補精益視片對SD大鼠慢性高眼壓模型外側膝狀體腦源性神經營養因子表達的影響

李翔 柯欣怡,2 劉紅佶 袁銘悅 李祥玉 李華宏 王泰 田夢瑤 楊鳳嬌

補精益視片對SD大鼠慢性高眼壓模型外側膝狀體腦源性神經營養因子表達的影響

李翔1柯欣怡1,2劉紅佶3袁銘悅3李祥玉3李華宏3王泰3田夢瑤3楊鳳嬌3

目的觀察補精益視片對慢性高眼壓模型(elevated intraocular pressure,EIOP)大鼠外側膝狀體中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表達的影響,探討補精益視片視功能保護的作用機理。方法選取30只SD大鼠,隨機分為對照組、給藥組及模型組,每組各10只。采用烙閉鞏膜上靜脈方法制作慢性高眼壓大鼠動物模型,每組連續灌胃8周后處死大鼠,觀察補精益視片對EIOP大鼠眼壓、外側膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)BDNF表達的影響。結果 相比造模前,從造模即刻開始至造模后8周,給藥組及模型組大鼠的眼壓均有明顯升高,差異具有統計學意義(均P<0.01)；造模后8周與造模即刻相比,給藥組眼壓有降低趨勢,差異有統計學意義(P<0.01),而模型組眼壓無降低趨勢；模型組BDNF總面積(55863.31±10264.399 S/μm2)及積分光密度(15931.84±3403.742)較對照組(114106.08±17849.482 S/μm2,29209.88±5725.992)及給藥組(97567.06±22224.041 S/μm2,29199.65±7865.087)明顯偏低,差異具有統計學意義(均P<0.01),給藥組BDNF總面積及積分光密度較對照組稍偏低,差異無統計學意義(P>0.05)。結論補精益視片能補精益視片能促進慢性EIOP模型大鼠LGN中BDNF的表達,從而發揮視功能保護作用。

青光眼； 補精益視片； 視功能保護； 大鼠慢性高眼壓模型； 腦源性神經營養因子； 外側膝狀體

青光眼是一類以視神經萎縮和進行性視野缺損為共同特征的眼病,是目前世界第一位的不可逆性致盲眼病,發病率和致盲率在世界范圍內都在不斷上升[1]。根據世界各地流行病學統計資料估算,2020年全球患者將上升至7960萬,雙眼失明人數也隨之上升為1120萬,病史在16 年以上青光眼患者至少有一眼盲的概率約為28.6%,而2020年中國的青光眼患者人數將達到600萬[2]。很多青光眼患者早期發病隱匿,發現時已有嚴重視功能損害。青光眼作為一種不可逆致盲眼病嚴重影響了人類的生存質量,做好青光眼理論研究、診斷及治療工作具有重大意義。

本實驗通過烙閉上鞏膜靜脈的方法[3]誘導產生眼壓維持穩定、持續時間較長的慢性高眼壓(elevated intraocular pressure,EIOP)動物模型,選取補精益視片作為干預藥物,通過觀察其對EIOP大鼠外側膝狀體中BDNF含量的影響來探討補精益視片視功能保護的作用機理,為補精益視片在青光眼治療的臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1實驗動物 選取健康清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不受限,8～12周齡,體重約160～200g,并在裂隙燈下檢查見眼前節無異常,瞳孔對光反射正常,眼壓測定正常,無歪頸者共30只。飼養室溫20～25℃,空氣流通,相對濕度55%～75%,12小時光照維持,晝夜循環。自由攝食飲水。

1.1.2分組

以SPSS統計軟件產生隨機數字,將大鼠分為3組:給藥組、對照組及模型組,每組各10只。

1.2 藥品與試劑

補精益視片(批號20130215)購于成都中醫藥大學附屬醫院。BDNF 多克隆抗體,購于博士德生物工程有限公司。FFA固定液,由成都中醫藥大學附屬醫院病理科提供。

1.3 實驗方法

1.3.1造模方法

選擇烙閉鞏膜上靜脈的方法進行造模:模型組與給藥組在眼科手術顯微鏡下烙閉右眼上鞏膜靜脈進行造模處理,對照組暴露鞏膜上靜脈后未行上鞏膜靜脈熱處理,為假烙閉。均對其右眼進行處理,左眼不做處理。

1.3.2給藥方法

每天在16:00～18:00之間給大鼠進行灌胃,連續灌胃8周.對照組、模型組每天予3ml生理鹽水灌胃。將補精益視片磨成粉狀,加入生理鹽水,每18g配置成100ml混懸液,濃度為0.18g/ml,給藥組混懸液灌胃1.8g/kg.d。實驗中,根據大鼠體重選取混懸液劑量,每只大鼠每天灌胃總量3ml,所需混懸液劑量不足3ml的用生理鹽水補足。每2周稱體重1次,根據大鼠體重調整給藥量。實驗過程中動物死亡7只。

