阿哌沙班中8種已知雜質(zhì)的HPLC法定量檢測

摘 要：建立高效液相色譜法測定阿哌沙班中的8個已知雜質(zhì)。色譜柱為Waters Xbridge Shield RP18（150 mm×4.6 mm，

5 μm）；以乙腈-醋酸銨溶液為流動相，柱溫：40 ℃，流量：1.0 mL/min，檢測波長280 nm。阿哌沙班中8種雜質(zhì)分離較好，與主峰均能有效分離，線性范圍為0.01～11 μg/mL；8種雜質(zhì)的平均回收率分別為98.7%，105.3%，100.7%，111.4%，97.4%，103.4%，98.9%，97.6%，RSD分別為2.8%，4.3%，3.3%，4.5%，3.1%，4.0%，2.7%，3.1%。該法簡便、準確、重復(fù)性好，可為阿哌沙班質(zhì)量標準的制定提供參考。

關(guān)鍵詞：阿哌沙班；高效液相色譜法；雜質(zhì)；回收率；分離

文獻標志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）03-0036-07

Abstract： To establish an HPLC method to determine eight kinds of impurities in Apixaban. Chromatographic column is Waters Xbridge Shield RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）， acetonitrile- ammonium acetate solution is mobile phase， The column temperature is 40 ℃ and the flow velocity is 1.0 mL/min， The detection wavelength is 280 nm. Eight kinds of impurities in Apixaban were separated from the primary front effectively and the linearity range was 0.01-11 μg/mL. The average recovery rates of the eight impurities are 98.7%， 105.3%， 100.7%， 111.4%， 97.4%， 103.4%， 98.9%， 97.6%， and the RSDs were 2.8%， 4.3%， 3.3%， 4.5%， 3.1%， 4.0%， 2.7%， 3.1%. This method is simple， accurate and of good repeatability. It provides quality standards for erythromycin apixaban.

Keywords： Apixaban； high performance liquid chromatographic method； impurities； recovery rate； separate

0 引 言

阿哌沙班（Apixaban）是一種新型口服Xa因子抑制劑，用于預(yù)防和治療血栓[1-2]，其化學(xué)名為1-（4-甲氧基苯基）-7-氧代-6[4-（2-氧代-1-哌啶基）苯基]-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑[3，4-c]吡啶-3-甲酰胺。

2007年，百時美施貴寶與輝瑞正式執(zhí)行全球戰(zhàn)略性合作協(xié)議，聯(lián)合開發(fā)并銷售抗凝血產(chǎn)品阿哌沙班；2011年，在歐盟27國及冰島、挪威，率先批準用于擇期髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)成人患者靜脈血栓癥的預(yù)防[3-5]；2013年1月，獲得中國國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的進口藥品許可證，用于髖關(guān)節(jié)或膝關(guān)節(jié)擇期置換術(shù)的成年患者，預(yù)防靜脈血栓栓塞（VTE），于2013年4月正式在中國上市[6-8]。

采用高效液相色譜法測定阿哌沙班中有關(guān)物質(zhì)已有文獻報道，但未明確降解產(chǎn)物以及可能存在的雜質(zhì)[9-10]。根據(jù)人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議（ICH）原料藥雜質(zhì)研究要求，參考阿哌沙班的進口標準，并按照《中國藥典》2015年版四部中藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則，探索HPLC分離阿哌沙班與其8個已知雜質(zhì)（結(jié)構(gòu)見圖1[11]）的檢測條件，并進行方法學(xué)驗證。

