石河子地區棉花苗期葉斑病病原菌種類鑒定

(石河子大學農學院/新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2017.11.013

石河子地區棉花苗期葉斑病病原菌種類鑒定

李映程，張國麗，楊 超，任毓忠，李 卓，張 莉，李國英

(石河子大學農學院/新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室，新疆石河子 832003)

目的研究石河子地區棉花苗期葉斑病病原菌種類。方法棉花苗期，采集石河子地區典型葉斑病樣120個，用常規組織分離法進行分離和純化，共得到105個鏈格孢屬(Alternariaspp.)菌株，選取其中15個代表性菌株，通過致病性測定、常規形態學鑒定及組蛋白3基因序列分析，對病原菌種類進行鑒定。結果供試15個代表性菌株均具有致病性。形態學測定，可將其鑒定為A.alternata和A.tenuissima兩類；基于組蛋白3基因序列分析，前一類與A.alternata(AF404620、KF997067和KR866858)相似性達99%，后一類與A.tenuissima(KT384348)相似性達99%以上。結論2016年引起石河子地區棉花苗期葉斑病的病原菌為A.alternata和A.tenuissima。

棉苗葉斑病；病原菌；鑒定

0 引 言

【研究意義】棉花葉斑病是新疆棉花上的一種常見病害，但對其缺乏比較系統地研究。2016年4月下旬和整個5月北疆棉區低溫高濕，棉花苗期葉斑病大發生，發病率高達100%，盡快搞清其病原種類對其防治具有十分重要的意義。【前人研究進展】棉花葉斑病是一種世界性病害，其中鏈格孢菌(Alternariaspp)是一類重要的病原，但各地報道引起葉斑病的鏈格孢菌種類存在較大差異。田逢秀[1](1995)、簡桂良[2](2003)認為引起我國棉花輪紋斑的鏈格孢菌以大孢鏈格孢菌(A.macrospora)、細極鏈格孢(A.tenuissima)和棉鏈格孢菌(A.gossypina)等為常見；李莎[3](2011)認為引起輪紋斑病的鏈格孢菌94%由鏈格孢菌 (A.alternata)引起，6%由大孢鏈格孢菌(A.macrospora)引起；賈菊生[4]鑒定引起新疆棉花葉斑病的病菌主要是鏈格孢菌(A.alternata)和大孢鏈格孢菌(A.macrospora)。近年來研究證明，鏈格孢屬級特征明顯，種級特征變異較大，所以僅根據形態特征進行種的鑒定比較困難，特別是鏈格孢屬小孢子組的一些種，必須結合分子生物學的手段，才能將其準確鑒定到種[5，6]。【本研究切入點】根據王泰云[7](2014)、楊超[8](2017)研究，通過系統發育分析組蛋白3基因序列，可以較好的分辨出小孢子鏈格孢類群。研究通過組蛋白3基因序列分析，結合其形態特征，進一步對石河子棉區棉花葉斑病菌進行鑒定。【擬解決的關鍵問題】根據病原的形態特征，結合組蛋白3基因序列分析，進一步查明新疆石河子地區棉花苗期葉斑病的病原種類。

1 材料與方法

1.1 材 料

2016年春季由于石河子地區持續低溫多雨，棉花葉斑病大發生，為鑒定其病原，分別從石河子大學試驗站、新疆農墾科學院、121團、143團、石河子總場、148團進行調查，并采集具有典型葉斑癥狀的120個病樣供分離鑒定。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌分離與純化

采用常規組織分離法進行分離，首先將具典型癥狀的發病葉片用自來水清洗干凈，然后在病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm的小塊，用0.1%的升汞處理5～10 s，后用無菌水清洗3遍，再用無菌的吸水紙將病組織上的水分吸干，最后將其移入PDA平板上，將其置于25℃恒溫培養箱中，培養3 d后觀察分離結果，并采用常規稀釋法[9]進行單孢分離純化，將純化的菌株接于PDA斜面培養基上，培養5 d后置4 ℃冰箱中儲存備用。

