圓錐角膜組織與正常角膜組織差異蛋白的表達(dá)

高娜 任麗

圓錐角膜組織與正常角膜組織差異蛋白的表達(dá)

高娜1任麗2

目的運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),比較圓錐角膜組織和正常角膜組織的差異表達(dá)蛋白,篩選出圓錐角膜特異性分子標(biāo)記物,探討其與圓錐角膜發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。方法收集12例圓錐角膜組織和4例正常人角膜組織,提取角膜組織總蛋白,行固相PH梯度雙向凝膠電泳,分析凝膠電泳圖譜,篩選差異表達(dá)蛋白,采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF-MS)和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果圓錐角膜組織和正常角膜組織的雙向電泳代表膠的蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1035 和1070,匹配點(diǎn)數(shù)為869個(gè),匹配率為84%。選取有明顯表達(dá)差異的7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn),其中6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在圓錐角膜組織中表達(dá)下調(diào),1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)。這7 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)黏附蛋白(TGFBIp/βig-h3)、VI型膠原蛋白α1鏈前體(collagen alpha-1(VI)chain precursor)、αA-晶體蛋白(alpha-crystallin A)、βB-晶體蛋白(alpha-crystallin B)、βB2-晶體蛋白(beta-crystallin B2)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase)、碳酸酐酶(carbonic anhydrase),除VI型膠原蛋白α1鏈前體在圓錐角膜組織中表達(dá)上調(diào)外,其余6個(gè)蛋白成分在圓錐角膜組織中均表達(dá)下調(diào)。結(jié)論TGFBIp/βig-h3、alpha-crystallin A、alpha-crystallinB 、beta-crystallin B2、glutamine synthetase、collagen alpha-1(VI)chain precursor6種在圓錐角膜中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)成分可能與圓錐角膜發(fā)病相關(guān)。

圓錐角膜; 比較蛋白質(zhì)組學(xué); 基質(zhì)輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF-MS)

圓錐角膜(keratoconus)是一種以角膜擴(kuò)張為特征,致角膜中央部向前呈圓 錐形凸起,及產(chǎn)生高度不規(guī)則近視散光和不同視力損害的原發(fā)性疾病。若病變持續(xù)發(fā)展,最終的結(jié)果是行角膜移植術(shù)。所以探明病因及發(fā)病機(jī)制,采取有效的控制手段,是防治圓錐角膜的根本。

圓錐角膜病因錯(cuò)綜復(fù)雜,其發(fā)生是一個(gè)多因素、多基因及多途徑改變的過程。目前難以用一種理論來解釋所有的病例。以往的研究大多在基因水平或者是對(duì)某些特定的分子做相應(yīng)分析,從而推測(cè)圓錐角膜可能的發(fā)病機(jī)理,其局限性在于DNA或RNA水平的改變并不能完全 反應(yīng)蛋白質(zhì)水平的變化(如信使RNA與蛋白質(zhì)兩者的相關(guān)系數(shù)大約在0.4～0.5之間)或者只能反應(yīng)疾病的部分特征,若能從蛋白質(zhì)整體水平直接入手來研究圓錐角膜,并與圓錐角膜基因組、轉(zhuǎn)錄組等方面的研究結(jié)果相互整合、互相驗(yàn)證,無疑將更加全面而真實(shí)地揭示圓錐角膜發(fā)病的本質(zhì),也將為圓錐角膜的病因發(fā)病學(xué)、診斷和防治開辟新的思路、提供新的線索。蛋白質(zhì)組學(xué)為我們提供了新的方法和思路。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要包括以下三個(gè)方面:(1)蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定和轉(zhuǎn)錄后修飾的微特征研究;(2)比較蛋白質(zhì)組學(xué),比較疾病與正常狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)的差異,為疾病的診斷尋找生物學(xué)標(biāo)志;(3)通過各種技術(shù),如質(zhì)譜技術(shù)和酵母雙雜交體系對(duì)蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間相互作用的研究,并繪制蛋白質(zhì)作用的圖譜。在與臨床的結(jié)合應(yīng)用中最常用的是比較蛋白質(zhì)組學(xué),通過生理和病理?xiàng)l件下(如疾病狀態(tài)或疾病的不同發(fā)展階段)蛋白質(zhì)組各成員表達(dá)水平、翻譯后修飾等情況進(jìn)行比較研究,發(fā)現(xiàn)和鑒定出有特征性的蛋白質(zhì),從而為疾病的發(fā)病機(jī)制,診斷及治療的研究提供理論依據(jù)。

