固相萃取—高效液相色譜—串聯質譜測定水中5種大環內酯類抗生素

摘 要：建立固相萃取（SPE）、高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）同時測定水中5種大環內酯類抗生素（羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素和泰樂菌素）的分析方法。水樣中的抗生素通過Oasis HLB固相萃取小柱富集后，以C18反相色譜柱為分析柱，甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相，采用HPLC-MS/MS進行定量分析，檢測方式為多反應監測模式（MRM），內標法定量。5種大環內酯類抗生素的回收率在64.8%～90.8%之間，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L。將建立的方法用于檢測某化學工業園區周邊地表水中5種目標分析物的殘留，均未檢測到泰樂菌素，其余4種抗生素均有不同程度檢出，檢出濃度在ng/L水平。

關鍵詞：大環內酯類抗生素；固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜；水體

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）03-0058-05

Abstract： A method with solid phase extraction（SPE） and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） was developed for the determination of five macrolides （roxithromycin， clarithromycin， azithromycin， spiramycin and tylosin） in natural water samples. The macrolides were extracted from water samples using Oasis HLB cartridges and then separated on a reverse phase column using methanol and 0.1% formic acid as mobile phases. The macrolides were quantified with the internal standard method under multiple reaction monitoring（MRM） mode. The recoveries of the five macrolides ranged from 64.8% to 90.8%. The instrumental limits of detection and quantification are 0.012-0.085 μg/L and 0.041-0.285 μg/L respectively. Only Tylosin was not found by the proposed method in the studied rivers surrounding a Chemical Industry Park， while the other four macrolides were detected at the ng/L level.

Keywords： macrolides antibiotics（MLs）； solid phase extraction（SPE）； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）； water

0 引 言

抗生素作為當今重要的一類藥物，被廣泛應用于醫藥行業以及牲畜、水產養殖中。依據其不同的化學結構，抗生素主要分為喹諾酮類、β-內酰胺類、氯霉素類、磺胺類、大環內酯類、頭孢菌素類、四環素類、氨基糖苷類[1]。大環內酯類抗生素（macrolides antibiotics，MLs）對治療因支原體、衣原體、流感嗜血桿菌以及立克次體等引起的疾病都特別有效，不僅能用于對人類的治療，也可以應用于畜牧養殖業[2]。抗生素可通過不同的途徑進入水環境中[3]，水體環境是抗生素最重要的一個匯。

鑒于抗生素對水生態系統和人體健康的潛在危害性，非常有必要對水環境中廣泛存在的這一類物質進行檢測。水環境中大環內酯類抗生素濃度相對較低，建立快速、科學、高效的預處理方法是前提[4]。對于水環境樣品，預處理方法包括液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取方法等，其中固相萃取法最常用。目前大部分研究都是檢測分析水中多類抗生素[5-6]，單獨檢測大環內酯類抗生素的研究不多[7]，這些研究[8-11]預處理所用的固相萃取小柱大部分為Oasis HLB柱，儀器分析方法均采用高效液相色譜-質譜特別是串聯質譜；但由于檢測物質為不同品種的大環內酯類抗生素，樣品預處理條件、儀器工作參數有所不同。

本文在總結文獻的基礎上，著重對分析方法進行了篩選和優化，建立了固相萃取（SPE）、高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）同時測定水中羅紅霉素（roxithromycin，ROX）、克拉霉素（clarithromycin，CLAR）、阿奇霉素（azithromycin，AZI）、螺旋霉素（spir-amycin，SPM）和泰樂菌素（tylosin，TLS）5種大環內酯類抗生素（其結構如圖1所示）的分析方法，并應用于實際地表水中大環內酯類抗生素殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Agilent1260/API4000高效液相色譜儀/串聯質譜（Agilent，ABI/SCIEX）；12管固相萃取裝置（Supelco）；500 mg/6 mL HLB固相萃取小柱（Waters）；SHZ-D（III）循環水式真空泵（南京科爾儀器有限公司）；1 L玻璃砂芯過濾裝置（天津市津騰有限公司）；0.45 μm混纖膜（上海新亞凈化器件廠）；0.45 μm PTFE濾頭（天津市津騰實驗設備有限公司）。

甲醇（HPLC級，Merck）；甲酸（HPLC級，ROE Scientific）；超純水（MILLI-QAIO，Millipore）；羅紅霉素（純度97%，下同）、泰樂菌素（98.9%）、螺旋霉素（96%）購自Dr.Ehrenstorfer公司；克拉霉素（98%）、阿奇霉素（98%）購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；采用西瑪通（Simatone）為內標物（100 μg/mL，AccuStandard）。

分別稱取5種大環內酯類抗生素標準品適量溶于甲醇中，配制成各抗生素儲備液，-20 ℃保存。取各抗生素儲備液適量溶于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，配制成100 mg/L的羅紅霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、克拉霉素和200 mg/L的泰樂菌素的大環內酯類抗生素混合溶液，-20 ℃保存，使用時用甲醇稀釋至所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理