1.2.2 病原菌的致病性測定

采用離體葉片接種法。采集植株相同部位的健康葉片，清洗干凈，用75%酒精輕輕擦拭葉片表面，消除雜菌，再用無菌的縫衣針輕輕刺傷葉片表面，4℃處理24 h后接種；用少量無菌水洗下PDA平板培養了7 d的分生孢子，用血球計數板測量孢子濃度，配置成1×107個/mL分生孢子的懸浮液，采用噴霧法進行接種，待葉片表面布滿小液滴為好，以無菌水為對照，置于(12×12) cm墊有濕潤無菌濾紙的發芽盒中，在智能光照培養箱中，白天18℃，夜間12℃培養，定期觀察并記錄發病情況。發病后，觀察其癥狀并進行分離，鏡檢與原接種菌的異同。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 病原菌的形態學鑒定

用刀片直接在病斑上刮取分生孢子，在光學顯微鏡下觀察其形態、顏色和分生孢子的縱橫隔膜數，并測量50個分生孢子的大小。在無菌操作下，根據采集地點和分離菌株的數量，選取15個具有代表性的菌株，分別將其轉接到PDA平板上，25℃恒溫培養7 d，觀察各菌落的顏色并記錄其形態特征。采用常規的玻片培養法[10]，25℃下培養5 d，觀察并記錄分生孢子的著生狀態并拍照，參照張天宇[11]對病原菌進行形態學鑒定。

1.2.3.2 病原菌的分子生物學鑒定

將供試15個代表性菌株轉接到PDA平板上，25℃恒溫培養7 d后，用滅菌刀片刮取菌絲于無菌的研缽中，加液氮冷凍充分研磨，收集研磨物，采用BioFlux試劑盒提取真菌基因組DNA。采用引物H3-1a(5’-ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG-3’)和H3-1b (5’-GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT-3’，由上海生物工程股份有限公司合成)，PCR擴增各試驗菌株組蛋白3基因的部分編碼序列[7]。反應程序：96℃預變性2 min；96℃變性15 s，55℃退火30 s，75℃延伸35 s，共30個循環；最后72℃延伸2 min，反應體系為25 μL。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，在凝膠成像儀上觀察并拍照。在ZF-90型多功能暗箱式紫外透射儀下切取目的條帶，使用全式金凝膠回收試劑盒(Easy Pure Quick Gel Extraction Kit)回收目的片段。將回收純化的目的片段直接與pMD19-T載體連接，在4℃下孵育過夜。連接產物通過熱激轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。轉化菌液涂布于加有Amp的麥康凱平板上，37℃恒溫培養過夜，直至長出單菌落。挑取白斑菌落，進行PCR檢測篩選陽性克隆，篩選出的陽性轉化子穿刺于LB固體培養基中，送到上海生物工程有限公司測序。

將供試菌株的組蛋白3基因部分序列的測序結果在NCBI上進行Blast比對，應用MEGA 5.0軟件中的臨近法(neighbor-joining，NJ)構建病原菌系統發育樹，分析菌株間的親緣關系，確定分類地位。

2 結果與分析

2.1 棉苗葉斑病的癥狀

2016年經在石河子地區6個棉田單位調查，棉花葉斑病在石河子大學試驗站、新疆農墾科學院、121團、143團、石河子總場、148團均發生嚴重，發病率高達100%。其田間癥狀表現為：發病初期子葉上產生近圓形或不規則形的黑褐色小點，后逐漸擴展成近圓形或不規則形，直徑2～3 mm的病斑，邊緣常有清晰的黃褐色暈圈，嚴重時病斑相互愈合形成較大的褐色枯死斑，引起葉片枯焦或病斑脫落成穿孔。人工接種一般5 d左右開始出現水浸狀的斑點，稍微擴展后組織壞死，產生與田間相似的癥狀 。圖1