1 儀器與試藥

儀器：Series 1500高效液相色譜儀；UV759CRT紫外可見分光光度計；BP 210D電子分析天平。

試藥：阿哌沙班樣品（批號：131101，140101，

140201，140301）；阿哌沙班對照品（批號：130901，含量：99.80%）；雜質(zhì)A（批號：130701，含量：97.12%）；雜質(zhì)B（批號：130701，含量：96.71%）；雜質(zhì)C（批號：130701，含量：98.92%）；雜質(zhì)D（批號：130701，含量：99.17%）；雜質(zhì)E（批號：130601，含量：97.97%）；雜質(zhì)F（批號：130701，含量：97.11%）；雜質(zhì)G（批號：130701，含量：96.12%）；雜質(zhì)A9-5（批號：130701，含量：99.54%）；以上試藥均為成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司制造。乙腈為分析純，純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge Shield RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為乙腈，B相為10 mmol/L醋酸銨溶液，梯度洗脫（見表1）；流量1.0 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫40 ℃；進樣量：10μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

精密稱取雜質(zhì)A，B，C，D，E，F(xiàn)，G，A9-5及阿哌沙班對照品適量，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并制成每1 mL含各雜質(zhì)及阿哌沙班對照品約1.0 μg的混合溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。雜質(zhì)A，B，阿哌沙班，C，D，E，F(xiàn)，G，A9-5依次出峰，阿哌沙班與相鄰雜質(zhì)以及各雜質(zhì)峰之間的分離度大于1.3，理論塔板數(shù)按阿哌沙班主峰計大于5 000，見圖2。

2.3 專屬性試驗

分別精密稱取阿哌沙班樣品（批號131101）適量，對其進行酸、堿、氧化、高溫及紫外光照等強制降解試驗，按2.1項下色譜條件進行測定，結(jié)果如表2及圖3～圖8所示。

由上述破壞實驗結(jié)果可知，阿哌沙班對高溫、酸、氧比較穩(wěn)定，在高溫120 ℃條件下破壞72 h、0.01 mol/L的酸條件下破壞1 h、3%的雙氧水下破壞1 h，基本無變化；在堿破壞下，于相對保留時間0.363產(chǎn)生了一個未知雜質(zhì)，雜質(zhì)量為0.3%，已知雜質(zhì)A的量有所增加，由0.3%增加至0.6%；在紫外光下光照72 h，相對保留時間0.4的未知雜質(zhì)由0.1%增加至0.2%，其他雜質(zhì)幾乎無變化。結(jié)果表明本品對熱、酸、氧穩(wěn)定，對堿、紫外燈光不穩(wěn)定，因此在本品的儲藏和運輸過程中應(yīng)注意避光和密封。

在各破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均在0.999以上，雜質(zhì)峰峰純度基本均達0.99以上，峰降解平衡在95%～105%之間，結(jié)果表明該方法專屬性良好，能檢測出本品在儲藏和運輸過程的極端條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。

2.4 檢測限、定量限

取2.2項的混合溶液適量，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）稀釋至一定濃度，2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，同時走空白基線，以儀器基線噪音3倍峰高作為檢測限（S/N≥3），儀器基線噪音10倍峰高作為定量限（S/N≥10），得各雜質(zhì)的定量限與檢測限見表3。

2.5 線性與范圍

精密稱取阿哌沙班及各雜質(zhì)對照品適量，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成適宜濃度，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以濃度-峰面積做曲線，結(jié)果見表4。

2.6 回收率試驗

取阿哌沙班各雜質(zhì)對照品適量，加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1 mL含各雜質(zhì)10.0 μg的混合儲備液。再精密量取混合儲備液1.0 mL，置10 mL量瓶中，用乙腈-水（35∶65，ν∶ν）稀釋制刻度，搖勻，即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密稱取阿哌沙班（130901）約10 mg，10份，一份加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為供試品溶液1；3份分別加入混合儲備液0.5 mL，再加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為50%供試品溶液2～4；3份分別加入混合儲備液1.0 mL，再加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為100%供試品溶液5～7；3份分別加入混合儲備液1.5 mL，再加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋至刻度搖勻，作為150%供試品溶液8～10。取上述對照品溶液、供試品溶液按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以峰面積外標法計算各供試品中各雜質(zhì)的含量，并計算回收率。結(jié)果見表5，各雜質(zhì)回收率良好。