基于以上認(rèn)識(shí),為了闡明圓錐角膜的發(fā)病機(jī)制和建立有效的治療和預(yù)防方法,本研究應(yīng)用固相PH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)分離圓錐角膜病變組織及正常角膜組織的總蛋白質(zhì),建立雙向電泳圖譜,并用基質(zhì)輔助激光解吸離子化一串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF-MS)分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,以期篩選出圓錐角膜的特異分子標(biāo)志物,為圓錐角膜發(fā)病機(jī)制的闡明提供新的方法和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

12例圓錐角膜組織來源于行部分穿透性角膜移植手術(shù)的16～26歲圓錐角膜患者,患者術(shù)前完善輔助檢查,排除全身結(jié)締組織性疾病及其他全身性疾病,術(shù)中選用7.0～7.75mm大小環(huán)鉆鉆取病變角膜組織,術(shù)后均取部分病變組織經(jīng)中山眼科中心病理室確診。4例正常角膜組織由眼庫(kù)提供。直徑為10～12mm,尸眼均于死亡后4～16小時(shí)取材。將收集好的角膜組織置于 eppendorf tube中,-80°C冰箱深低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織總蛋白提取-80℃

將收集的圓錐角膜組織隨機(jī)分為4組,每組3例,分別編號(hào)為l、2、3、4組,正常角膜組織一例為一組,分別編號(hào)為5、6、7、8組。采用眼科顯微角膜剪于冰上充分剪碎角膜組織,將各組角膜組織碎片分別收集于預(yù)冷的EP管中,按照l: 3體積比例加入裂解緩沖液充分混勻后,采用組織勻漿機(jī)冰上勻漿,勻漿強(qiáng)度選 用3.5級(jí),每次勻漿8秒,間隔30秒后重復(fù)勻漿,共3次;勻漿結(jié)束后用封口膠將 EP管封口,置于液氮中2min,再于37°C水域中復(fù)溫、解凍,反復(fù)3次。最后用低 溫高速離心機(jī)4°C150009/min離心60min,小心吸取上清,即為組織總蛋白質(zhì),按照不同用量分裝,置于一80°C冰箱中待用。

1.3 固相pH梯度雙向凝膠電泳

2-DE方法主要參考文獻(xiàn)和Bio-Rad儀器操作手冊(cè)進(jìn)行。

凝膠通過IIIlage Scanner II透射掃描儀及Labscan掃描軟件進(jìn)行掃描獲取圖像,利用ImageMaster 2D Elite 5.0分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行強(qiáng)度效正、點(diǎn)檢測(cè)、背景消減及匹配等。比較對(duì)應(yīng)蛋白點(diǎn)表達(dá)豐度,獲得差異蛋白點(diǎn)的缺失、出現(xiàn)及表達(dá)量的變化等信息,選取有明顯差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.4 質(zhì)譜檢查

沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白斑點(diǎn),經(jīng)水洗、脫色、膠內(nèi)酶切等步驟后采用美國(guó)ABI公司的4700 TOF-TOT質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.matrixscience.com),尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì),同時(shí)查詢其功能,來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳圖像的分析

利用ImageMaSter 2D Elite 5.0分析軟件分析對(duì)圓錐角膜和正常角膜組織的兩張代表膠圖譜進(jìn)行分析匹配,發(fā)現(xiàn)其蛋白點(diǎn)數(shù)分別為1035和1070,匹配點(diǎn)數(shù)為869個(gè),匹配率為84%。通過對(duì)二者的凝膠圖譜分析,根據(jù)以下幾個(gè)條件篩選出7個(gè)明顯的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定:1)在圖像分析軟件中蛋白點(diǎn)的灰度差異在兩倍以上,并可人工識(shí)別;2)相同組織重復(fù)兩次凝膠電泳,在兩張圖譜都出現(xiàn)相同差異的蛋白點(diǎn);3)至少在50%的相同類型的角膜組織的凝膠圖譜中出現(xiàn);4)位于圖譜下方的小分子量的蛋白點(diǎn)忽略不計(jì),因?yàn)檫@些很可能為降解的蛋白片段。圖1-1和圖1-2分別是圓錐角膜組織和正常角膜組織的代表性雙向凝膠電泳圖譜,圖中以“↖□”標(biāo)記的為差異蛋白質(zhì)。為了清晰顯示蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的匹配和差異表達(dá)情況,我們以A3蛋白斑點(diǎn)為例,進(jìn)行局部放大顯示。圖2為A3的局部放大圖。

圖1-1 圓錐角膜組織雙向凝膠電泳圖譜(pH 5～8,上樣量230μg)

圖1-2 正常人角膜組織雙向凝膠電泳圖譜(pH 5～8,上樣量230μg)