2.2 病原菌分離及代表性菌株的選擇

從石河子地區共采集具有典型葉斑癥狀的病樣120個，成功分離出105個鏈格孢屬(Alternariaspp.)菌株，分離率為87.50%。依據采集地點、分離菌株的數量，選取15個具有代表性的菌株，供病原鑒定。表1

表1 菌株編號及來源
Table 1 Number and source of strain

序號Ordernumber菌株編號Strain采集地點Origin采集時間Acquisitiontime1121-1石河子地區121團2016年5月24-3石河子總場3連2016年5月34-9Ld石河子總場9連2016年5月4148-4-2石河子地區148團2016年5月5148-10-1石河子地區148團2016年5月6148-11-3石河子地區148團2016年5月7S1石河子大學試驗站2016年4月8SN2石河子農墾科學院2016年5月9121-2石河子地區121團2016年5月10143-9-1石河子地區143團2016年5月11143-8-8石河子地區143團2016年5月11143-2石河子地區143團2016年5月134-9Lx石河子總場9連2016年5月144-9-4石河子總場9連2016年5月15148-8-3石河子地區148團2016年5月

2.3 病原菌的致病性測定

室內接種5 d后，葉片開始出現黑褐色斑點，以后組織壞死呈褐色斑點，癥狀與田間病害癥狀相似，15個代表性菌株均會引起葉片發病，對照組棉花葉片則未出現癥狀。從發病組織中再次分離的菌株與原接種菌形態特征一致。根據柯赫氏法則，說明供試菌株就是造成田間棉花葉斑病的病原菌。圖1

注：A:接種細極鏈格孢菌；B:接種鏈格孢菌；C:田間癥狀

Note: A:A.alternatainoculated； B: extremely fineA.tenuissimainoculated； C: symptoms in the field

圖1 棉花苗期葉斑病癥狀
Fig.1 Symptoms of leaf spot of cotton seedling

2.4 棉花葉斑病的病原菌鑒定

2.4.1 形態學鑒定

通過觀察，可將供試菌株分為兩類。一類在PDA培養基上培養7 d后，其菌落中央略微隆起，褐色或深褐色，毛氈狀，分生孢子梗單生或簇生，直立或彎曲，分生孢子單生或2～11個串生，黃褐色或褐色，棒狀、倒梨形，有喙或無喙，喙孢錐形或短柱狀，孢身表面有刺突，具0～7個橫隔，0～2個縱膈或斜隔，大小為(12.5～35.0) μm×(5.0～12.5) μm。將其初步鑒定為A.alternata。圖2A、C、E

另一類在PDA上培養7 d產生的菌落，中央略微隆起，灰白色至深灰綠色或深橄欖綠色，絨毛狀。分生孢子梗單生或簇生，直立或曲膝狀彎曲，分生孢子倒棍棒形、卵圓形或近橢圓形，淡褐色至暗褐色，單生或7～15個串生，有喙或無喙，喙孢錐形或短柱狀，孢身表面有刺突，具0～6個橫隔，0～2個縱隔或斜隔，大小為(7.5～30.0) μm×(5.0～10.0) μm。將這些菌株初步鑒定為A.tenuissima(圖2 B、D、F)。可見兩者在形態上比較相似，差別較小。圖2

2.4.2 分子生物學鑒定

采用H3-1a/H3-1b引物對15種代表性菌株的基因組DNA進行擴增，分別擴增出大小為546和494 bp的片段。經BLAST比對，所測1～6號菌株與A.tenuissima(KT384348)相似性達100%，與A.tenuissima(KT384290)相似性達99%；7～15號菌株與A.alternata(AF404620、KF997067和KR866858)相似性達99%。表1，圖3

