白族藥紫金龍的HPLC指紋圖譜研究

蘇小軍　楊懷鏡　曾　懿　聞　焜

云南省大理州食品藥品檢驗所，云南　大理　671000

注： A相為0.2%磷酸水溶液(三乙胺調pH為7.0)，流動相B為甲醇。

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民族醫藥

白族藥紫金龍的HPLC指紋圖譜研究

蘇小軍楊懷鏡曾懿聞焜

云南省大理州食品藥品檢驗所，云南大理671000

【摘要】目的:建立紫金龍藥材HPLC指紋圖譜分析方法，為紫金龍藥材的質量評價提供依據。方法:采用RP-HPLC色譜法，Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm,5μm)色譜柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液(三乙胺調pH為7.0)為流動相梯度洗脫，柱溫35℃，流速1.0ml/min，檢測波長采用波長切換，0～40min為230nm，40～90min切換至285nm，進樣量10μl；數據使用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統研究版(2012A) 進行處理。結果:在選定的色譜條件下確定10個峰構成紫金龍藥材的特征共有峰，各批次藥材均具有上述特征，但特征峰的相對含量分布差異導致色譜概貌存在一定差異。結論:該方法簡便、精密度高、重現性好，可為紫金龍藥材的質量評價提供依據。

【關鍵詞】白族藥；紫金龍；特征圖譜；HPLC

白族藥滋堅倫(白語：Zixjieilht)為罌粟科植物紫金龍Dactylicapnosscandens(D.Don) Hutch.的根，別名串枝蓮、碗豆七，夏秋采集其根，曬干后入藥。其味苦、性涼，有毒，具有消炎、止痛鎮痛、止血、降壓的功效，白族民間用于胃痛、神經性頭痛、牙痛、外傷腫痛、外傷出血、高血壓等。在我國西南地區民間廣泛用于牙痛、神經性頭痛、胃痛和止血，臨床表明具有較好的鎮痛作用[1-5]。紫金龍含有多種生物堿，主含普羅托品、異紫堇定等[6-8]。中藥材指紋圖譜是近年來被國際公認的控制中藥或天然藥物質量的有效方法，其優點在于較全面反映中藥復雜的化學成分及其相對比例。研究采用反相高效液相色譜法建立紫金龍藥材的特征指紋圖譜，為該藥材的質量評價提供依據[9]。

1儀器與材料

1.1儀器安捷倫1200高效液相色譜儀(包括自動進樣器、DAD紫外檢測器、HP 色譜工作站等)；GWA-UN2-C30純水器；CQ-250超聲波清洗儀；島津AND GH-252電子天平。

1.2材料紫金龍藥材經大理州食品藥品檢驗所楊懷鏡主任藥師鑒定為罌粟科植物紫金龍Dactylicapnosscandens(D.Don)Hutch.的干燥根，所測樣品見表1;原阿片堿(批號：110853-200402，中國藥品生物制品檢定所)；近視樂眼藥水(市場抽樣合格制劑)；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱為Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm，5μm)；流動相A相為0.2%磷酸水溶液(三乙胺調pH為7.0)，B相為甲醇，梯度洗脫，見表2；柱溫：35℃；流速：1.0ml/min；檢測波長：0～40min波長為230nm，40～90min切換至285nm；進樣量：紫金龍(1～12)進樣10μl，原阿片堿對照品進樣5μl，近視樂眼藥水參照物溶液進樣5μl。

2.2對照品溶液制備精密稱取原阿片堿對照品5.46mg置10ml量瓶，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾后作為對照品溶液，進樣5μl，見圖1；取近視樂眼藥水2ml用水稀釋至50ml的容量瓶中，搖勻，微孔濾膜過濾后作為參照物溶液進樣5μl，記錄色譜圖，見圖2。

表1　樣品信息

編號樣品產地/來源1紫金龍2013年市場抽樣樣品2紫金龍楚雄州,三月街購3紫金龍巍山縣,三月街購4紫金龍巍山中廠,課題組采集5紫金龍巍山縣,金貝中藥行購6紫金龍怒江州,金貝龍關藥店購7紫金龍洱源縣,金貝中藥行購8紫金龍大理市大波清(館藏標本)9紫金龍云龍縣(館藏標本)10紫金龍大理市大波清,課題組采集11紫金龍巍山縣,課題組采集12紫金龍對照藥材批號:1194-200101,中國藥品生物制品檢定所13原阿片對照品批號:110853-200402,中國藥品生物制品檢定所