1.3.3檢測指標及方法

1.3.3.1眼壓測量

采用TONO-PEN筆試眼壓計每日固定時間進行眼壓測量。分別測量3組大鼠造模前、造模后即刻、造模后2周、造模后4周、造模后6周、造模后8周右眼的IOP。

1.3.3.2尼氏小體含量的測定

(1)取材及固定:給藥8周后處死大鼠,方法使用頸椎脫臼法。在顯微鏡下完整剝出大鼠腦組織,將剝下的腦組織置于固定液中固定72小時后,參照大鼠腦組織解剖圖譜,按大鼠中樞神經解剖定位,根據鄰近核團形狀判斷,切取LGN,梯度脫水、透明、浸蠟、包埋,常規切片4um,烘干備用。(2)免疫組化檢測LGN內BDNF的表達水平:所用抗體為大鼠 BDNF 多克隆抗體。石蠟切片脫蠟,蒸餾水沖洗,滴加一抗,37 ℃孵育1～2 h； PBS 沖洗,滴加二抗,37℃孵育10～30 min,PBS沖洗；顯色劑顯色,充分沖洗復染封片。陽性結果判定:反應部位產生棕黃色沉淀物,位于神經元周圍。半定量分析:BDNF 染色的組織內出現細顆粒狀、細絲狀棕黃色著色為BDNF 陽性染色。每張切片隨機選5個視野,每組共30個視野,用Mias-2000型圖形圖像分析儀測量LGN部位BDNF陽性染色灰度,取每個視野均值代表該切片的測量值,表示BDNF的表達強度。

1.4 統計方法

2 實驗結果

2.1 眼壓

各組大鼠造模前后及組間眼壓比較見表1。由表1可見,造模前比較各組之間IOP,差異無統計學差異(均為P>0.05)。造模后即刻,對照組IOP較造模前略有升高,但前后比較無統計學差異(P>0.05)；給藥組、模型組IOP較造模前升高明顯,差異有統計學意義(P<0.01)；造模后即刻,給藥組、模型組與對照組IOP相比,差異有統計學意義(P<0.01)。造模后8周,給藥組及模型組IOP與造模前相比,差異有統計學意義(P<0.01)；造模后8周,與造模后即刻相比,給藥組差異有統計學意義(P<0.01),模型組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 補精益視片對慢性EIOP大鼠外側膝狀體BDNF表達的影響

結果見表2,圖1-3。由表2可見:各組以對照組BDNF總面積和積分光密度最高；給藥組BDNF總面積和積分光密度相較對照組稍有偏低,差異無統計學意義(P>0.01)；模型組BDNF總面積和積分光密度相較對照組及給藥組均明顯偏低,差異具有統計學意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠組間及造模、用藥前后眼壓比較(單位:mmHg)

注：與對照組相比,▲P<0.01；與給藥組相比,★P<0.01

表2 每組大鼠LNG BDNF比較

注：與對照組相比,▲P<0.01；與給藥組相比,★P<0.01

圖1 對照組LGN BDNF染色圖(×200) 圖2 模型組LGN BDNF染色圖(×200) 圖3 給藥組LGN BDNF染色圖(×200)

3 討論

作為目前世界第一位的不可逆性致盲眼病,青光眼的發病機制仍在進一步研究中。正常視覺的形成主要與視網膜、外側膝狀體(lateral geniculate nucleus,LGN)、視皮質有關。視路中各級神經元對視功能的維持都有重要作用。青光眼的視功能障礙是從視網膜到中樞視覺系統廣泛區域發生損傷的過程,青光眼的神經損害包括了整個視路,青光眼是一種中樞神經退行變性疾病[4]。神經退行性病變的特征是跨神經元變性[5],視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells,RGCs)的死亡對LGN、視皮質等產生影響,損傷的LGN、視皮質等又反過來對殘存的RGCs產生影響。中樞視覺系統的損害不僅僅作為一種結果,還在青光眼視功能損傷的進展中起了重要作用。故僅僅將將眼壓控制到安全水平并不能完全阻止青光眼的繼續進展[6],青光眼的治療還應針對繼發性損害對視功能進行保護。青光眼的視功能保護已成為青光眼研究的熱點難點問題。作為視路上直接接受視神經纖維投射的重要中轉核團,外側膝狀體在中樞視覺系統損傷研究中倍受關注。BDNF是一種小分子量的堿性蛋白,在中樞神經系統中主要在神經元內合成,是一種具有代表性的神經營養因子在視覺系統中,BDNF是視網膜神經節細胞賴以生存的主要神經營養因子之一,目前已廣泛認同腦源性神經生長因子的剝奪是RGCs凋亡的誘發因素[7]。當視神經損傷后,RGCs本身存在的保護性反應表現之一就是BDNF及其受體的表達增高。BDNF對青光眼視功能保護的研究具有重大意義。所以,選擇LGN 部位的BDNF的表達作為觀察指標對說明視功能保護的機理具有一定的作用。