通過構建系統進化樹發現，用組蛋白3基因很容易將供試菌株區分為兩個類群，即A.alternata和A.tenuissima，且A.alternata比例高于A.tenuissima，但所有供試菌株與大鏈格孢A.macrospora都不聚在一起，說明在石河子棉區苗期暫未發現由A.macrospora引起的葉斑病。圖4

圖2 鏈格孢(A、C、E)和細極鏈格孢(B、D、F)菌落、分生孢子及著生方式
Fig.2 A.alternata (A、C、E) and A.tenuissima (B、D、F) colonies, sub spore and the mode of production

注：第1～6為A.tenuissima；7～15為A.alternata；16為陰性對照；M為標準分子大小DL，2 000 bp

Note： 1-6:A.tenuissima; 7-15:A.alternataand 16: negative control; lane M:molecular size marker DL, 2,000 bp

圖3 病原菌組蛋白3基因PCR擴增
Fig.3 The result of the PCR of pathogen's histone 3 gene segment

圖4 病原菌與相似種組蛋白3基因序列發育樹
Fig.4 Dendrogram of histone 3 gene sequences of the pathogen and its related

3 討 論

據劉偉[12]報道，棉花葉斑病多發生于棉花幼苗期子葉及成株期葉片，若此時陰雨連綿、大量降雨，氣溫偏低，易造成該病流行，這與2016年4～5月石河子地區棉花葉斑病大爆發的情況類似。

關于由鏈格孢菌引起的棉花葉斑病病原種類，不同地區存在明顯差異。Sciumbato G L和Pinckard J A[13](1972)報道印度棉花輪紋斑病是由大孢鏈格孢菌引起的；美國的密蘇里、路易斯安那州以及以色列是由大孢鏈格孢造成的。在國內，簡桂良[2](2003)認為棉輪紋斑病由多種鏈格孢菌引起，其中主要為A.tenuissima。有文獻報道[14]，棉輪紋斑病以大孢鏈格孢(A.macrocpora)、細極鏈格孢(A.tenuissima)和棉鏈格孢(A.gossypina)等為常見種，最常見的為大孢鏈格孢(A.macrospora)。李莎等[3]經鑒定，認為在國內該病94%主要由鏈格孢菌(A.alternata)引起，6%由大孢鏈格孢菌(A.macrospora)引起。賈菊生[4](1994)通過采集南北疆病樣鑒定，認為石河子和瑪納斯棉區的葉斑病病原為A.arternata。這次以形態學特征同時結合組蛋白3基因序列分析，將引起石河子棉區苗期葉斑病的病原鑒定為兩個種，即A.alternata和A.tenuissima，沒有發現大孢鏈格孢(A.macrocpora)和棉鏈格孢(A.gossypina)。

在鏈格孢菌中，A.alternata和A.tenuissima都屬于小孢子種。大量研究證明，鏈格孢菌的分生孢子梗及孢子的形態、大小受環境影響較大，即使在相同的培養條件下，不同種孢子形態容易趨同，給準確鑒定造成很大障礙，特別是鏈格孢菌小孢子種在人工培養條件下孢子形狀、大小有趨同傾向，單憑形態學特征很難將其鑒定到種。近年來，結合分子生物學技術在病原菌鑒定方面的應用越來越多。王洪凱等[15]研究發現ITS、mt LSU、b/ eta-tubulin、EF-1α、CAL、ACT和CHS等核苷酸序列在小孢子鏈格孢種間差異很小或沒有差異，不能準確區分小孢子鏈格孢種。研究采用特異性引物H3-1a/H3-1b，對組蛋白3基因序列分析，能夠很好的將這兩個小孢子鏈格孢種進行區分，這一研究結果與王泰云等[7]報道的結果一致。