圖2 左側(cè)為圓錐角膜組織凝膠電泳蛋白質(zhì)A3的局部放大圖,右側(cè)為正常角膜組織的A3放大圖

2.2 質(zhì)譜分析結(jié)果

利用ImageMaster 2D Elite 5.0分析軟件對(duì)圓錐角膜和正常角膜組織的凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析匹配,篩選出7個(gè)明顯的差異蛋白點(diǎn),其中有6個(gè)蛋白成分在圓錐角膜組織中表達(dá)下調(diào),1個(gè)蛋白成份表達(dá)上調(diào),分別進(jìn)行 MALDI-ToF/ToF-Ms質(zhì)譜分析,獲得蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)及二級(jí)質(zhì)譜圖。最后利用Mascot軟件搜索NcBInr數(shù)據(jù)庫(kù)尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)信息,7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)均鑒定成功,其中6個(gè)在圓錐角膜中低表達(dá)的蛋白質(zhì)成分包括TGFBIp/βig-h3、alpha-crystallin A、alpha-crystallinB 、beta-crystallin B2、glutamine synthetase、carbonic anhydrase,1個(gè)在圓錐角膜中高表達(dá)的蛋白質(zhì)成分為collagen alpha-1(VI)chain precursor。各蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析見表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將圓錐角膜組織和正常角膜組織的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析研究,發(fā)現(xiàn)了TGFBIp等幾種可能與圓錐角膜發(fā)病相關(guān)的差異蛋白質(zhì),研究所利用的是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略。比較蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線首先用雙向凝膠電泳技術(shù)分離復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分,并用專門的計(jì)算機(jī)軟件對(duì)雙向凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和圖像分析,然后采用氨基酸組成分析、微量蛋白質(zhì)測(cè)序、質(zhì)譜分析等技術(shù)將從凝膠上采集的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步的鑒定,結(jié)合相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,獲取有關(guān)蛋白質(zhì)的性質(zhì)、表達(dá)變化和翻譯后的修飾加工等多方面的大量信息,建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),通過生理和病理?xiàng)l件下(如疾病狀態(tài)或疾病不同發(fā)展階段)蛋白質(zhì)組各成員表達(dá)水平、翻譯后的修飾加工以及亞細(xì)胞定位等情況的比較研究,發(fā)現(xiàn)和鑒定出有特征性的蛋白質(zhì)(群),為疾病的發(fā)病機(jī)理研究、診斷和治療提供線索。

對(duì)于圓錐角膜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,目前國(guó)際國(guó)內(nèi)上已經(jīng)開展了部分工作。1989年Noorjuahan[1]及其同事利用雙向電泳技術(shù)分析圓錐角膜與正常角膜差異表達(dá)蛋白,發(fā)現(xiàn)在圓錐角膜組織的凝膠電泳圖譜中有兩個(gè)異常蛋白成分表達(dá)(分子量分別為54KD、26KD),有三個(gè)正常的角膜蛋白成分(分子量分別為12KD、 14KD、39KD)出現(xiàn)高表達(dá),同時(shí)還有三個(gè)正常角膜蛋白成分(分子量分別為 66KD、55l1、13KD)表達(dá)減少或者不表達(dá)。但是這部分研究結(jié)果沒有做進(jìn)一步的蛋白質(zhì)譜分析,所以不能得出這些差異蛋白的確切成分。通過對(duì)比蛋白分子量及蛋白等電點(diǎn),Noorjuahan等發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)低表達(dá)的正常角膜蛋白成分與脯氨酰-4-羥化酶的亞基十分相似,而該酶正是膠原脯氨酸殘基羥基化所必需的酶類;另外,Noorjuahan推測(cè)某些正常角膜蛋白成分由于異常的翻譯后修飾作用如過度糖基化等,成為研究中所出現(xiàn)的異常表達(dá)蛋白質(zhì)。后續(xù)的研究選擇角膜的某些成分進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。如Nielsen等[2]選擇近視眼患者的角膜上皮細(xì)胞作為對(duì)照組尋找圓錐角膜上皮細(xì)胞中的差異蛋白,通過Melanie II分析軟件及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),有十幾個(gè)差異蛋白表達(dá),包括cytokeratin 3,gelsolin,S100A4以及 enolase-1等。Nielsen認(rèn)為這些蛋白可能參與了圓錐角膜的發(fā)病過程。Srivastava等[3]也對(duì)圓錐角膜的上皮細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,他們選用正常角膜組織上皮細(xì)胞為對(duì)照組,采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)及免疫組織化學(xué)方法分析后發(fā)現(xiàn)α-enolase和β-actin兩種蛋白在圓錐角膜組織的翼狀細(xì)胞層及表面細(xì)胞層中呈低表達(dá)或不表達(dá),Srivastava認(rèn)為這與圓錐角膜中這兩種蛋白的降解增強(qiáng)有關(guān)。