表2　梯度洗脫程序

注： A相為0.2%磷酸水溶液(三乙胺調pH為7.0)，流動相B為甲醇。

2.3供試品溶液制備精密稱取60℃干燥至恒重的紫金龍粉末2g(過40目篩)，置具塞錐形瓶中，加入氨水將其潤濕，放置30min，加甲醇和氯仿(1∶1)混合溶液20ml，超聲提取30min，放冷后，濾過，蒸干，殘渣用甲醇分次溶解，轉移至10ml量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾后進樣10μl，記錄色譜圖，見圖3。

2.4特征圖譜評價方法采用國家藥典委員會開發的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統研究版(2012A)。對照圖譜生成方法為中位數法，時間窗寬度為0.5min，相似度計算方法為夾角余弦法。

2.5方法學考察

2.5.1精密度實驗取同一供試品溶液,連續進樣6次，檢測指紋圖譜，比較各色譜峰的保留時間，結果表明6次進樣各共有峰相對保留時間RSD在0.14%～0.38% 之間，相似度在0.990～1 之間，符合指紋圖譜研究技術的要求。

2.5.2重復性實驗取同一批紫金龍藥材6 份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別檢測指紋圖譜，結果表明各共有峰保留時間RSD在0.12%～0.45%之間，相似度在0.992～0.999之間，符合指紋圖譜研究技術的要求。

2.5.3穩定性實驗取同一批供試品溶液，分別于0、2、4、 8、12、24h 檢測指紋圖譜，結果表明各特征峰無明顯差異，各色譜峰共有峰保留時間RSD在0.15%～0.44%之間，相似度在0.999～1，表明樣品溶液在24h內穩定。

2.6結果

2.6.1圖譜測定時間的確定取樣品溶液5μl，注入高效液相色譜儀，記錄120min內色譜圖，結果表明，90min 后無特征峰出現，故確定圖譜記錄時間為90min。

2.6.2空白實驗取甲醇溶液5μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果表明，空白無干擾。

2.6.3樣品特征圖譜測定取表1中的樣品，按“2.3”項下方法獲得供試溶液，進樣10μl，記錄HPLC色譜圖，結果見圖4。

2.6.4共有峰的確定及相似度計算根據12批紫金龍藥材特征圖譜的檢測結果，按“2.4”項下方法，以紫金龍對照藥材S12為參照圖譜，全譜峰匹配，生成紫金龍藥材對照特征圖譜(見圖4 R) ，其中共匹配出10個峰(見圖3)，構成紫金龍藥材的特征共有峰。通過與對照品圖譜比對，指認4號峰為原阿片堿峰，6號峰為近視樂眼藥水參照物峰。因原阿片堿峰面積適中且峰形穩定故以其為參照峰，利用該軟件對12 批特征圖譜進行數據處理，各共有峰相對保留時間RSD在0.15%～0.44% 之間，各批次相似度值高，結果見表3 所示。可以看出，12批紫金龍藥材特征圖譜的相似度均>0.9，說明不同來源的紫金龍藥材具有較高的均一性。

表3　12批紫金龍藥材相似度

編號S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12相似度0.9970.9880.9990.9920.9870.9911.0001.0001.0000.9990.9931.000

2.6.5樣品特征圖譜分析由于標準品有限，實驗未對其他特征峰進行指認與分析。本實驗測試樣品包括了不同產地、不同類型(栽培、野生及商品藥材)的紫金龍，其HPLC特征圖譜均具有上述特征峰，相互間吻合較好，可作為紫金龍的特征指紋。

3討論

3.1提取方法的選擇實驗以盡可能多體現紫金龍主要成分為原則，設計樣品溶液制備方法。分別選取體積分數為70%乙醇、甲醇、氯仿為提取溶媒,對提取物HPLC圖譜分析，但效果都不理想。可能是由于紫金龍中生物堿在極性和含量上差異較大，很難用單一的溶媒取得滿意的效果。考慮堿性條件易于生物堿的溶出，所得峰較多，故比較氨水潤濕時間的長短對實驗結果的影響。結果表明，氨水潤濕30min后制備的供試品中峰形最佳。實驗還考察了超聲20、30、40、50min提取效果，結果提示，超聲提取30min及以上，所得各峰響應值較高且無明顯差異。所以實驗采用加氨水潤濕30min后，加20ml甲醇和氯仿(1∶1)混合溶液，超聲提取30min，作為供試液制備方法[10-12]。

3.2流動相的選擇實驗考察了多種流動相：甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液(三乙胺調pH至7.0)、甲醇-0.005mol/L磷酸氫二鈉溶液(三乙胺調節pH值至9.0)。結果表明，甲醇-0.2%磷酸水溶液(三乙胺調pH至7.0)系統中色譜峰多且峰形較好，所以選擇該流動相系統。