4 結 論

經對石河子棉區所采120個典型葉斑病樣分離培養和鑒定，分離出105個鏈格孢屬(Alternariaspp.)菌株，分離率為87.50%。選用其中15個代表性菌株進行致病性測定都可引起葉斑病，說明鏈格孢菌 (Alternariaspp.)是引起葉斑病的主要病原。經形態學鑒定和致病性測定,以及采用特異性引物H3-1a/H3-1b，對組蛋白3基因序列分析，能夠很好將其分為兩個種，即鏈格孢(A.alternata)和細極鏈格孢(A.tenuissima)，其中鏈格孢占60%，細極鏈格孢占40%。兩者形態比較相似，僅憑形態學很難將兩者進行區別，通過系統發育分析組蛋白3基因序列，能夠很好的將兩者區別開來。2016年在石河子棉區苗期嚴重發生的葉斑病，主要由鏈格孢(A.alternata)和細極鏈格孢(A.tenuissima)引起。

參考文獻(References)

[1] 謝浩,楊海峰.新疆經濟作物病蟲害防治[M].新疆科技衛生出版社:1995.

XIE Hao,YANG Hai-feng. (1995).PreventionandcontrolofeconomiccropdiseasesinXinjiang[M]. Xinjiang Science，Technology and Health Press. (in Chinese)

[2]簡桂良,鄒亞飛,馬存.抗蟲棉的病害及其防治[J].中國棉花,2003,(11):5-6.

JIAN Gui-liang, ZOU Ya-fei, MA Cun. (2003). Disease and control of insect resistant cotton [J].ChinaCotton, (11):5-6. (in Chinese)

[3]李莎.棉花輪紋斑病及其拮抗細菌的篩選和鑒定[D].北京：中國農業科學院碩士學位論文,2011.

LI Sha. (2011).Alternarialeafspotofcottonandscreeningandidentificationofitsantagonisticbacteria[D]. Master Thesis. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. (in Chinese)

[4]賈菊生,胡守智.新疆經濟植物真菌病害志[M].新疆科技衛生出版社:1994.

JIA Ju-sheng, HU Shou-zhi. (1994).Xinjiangeconomicplantfungidisease[M]. Xinjiang Science, Technology and Health Press. (in Chinese)

[5]張敬澤,張天宇,王瑾.鏈格孢屬種間培養性狀的分類研究[J].浙江農業大學學報(農業與生命科學版),1997,(5):29-32.

ZHANG Jing-ze, ZHANG Tian-yu, WANG Jin. (1997). Classification of interspecific culture characters of Alternaria [J].JournalofZhejiangUniversity(AgricultureandLifeSciences) , (5): 29-32. (in Chinese)

[6] Kusaba, M., & Tsuge, T. (1994). Nuclear ribosomal dna variation and pathogenic specialization in alternaria fungi known to produce host-specific toxins.Applied&EnvironmentalMicrobiology, 60(9): 3,055-3,062.

[7] Wang, T., Zhao, J., Sun, P., & Wu, X. (2014). Characterization of alternaria, species associated with leaf blight of sunflower in china.EuropeanJournalofPlantPathology, 140(2): 301-315.

[8]楊超,張國麗,任毓忠,等.北疆沿天山北坡一帶葡萄穗軸褐枯病病原菌的鑒定[J].植物保護,2017,(3):129-135.

YANG Chao, ZHANG Guo-li, REN Yu-zhong, et al. (2017). Identification of the Pathogens Causing Spike-stalk Brown Spot on Grape on the northern slope of Tianshan Mountains area [J].PlantProtection, (3):129-135. (in Chinese)

[9]龔國淑,徐琴,張敏,等. 一種簡便的病原真菌單孢分離方法研究[J].玉米科學,2010,18(1):126-127.

GONG Guo-shu, XU Qin, ZHANG Min, et al. (2010). A Simple Method for Single Fungal Spore Isolation [J].JournalofMaizeSciences,18(1):126-127. (in Chinese)

[10]方中達.植病研究方法[M].北京:中國農業出版社, 1998: 343-345.