2.7 精密度試驗

取阿哌沙班對照品（130901）6份，加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1 mL含阿哌沙班1 mg的供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。已知雜質(zhì)按峰面積外標法計算含量，結(jié)果顯示6份樣品均只檢出雜質(zhì)F和雜質(zhì)G，6份樣品中雜質(zhì)F和雜質(zhì)G含量RSD分別為2.99%和1.30%和重復(fù)性良好。

由不同人員在不同時間、不同儀器上對同一批號樣品測定12次各雜質(zhì)的平均含量分別為：雜質(zhì)F 0.020 1%、雜質(zhì)G 0.016 3%、未知單雜0.039%、總雜質(zhì)0.167%；RSD分別為：雜質(zhì)F 3.33%、雜質(zhì)G 9.84%、未知單雜9.66%、總雜質(zhì)9.61%，中間精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取阿哌沙班及各雜質(zhì)適量，加乙腈-水（35∶65，ν∶ν）溶解并稀釋制成每1 mL含阿哌沙班1 mg的供試品溶液、含各雜質(zhì)1 μg的混合雜質(zhì)對照品溶液；取上述供試品溶液和對照品溶液按2.1項下色譜條件進行測定，供試品溶液和對照品溶液在24 h內(nèi)都未產(chǎn)生任何新的雜質(zhì)，結(jié)果見表6和表7。

2.9 耐用性

柱溫、流動相、流量、緩沖鹽濃度發(fā)生微小改變，按2.1項下色譜條件進行測定，樣品中雜質(zhì)個數(shù)和雜質(zhì)量以及各成分峰之間的分離度幾乎無變化；但當(dāng)色譜柱發(fā)生改變時，雜質(zhì)分離度發(fā)生較大變化，但測定雜質(zhì)含量變化不是很大（見表8），由此可證明在色譜柱不發(fā)生變化的情況下，本方法的耐用性良好。

2.10 樣品檢測結(jié)果

依據(jù)上述方法測定3批樣品中8個雜質(zhì)的含量，結(jié)果見表9。由表可知，3批樣品中均只檢出雜質(zhì)F、雜質(zhì)G與未知單雜，且含量均符合規(guī)定。

3 討 論

3.1 測定波長的確定

在200～400 nm的波長范圍內(nèi)阿哌沙班、各雜質(zhì)進行波長掃描，結(jié)果具有不同的紫外特征峰，但在280 nm附近均有吸收，參考阿哌沙班片進口注冊標準（標準號：JX20120076）及文獻有關(guān)物質(zhì)的檢測波長，最終選擇280 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3.2 雜質(zhì)檢測進樣濃度的確定

根據(jù)化學(xué)藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則對有關(guān)物質(zhì)限度的要求，原料的雜質(zhì)報告限度、鑒定限度、質(zhì)控限度分別為0.05%，0.10%，0.15%（每日最大劑量<2 g），因此為了保證0.05%的雜質(zhì)能檢出，根據(jù)本品的檢測限試驗結(jié)果，以進樣10 μL計算，有關(guān)物質(zhì)檢查的質(zhì)量濃度至少應(yīng)為1.25 ng/10 μL/0.05%×10-3=0.25 mg/mL，為保證樣品中各雜質(zhì)檢出的準確性，確定有關(guān)物質(zhì)檢測質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，進樣量為10 μL。

4 結(jié)束語

通過上述實驗結(jié)果表明：在優(yōu)化阿哌沙班中8個已知雜質(zhì)測定的色譜條件下，破壞產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達到完全分離，主峰峰純度均達到0.999 5，雜質(zhì)峰峰純度基本均達0.99以上；各破壞樣品的物料平衡均在99.2%～102.8%之間，說明該方法專屬性良好，能檢測出阿哌沙班在儲藏和運輸過程的極端條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。

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（編輯：莫婕）