青光眼屬中醫“五風內障”范疇,其視功能損害導致的特異性視神經萎縮和視野缺損類似于“青盲”,主要病機是肝腎虛損、脈絡瘀滯,滋養肝腎、活血通絡是防治青光眼視功能損害的基本方法。以往的研究也證實補腎活血法(杞菊地黃丸和復方丹參片合用)對SD大鼠慢性EIOP模型視網膜、視神經、視中樞損傷及眼壓控制后青光眼視功能均有一定的保護作用[8-12]。以滋養肝腎、活血化瘀為主要功效的補精益視片(原名益視片)已在視功能的保護及改善方面取得了良好療效[13]。

本實驗通過觀察慢性EIOP 大鼠LGN 部位BDNF的表達,進一步探討補腎活血中藥補精益視片對青光眼視功能保護的作用機理。結果表明:慢性高眼壓模型會造成LGN BDNF表達的減少,使用補精益視片提高了慢性高眼壓模型BDNF表達。在慢性高眼壓的影響下,外側膝狀體 BDNF的表達明顯減少,而BDNF是RGCs賴以生存的主要神經營養因子之一,LGN BDNF表達的減少會削弱對視覺通路中的下級神經元的下行營養支持而加重RGCs的病變,這即前所言跨神經元變性的病理循環。實驗結果提示補精益視片通過提高慢性高眼壓模型BDNF表達,一方面增強LGN細胞的存活能力,減少死亡,另一方面改善了對下級神經元的下行營養支持,從而發揮其治療作用。實驗結果表明,補精益視片可作為臨床青光眼視神經保護藥物推廣應用。

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EffectsofBuJingYiShitabletsonexpressionofbrain-derivedneurotrophinfactorinlateralgeniculateinratmodelofchronicelevatedintraocularpressure

LIXiang1,KEXin-yi1,2,LIUHong-ji3,YUANMing-yue3,LiXiang-yu3,LIHua-hong3,WANGTai3,TIANMeng-yao3,YANGFeng-jiao3

(1.DepartmentofOphthalmology,TheTeachingHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610072;2.LongquanyiDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicial,Chengdu,Sichuan,610100 ;3.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveTo observe the effect of BuJingYiShi tablets on the expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) in lateral geniculate nucleus(LGN) in rat model of chronic elevated intraocular pressure (EIOP),and explore the mechanism of it initially．MethodsThe rats were randomly divided into 3 groups:control group,model group and treatment group,10 rats in each group.The model of chronic EIOP was established by unilaterally cauterizing 3 episcleral vessels.After given BuJingYiShi tablets and normal saline for 8 weeks,killed the rats and taken out the brains.IOP,expression of brain-derived neurotrophic factor in lateral geniculate nucleus(LGN)were observed.ResultsImmediately modeling and 8 weeks after-modeling,IOP were highly significant different from before modeling(allP<0.01).there was a decreasing tendency in treatment group between 8 weeks after-modeling and immediately modeling (P<0.01).While model group was not statistically significant(P>0.05).The total area(55863.31±10264.399 S/μm2)and integrated optical density (15931.84±3403.742)of BDNF in model groups were lower than treatment group(114106.08±17849.482 S/μm2,29209.88±5725.992)and control group(97567.06±22224.041 S/μm2,29199.65±7865.087)(allP<0.01);Though total area and integrated optical density in treatment group were little lower than control group,there was no significant difference in statistics(P>0.05 ).ConclusionBuJingYiShi tablets can protect the visual function on the rat model of chronic EIOP by improving the expression of BDNF.

Glaucoma; BuJingYiShi tablets; Optic neuroprotection; The rat model of chronic elevated intraocular pressure; Brain-derived neurotrophic factor; Lateral geniculate nucleus

1.610072,四川成都,成都中醫藥大學附屬醫院；2.610100,四川成都,龍泉驛區中醫醫院；3.610075,四川成都,成都中醫藥大學

李翔,教授,E-mail:jeannelxiang@126.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.005

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