FANG Zhong-da. (1998).MethodologyforPlantPathology[M]. Beijing: China Agriculture Press:343-345.(in Chinese)

[11]張天宇.中國真菌志(第十六卷)鏈格孢屬[M].北京:科學出版社,2003.

ZHANG Tian-yu. (2003).ChineseFungiAnnals(thesixteenthVol.).Alternaria[M]. Beijing: Science Press. (in Chinese)

[12]劉偉.低溫抑制棉花對鏈格孢菌抗性應答反應的初步研究[D].北京：中國農業科學院碩士學位論文, 2014.

LIU Wei. (2014).PrimaryResearchsontheSuppressionofCotton(GossypiumhirsutumL.)DefenseResponsetoPathogenofAlternariaalternataCausedbyChillingStressPretreatment[D].Master Thesis. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. (in Chinese)

[13] Sciumbato, G. L., & Pinckard, J. A. (1974). Alternaria macrospora leaf spot of cotton in Louisiana in 1972.PlantDiseaseReporter, 58(3)：201-208.

[14] 中國農業科學院植物保護研究所. 中國農作物病蟲害[M].北京：中國農業出版社,1979.

Institute of Plant Protection (IPP),ChineseAcademyofAgricultrualSciences(CAAS). (1979).CropdiseasesandinsectpestsinChina[M]. Beijing: China Agriculture Press. (in Chinese)

[15]王洪凱,張天宇,張猛.鏈格孢屬真菌分類研究進展[J].山東農業大學學報(自然科版),2001,32(3):406-410.

WANG Hong-kai, ZHANG Tian-yu, ZHANG Meng. (2001). Advances on taxonomic studies of the genus Aliternaria [J].JournalofShandongAgriculturalUniversity(NaturalScience) , 32(3):406-410. (in Chinese)

IdentificationofPathogensCausingLeafSpotDiseaseatCottonSeedlingStageinShiheziArea

LI Ying-cheng, ZHANG Guo-li, YANG Chao, REN Yu-zhong, LI Zhuo, ZHANG Li, LI Guo-ying

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

ObjectiveThe aim of the study is to verify the pathogens that cause cotton seedling leaf spot in Shihezi area.Method120 samples of cotton leaf spot were collected from Shihezi area, and 105 strains ofAlternariaspp were isolated and purified by conventional method, and 15 representative strains were identified through survey of morphological characteristics, test of pathogenicity and sequence analysis of histone 3 gene.ResultThe selected 15 representative strains were pathogenic. The pathogens were preliminarily identified asA.alternataandA.tenuissimaaccording to morphological characteristics, respectively. Based on histone 3 gene sequence analysis, the results showed that the similarity of nucleotide homogeneity ofA.alternata(AF404620, KF997067 and KR866858) was 99% andA.tenuissima(KT384348) was more than 99%, respectively.ConclusionThe pathogens causing cotton seedling leaf spot areA.alternataandA.tenuissimain Shihezi in 2016.

cotton seedling leaf spot; pathogen; identification

Supported by: Selection of High-yield and Fine-quality Peanuts Varieties and Study on the Cultivation(2016B01008-2)

LI Guo-ying(1941-), male, native place: Hebei, Professor, research field: plant pathogenic fungi and fungal diseases. (E-mail)lgyshzu@163.com

ZHANG Li(1970-), female, native place: Jiangsu, Ph. D., research field: plant pathology. (E-mail)1602784618@qq.com

S435.621

A

1001-4330(2017)11-2060-07

2017-08-28

科技部中小企業創新項目(14C26216513812)

李映程(1994-)，男，甘肅人，碩士，研究方向為植物病理學，(E-mail)1363731850@qq.com

李國英(1941-)，男，河北人，教授，研究方向為植物病原真菌和真菌病害，(E-mail)lgyshzu@163.com

張莉(1970-)，女，江蘇人，教授，博士，研究方向為植物病理學，(E-mail)1602784618@qq.com