表1差異蛋白質(zhì)點(diǎn)質(zhì)譜檢索結(jié)果

目前對(duì)圓錐角膜全層組織的總蛋白進(jìn)行差異蛋白篩選和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì) 組學(xué)研究還未見報(bào)道。為了更加真實(shí)揭示圓錐角膜的蛋白表達(dá)狀況、識(shí)別鑒定與其發(fā)病密切相關(guān)的差異蛋白質(zhì),本實(shí)驗(yàn)以正常角膜組織為對(duì)照組,提取角膜組織的總蛋白質(zhì),采用蛋白質(zhì)組學(xué)圖像分析軟件分析圓錐角膜組織與對(duì)照組的雙向電泳凝膠圖譜,篩選出兩者間的差異表達(dá)蛋白,利用MALDI/TOF-TOF/MS鑒定,共獲得7張蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF),為進(jìn)一步的研究提供條件。

在本研究中,對(duì)組織標(biāo)本的收集、組織總蛋白質(zhì)的提取以及雙向凝膠電泳總蛋白質(zhì)的上樣量進(jìn)行了最優(yōu)條件的摸索,結(jié)果顯示,選擇PH值寬度為5-8的17cm非線性口G膠條,采用硝酸銀染色方法,總蛋白上樣量以230 u g為佳,從而建立了重復(fù)性較好的人角膜組織的雙向凝膠電泳圖譜。質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的支撐技術(shù)之一,因其可靠性直接影響到整個(gè)研究的可信性,所以質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)中具有非常重要的地位,故選擇高效、可靠、穩(wěn)定的質(zhì)譜分析儀十分必要。

在圓錐角膜與正常角膜組織的比較分析中,我們發(fā)現(xiàn)6種可能與圓錐角膜發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì),包括TGFBIp/βig-h3、collagen alpha-1(VI)chain precursor、alpha-crystallin A、beta-crystallin B2、alpha-crystallinB 、glutamine synthetase、這些蛋白成分有些參與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附,有些影響膠原的穩(wěn)定性和成熟性,有些參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激等,為此還需進(jìn)行更為詳細(xì)的探討。

[1] Noorjahan P,Jim D,Brian C,etal.Protein-related abnormalities in keratoconus.Invest Ophthalmol Vis Sci,1989,30:2481-2487.

[2] Nielsen K,Henrik V,Fagerholm P,etal.Proteome profiling of corneal epithelium and identification of marker protein for keratoconus,a pilot study.Exp Eye Res,2006,82(2):201-209.

[3] Srivastava OP,Chandrasekaran D,Pfister RR.Molecular changes in selected epithelial protein in human keratoconus comes compared to nornal corneas.Mol Vis,2006,12:1615-1625.

Initialstudyofproteinsdifferentiallyexpressedinhumankeratoconuscorneascomparedtonormalcorneas

GAONa1,RENLi2

(TeachingHospitalofChengduUniversityofTCM/ClinicalMedicalCollege,ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075;2.ChengduUniversityofTCM,Chengdu,Sichuan,610075)

ObjectiveThe proteins differentially expressed in keratoconus and normal corneas was analyzed by comparative proteomine technology,and then identify protein markers that may be specific to the disease.Methods12 human keratoconus buttons and 4 normal human central human corneas were collected.Cornea proteins were separeted on immobilized pH gradient-based two dimension electrophoresis SDS polyacrylamide gels and silver stained,spots were defined and quantified.Differentially expressend protein spots were then identified by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS)and databese searching.ResultsSeven differentially expressed proteins were identified by MALDI-TOF/TOF-MS,peptide mass fingerprint(PMF)and MS/MS maps were obtained.The proteins successfully identified were TGFBIp/βig-h3、collagen alpha-1(VI)chainprecursor、alpha-crystallin A、beta-crystallin B2、alpha-crystallinB 、glutamine synthetase、carbonic anhydrase.All of them were down-regulation in keratoconus except collagen alpha-1(VI)chain precursor.ConclusionTGFBIp/βig-h3、alpha-crystallin A、alpha-crystallinB 、beta-crystallin B2、glutamine synthetase、collagen alpha-1(VI)chain precursor were identified to be differentially expressed in keratoconus compared to normal corneas and thus may be involved in the pathogenesis.

Keratoconus; Comparativeproteomics; MALDI-TOF/TOF-MS

1.610075,四川成都，成都中醫(yī)藥大學(xué)/附屬醫(yī)院；2.610075，四川成都，成都中醫(yī)藥大學(xué)

任麗,E-mail:jnl.scrhi@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.04.002

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