 ml/kg腹腔注射生理鹽水，同時按0.7 mg/kg灌服安理申；模型組和對照組腹腔注射相同比例的生理鹽水并灌服純凈水，每周連續(xù)給藥5 d共4周。

1.5 血液及腦組織中Aβ含量的測定

實驗結(jié)束后每組各取6只小鼠采用摘眼球取血，冰盤上剝離取全腦棄嗅球及小腦。離心取血清，腦組織用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分制成10%腦組織勻漿。按說明書采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組標(biāo)本Aβ含量。

1.6 腦組織Ach活性和NO含量測定

每組各取6只小鼠斷頭處死，冰盤上剝離取全腦棄去嗅球及小腦，稱重后加入預(yù)冷的生理鹽水，制成10%腦組織勻漿，嚴(yán)格按試劑盒要求操作。

1.7 光鏡下海馬CA1區(qū)的組織結(jié)構(gòu)變化

每組各取6只小鼠用4%多聚甲醛灌注后取腦，腦組織于4%多聚甲醛固定液固定24 h，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，行冠狀切片(5 μm)裱于多聚賴氨酸防脫玻片上，避光陰涼處保存。采用伊紅-蘇木素染色法，光鏡下觀察海馬區(qū)腦組織。

2 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 清開靈注射液對癡呆小鼠血液及腦組織中Aβ含量的影響

表1顯示，模型組血液及腦組織中Aβ含量較對照組明顯增加，清開靈注射液可顯著降低血液中Aβ的含量，但對腦組織中Aβ含量的影響相對較小，雖有減少趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.2 清開靈注射液對癡呆小鼠腦組織中Ach活性及NO水平的影響

表1顯示，模型組小鼠Ach活性及NO水平均較對照組明顯減少，清開靈注射液可顯著提高癡呆小鼠腦組織中Ach活性，增加NO水平。

表1 清開靈注射液對癡呆小鼠血液及腦組織中Aβ及神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

注：與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較:△P<0.05，△△P<0.01

圖1 清開靈注射液對癡呆小鼠海馬CA1區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)的影響(×40)

3.3 清開靈注射液對癡呆小鼠海馬CA1區(qū)腦組織結(jié)構(gòu)的影響

圖1顯示，觀察小鼠海馬CA1 區(qū)可見，正常組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，分布均勻；模型組大量神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞體積縮小，胞核固縮，染色加深，形狀不規(guī)則伴有明顯的嗜神經(jīng)現(xiàn)象；清開靈組及安理申組部分神經(jīng)細(xì)胞壞死，形狀不規(guī)則，核固縮，染色加深，與模型組比較神經(jīng)元損傷情況明顯減輕。

4 討論

β淀粉樣蛋白在AD的病理發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)中心地位，Aβ如何在大腦中聚集增多是AD研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。早期研究認(rèn)為，AD的發(fā)生是由于腦內(nèi)相關(guān)基因突變導(dǎo)致淀粉樣蛋白前體(APP)過度表達(dá)或加工異常，致使毒性Aβ產(chǎn)生增加。近期的研究發(fā)現(xiàn)，腦中可溶性Aβ可能主要并長期來源于血液[1-2]。在典型的老年癡呆病理過程中，大腦并沒有Aβ產(chǎn)生增加的證據(jù)，而更像是Aβ清除能力相對不足[4]。此外，老年癡呆患者的血漿Aβ濃度在易感年齡的某一時期可明顯增加，隨后又回落至正常[5]，因此提出老年癡呆Aβ的血液起源理論[6]。

在前期清開靈注射液干預(yù)快速老化癡呆小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，清開靈注射液能夠明顯改善老化癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[3]。安理申是當(dāng)前治療輕中度老年癡呆癥的首選藥，在改善老年癡呆癥的認(rèn)知功能、學(xué)習(xí)能力及記憶力方面均有明確療效，因此作為此次實驗的陽性對照藥。