實驗中考察了Phenomenex Synergi Polar-RP 80A(250mm×4.6mm，4μm)、CAPCELL PAK C18(150mm×4.6mm，5μm)、Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm，5μm)三根不同廠家的色譜柱，結果表明采用Inertsil ODS-SP(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱所得圖譜基線平穩，色譜峰數目較多，分離度，峰形好，因此選用該柱進行特征圖譜研究。

3.3檢測波長及柱溫的選擇實驗從200～400nm內挑選了210、230、245、275、285、320、340、370nm 波長顯示色譜圖，并記錄全譜段三維圖譜。結果在低波長色譜段基線不平，檢測波長為230nm時，在40min后色譜峰較為稀疏且特征峰6過高，此時將檢測波長切換為285nm，得到峰數較多，同時解決了特征峰6過高問題，最后結合三維圖譜，選擇用波長切換的方法對其進行分析，即0～40min檢測波長為230nm，40～90min檢測波長為285nm，使色譜峰盡可能得到體現。

實驗比較了四個不同柱溫下的色譜圖(25、30、35、40℃),發現隨柱溫上升，各色譜峰變化不明顯，故選擇35℃為指紋圖譜的檢測柱溫。

3.4特征圖譜相似度評價實驗采用了HPLC 對紫金龍進行分析，各樣品HPLC 特征圖譜雖存在一定差異，但均具有相同的色譜特征峰，所建立的特征圖譜具有穩定性和可控性。不同來源的紫金龍藥材分析結果可以看出，各色譜峰的保留時間匹配好，特征峰含量分布差異較大，以全譜峰匹配方式計算相似度，各批次差異較大，但在選定的色譜條件下以兩個已知特征峰：特征峰4(原阿片堿)、特征峰6作為多點校正，Mark峰匹配方式計算相似度，則各批次相似度高，表明紫金龍藥材色譜圖中特征峰4、特征峰6含量穩定，其余特征峰含量個體差異較大。

參考文獻

[1]南京中醫藥大學.中藥大辭典(下冊)[M].上海：上海科學技術出版社，2006:3291.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].1977:586.

[3]大理州白族自治州人民政府.大理中藥資源志[M].昆明：云南民族出版社，1991：83.

[4]錢信忠.有毒中草藥大辭典[M].天津.天津科技翻譯出版公司，1992：561.

[5]張文鑫，韓麗妹，周毅生，等.RP-HPLC同時測定紫金龍中四種異喹啉生物堿的含量[J].中國藥學雜志 2009，44(3)：233-236.

[6]吳穎瑞，趙友興，劉玉清，等.紫金龍的生物堿成分研究[J].天然產物研究與開發，2008，20： 622-626.

[7]錢金栿，周粵.白族草藥紫金龍成分的研究[J].西北藥學雜志，2000，15(2)：57-58.

[8]羅建蓉，錢金栿，周濃.紫金龍脂溶性化學成分的研究[J].西北藥學雜志，2010，25(1)：19-20.

[9]周玉新.中藥指紋圖譜研究技術[M].北京：化學工業出版社，2002.

[10]宋雙紅，王喆之，張媛，等.黃芩藥材HPLC 指紋圖譜的研究[J].中國藥學雜志，2006，41(6)：413-417.

[11]簡偉杰，段瓊，段天璇，等.燈心草藥材RP-HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17(10)：60-63.

[12]詹漢英，謝彩娟，楊龍梅，等.不同產地延胡索藥材RP-HPLC 指紋圖譜及質量研究[J].藥物分析雜志，2008，28(6)：884-887.

HPLC Fingerprint ofDactylicapnosscandentisRadix by the Traditional Bai Medicine

SU XiaoJunYANG HuaijingZENG yiWEN kun

Institute For Food and Drug Control of Dali Prefecture，Dali 671000，China

Abstract:Objective To establish the HPLC fingerprint of Dactylicapnos scandentis radix and to research the quality of Dactylicapnos scandentis radix.Methods The gradient elution and multiple wavelength mode was applied in chromatographic separation,and chromatographic fingerprint similarity evaluation software(2012A) was used to analyse data.Results 10 peaks were identified as the characteristic fingerprints of Dactylicapnos scandentis radix. All samples tested contained the same 10 peaks, but the content of each peak showed great difference among the samples,which resulted in the differences on their chromatograms.Conclusion This method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of Dactylicapnos scandentis radix.

Key words:Traditional Bai Medicine；Dactylicapnos Scandentis Radix；Fingerprint；HPLC

(收稿日期：2015.12.27)

【中圖分類號】R284.1

【文獻標志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)04-0001-03

作者簡介：蘇小軍(1981-)，男，主管中藥師，主要從事藥品檢驗及民族藥研究。E-mail:276595451@qq.com

基金項目：中國食品藥品檢定研究院中青年發展研究基金(2013WA11)。