1 L水樣經0.45 μm濾膜過濾以除去懸浮物，后轉移至干凈瓶子中，調節水樣pH至6～7。水樣以10 mL/min的流量通過Oasis HLB柱子（6 mL，500 mg），HLB柱使用前需進行活化處理，預先用10 mL的甲醇分兩次淋洗，然后再使用10 mL的超純水淋洗。水樣過完柱后，加入5 mL超純水淋洗柱子以去除雜質，負壓下抽15 min以去除水分。最后用15 mL甲醇分3次洗脫，收集洗脫液于50 mL氮吹瓶中。洗脫液在40 ℃的水浴條件下旋轉蒸發至1 mL以下，加入1 mL甲醇以淋洗氮吹瓶內壁，后在40 ℃的水浴下用微弱的氮氣流濃縮至0.5 mL以下，加入20 μL 200 μg/L的內標物溶液，溶液最后用甲醇定容至1 mL，經0.45 μm PTFE濾頭過濾后轉移至2 mL棕色進樣小瓶中，-20 ℃保存待儀器分析。

1.2.2 儀器工作參數

色譜條件：Waters Xterra C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇。流量350 μL/min，進樣量5 μL，柱溫35 ℃。梯度洗脫程序：0～0.5 min，保持5%B；0.5～1.5 min，5%B～30%B； 1.5～11.5 min，30%B～70%B；11.5～12 min，70%B～100%B；12～12.5 min，保持100%B，12.5～13 min，100%B～5%B；13～18 min，保持5%B。樣品需過0.45 μm的PTFE濾頭方可進樣。

質譜條件：離子源為電噴霧正電離源（ESI+）；離子源I（ion source gas 1，GS1）和II（ion source gas 2，GS2）的氣體流量均為55 mL/min；碰撞氣（collision gas，CAD）和氣簾氣（curtain gas，CUR）流量分別為7 mL/min和25 mL/min，氣體均為N2；電離電壓（ion spray voltage，IS）為4 500 V；輔助加熱氣溫度（TEM）為450 ℃。檢測方式為多反應選擇監測（multiple reaction monitoring，MRM）離子模式。

2 結果與分析

2.1 質譜特征

優化后的去簇電壓（decluster potential，DP）、碰撞能（collision energy，CE）及各抗生素的母離子和子離子等其他相關質譜參數見表1。結果表明，5種大環內酯類抗生素目標物和內標物均能實現較好的分離，目標物和內標物的MRM色譜圖見圖2。

2.2 線性范圍和檢出限

采用內標法定量，用以消除進樣體積和儀器信號下降帶來的誤差。儀器的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別是儀器信噪比S/N=3和S/N=10時所對應的質量濃度。5種大環內酯類抗生素的線性方程、儀器檢出限和定量限見表2。結果表明，在0.5～500 μg/L范圍（泰樂菌素為1～1 000 μg/L）內，5種大環內酯類抗生素對應的線性方程的線性相關系數均在0.99以上，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L。

2.3 加標回收率實驗

采用超純水加標，分別于1 L超純水中加入低、中、高3個水平的大環內酯類抗生素標準物，配制成除泰樂菌素的質量濃度為10，40，200 ng/L，其他4種抗生素的質量濃度為5，20，100 ng/L加標溶液，測定方法的加標回收率，加標樣品的處理方法和實際樣品的處理方法相同，每個樣品平行測定3次。水樣加標回收率和相對標準偏差（RSD）的結果見表3。結果表明，5種大環內酯類抗生素的加標回收率在64.8%～90.8%，相對標準偏差均低于12%。

2.4 實際樣品檢測

采用建立的分析方法檢測分析了實際地表水中的大環內酯類抗生素殘留，地表水水樣的采集地點為南京化工園區附近的幾條河流，包括滁河、馬汊河、岳子河和皇廠河。由表4可見，在南京化工園區附近4條河流中，5種大環內酯類抗生素中除泰樂菌素外均有不同程度檢出。從濃度范圍和分布范圍來看，克拉霉素只在滁河的1個采樣點中檢出，檢出頻率最低，但檢出濃度達25 ng/L以上，這可能是由于突發事件造成的，羅紅霉素檢出頻率最高，檢出質量濃度在1.92～35.2 ng/L，阿奇霉素在各個點位上質量濃度差異最大，檢測到的最小值為0.01 ng/L，而最大值為106 ng/L。

徐維海等[12]測得珠江廣州河段春季枯水期和夏季豐水期表層水中的羅紅霉素平均含量分別為32，18 ng/L；陸克祥等[13]在黃浦江水樣品中測得大環內酯類抗生素的質量濃度為53.8～84.8 ng/L；Zhang等[14-15]在萊州灣水體中測得羅紅霉素的質量濃度為ND～227 ng/L，阿奇霉素的質量濃度為ND～88 ng/L，克拉霉素的質量濃度為ND～32.9 ng/L，在黃河和渤海灣水體中測得的大環內酯類抗生素濃度均較低，其中克拉霉素測得質量濃度最高，為8.1 ng/L。本文實際地表水樣品中大環內酯類抗生素的檢出濃度均在ng/L級別，與國內其他地表水檢出的濃度相當。

3 結束語

本文建立了采用HLB柱進行富集萃取、HPLC-MS/MS同時測定水中5種大環內酯類抗生素的分析方法，在0.5～500 μg/L質量濃度范圍（泰樂菌素為1～1 000 μg/L）內，5種大環內酯類抗生素對應的線性方程的線性相關系數均在0.99以上，且其加標回收率在64.8%～90.8%之間，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L。

采用建立的分析方法，對實際地表水進行了檢測分析，均未檢出泰樂菌素，其余4種大環內酯類抗生素的檢出濃度均在ng/L級別，與國內其他地表水檢出的濃度相當。

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（編輯：莫婕）