本實驗采用轉(zhuǎn)基因老年癡呆小鼠作為模型組，通過酶聯(lián)免疫檢測發(fā)現(xiàn)，模型小鼠血液及腦組織中Aβ的含量確實較正常小鼠明顯增加。同時發(fā)現(xiàn)，模型小鼠腦組織中Ach及NO濃度顯著減少，其2種神經(jīng)遞質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)與大腦學(xué)習(xí)記憶能力呈正相關(guān)[7]。

通絡(luò)治療是王永炎院士“濁毒損傷腦絡(luò)”病機理論的核心體現(xiàn)[8]。老年人臟腑功能漸虛，氣血運行失常，生痰生瘀，聚積成濁毒，瘀阻腦絡(luò)，神機失用。在AD患者腦內(nèi)異常聚集的Aβ也可視作內(nèi)毒聚集的一種表現(xiàn)。清開靈注射液具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神之功效。采用清開靈注射液干預(yù)癡呆小鼠，光鏡下發(fā)現(xiàn)該藥能夠明顯改善小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，減少神經(jīng)細(xì)胞的變性壞死，清除AD患者血液中過多的Aβ，增加腦內(nèi)學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)Ach及NO含量。本次實驗并未發(fā)現(xiàn)清開靈注射液能夠減少腦內(nèi)Aβ水平，但有這種趨勢。這可能與動物樣本量較少有關(guān)，有待進(jìn)一步驗證。本研究結(jié)果為“解毒通絡(luò)”治法的擴展應(yīng)用提供了初步實驗依據(jù)，并進(jìn)一步開拓了AD治療的新思路。

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[3] 邱蕾,鄭璐,張瑤,等.清開靈對快速老化癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及作用機制研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010,30(7):738-742.

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EffectofQingkailingInjectiononAβcontentandNeurotransmitterinBloodandBrainTissueofSenileDementiaMice

CHANG Pei-fen1,2, TANG Bei-lei1, GUO Ning1, ZHAO Hong-xia3, ZHAO Yong1,2, GAO Yong-hong4,5, ZHU Hai-yan1,2△

(1.CardiovascularmedicineofDongzhimenHospital,BUCM,Beijing100700,China; 2.InstituteofCardiovascularDisease,BUCMBeijing100700,China; 3.InstituteofBasicTheoryforChineseMedicine，ChinaAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100700,China; 4.KeyLaboratoryofQi-tonifyingandBlood-activatingTherapeuticRulesforCardiovascularDiseases,StateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700,China; 5.KeyLaboratoryofChineseInternalMedicine,MinistryofEducation,Beijing100700,China)

Objective:To detect the role of Qingkailing injection on expression of β-amyloid protein(Aβ)、racetylcholine(Ach) and nitric oxide(NO) respectively in mice’s brain and blood.The purpose was to explore the sectional mechanism that Qingkailing injection in the prophylaxis and treatment of Alzheimer’s disease(AD).Methods:Used senescence accelerated mice prone 8(Sam P8)as experiment models,54 transgenic mice were randomly divided into a model group,a therapy group(Qingkailing injection),a positive drug group(Aricept),according to the random number table method.And used Sam R1 as the control group. Therapy group were intraperitoneal injection of Qingkailing injection.The course of treatment of each group was a month.Compared the expression of Aβ in serum and brain tissue,and detected the level of Ach and NO in brain tissue.Results:Qingkailing injection can significantly reduce the expression of Aβ of dementia mice in serum,and increase the levels of Ach and NO in brain tissue.Conclusion:The mechanism of Qingkailing injection improve Alzheimer’s disease is likely related to it clear the Aβ in serum,and increase Ach and NO.

Qingkailing injection; Dementia; β-amyloid protein; Neurotransmitter

國家自然科學(xué)基金資助項目(81202686)-解毒通絡(luò)法抑制AD血腦屏障轉(zhuǎn)運Aβ的機制研究

常佩芬(1972-),女，北京人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治心腦血管疾病的臨床與基礎(chǔ)應(yīng)用。

△通訊作者：朱海燕，Tel:010-84013141， E-mail:zhuhaiyangy@163.com。

R285.5

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1006-3250(2017)11-1552-02

2017-03-18