減數分裂期雄性大菱鲆孕激素及受體基因的表達分析

豐程程, 柳意樊, 安 皓, 徐世宏, 王彥豐, 宋宗誠, 劉清華, 李 軍

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減數分裂期雄性大菱鲆孕激素及受體基因的表達分析

豐程程1, 2, 3, 柳意樊1, 3, 安 皓1, 2, 3, 徐世宏1, 3, 王彥豐1, 3, 宋宗誠4, 劉清華1, 3, 李 軍1, 3

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京 100049; 3. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266237; 4. 山東威海圣航水產科技有限公司, 山東 威海 264200)

為研究孕激素在大菱鲆()精原細胞增殖到減數分裂過程中的作用, 以6~22月齡的大菱鲆精巢為材料, 通過組織學方法和定量、基因確定精原細胞增殖期和減數分裂期的大菱鲆精巢發育過程。通過酶聯免疫吸附技術(ELISA)檢測6~22月齡雄性大菱鲆血清中的孕酮(P4)和17α, 20β, 雙羥孕酮(DHP)含量變化, 利用qRT-PCR技術和原位雜交技術檢測孕酮核受體()和膜受體()在不同組織和不同發育時期的表達情況。結果表明孕激素在精原細胞增殖期高表達, 開始出現初級精母細胞時降低, 在精子細胞數量增加時表達量再次升高, 在精子細胞變態形成精子時降低。在減數分裂初期定位于精巢中的sertoli細胞, 在精原細胞增殖至減數分裂期表達量逐漸增加, 出現精子后顯著降低;在精原細胞增殖和初級精母細胞增加時表達量都很低, 在精子細胞不斷增加時顯著增加。推測在精原細胞增殖和減數分裂階段孕激素可能主要通過調節的表達量來促進精巢發育, 而在減數分裂II期和都發揮作用在精子細胞變態成熟時, 主要是發揮作用。

大菱鲆(); 減數分裂; 孕激素;;

低等脊椎動物中, 雌魚生殖細胞先增殖進入減數分裂階段, 而雄魚處于有絲分裂阻滯, 晚于雌魚再進入減數分裂期[1]。減數分裂進程一旦出錯, 精子發生就會停滯并最終導致不育。因此, 確保雄魚生殖細胞減數分裂正常進行是魚類繁殖的必要條件。早期研究認為, 孕激素在雄魚最后的精子成熟和排放過程中發揮重要作用[2]。但最近的研究表明, 孕激素的活性成分之一 ——17α, 20β-雙羥孕酮(DHP)在魚類減數分裂起始階段必不可少, 在日本鰻鱺()、尼羅羅非魚()和斑馬魚()中, DHP誘導精原細胞進入減數分裂起始階段[3-5]。另外, 孕激素的生物活性受孕激素受體調控, 受體主要包括核受體()和膜受體()兩大類。孕激素與核受體如(progesterone receptor)結合后移動到胞核內作為轉錄因子調節靶基因的轉錄, 在胞質中還可以激活相關信號通路, 共同調節細胞的增殖和分化[6-7]。而膜受體如(membrane progestin receptor alpha)與孕酮特異性結合, 通過激活G蛋白調控下游的腺苷酸環化酶-環磷酸腺苷(AC-cAMP)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路來介導孕酮對精子運動的激活[8]。

大菱鲆() 為原產于歐洲沿海的冷水性鲆科魚類, 自1992年引進中國后, 成為重要海水養殖良種之一, 其工廠化養殖取得重大經濟效益, 是中國水產養殖業一個新的經濟增長點[9]。然而大菱鲆生長期長, 精巢發育緩慢, 排精量低已經成為制約產業發展的瓶頸。如何促進精巢中精原細胞快速增殖并進入減數分裂是確保精子發生正常進行, 提高產精量的必要條件。本實驗以6~22月齡的雄性大菱鲆為研究對象, 觀察大菱鲆精巢從精原細胞增殖到減數分裂的發育過程。檢測大菱鲆血清中的孕酮(P4)和DHP含量變化以及不同時期的精巢中和的時空表達模式。由此推測孕激素及其受體在精原細胞增殖到減數分裂階段發揮的作用, 為進一步闡明孕激素及相應受體的相關生理功能提供理論依據, 同時也為深入了解孕激素在魚類生殖周期調控中的生物學功能提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料取自山東省威海市圣航水產科技有限公司和山東省煙臺市東方海洋科技股份有限公司, 養殖水溫17℃。取月齡分別為6月齡(體質量17.2 g± 5.5 g)、10月齡(體質量54.2 g±10.7 g)、12月齡(體質量119.5 g±19.7 g)、14月齡(體質量232.2 g±30.2 g)、16月齡(體質量416.7 g±54.3 g)、20月齡(體質量818 g± 69.3 g)、22月齡(體質量972.5 g±53.3 g)的成魚, 每個時期取5~20尾。將魚麻醉后, 測量全長、體長、體質量和性腺質量。尾部靜脈抽取血液, 4 000 r/min離心10 min取上清用于激素測定。取組織樣品(心、腦、垂體、肝、腸、胃、腎、脾、肌、鰓、精巢和卵巢)投入液氮, –80℃保存, 用于后續RNA提取。精巢樣品取一半分別固定于波恩氏液和4%多聚甲醛(PFA)中, 用于組織學觀察和原位雜交。

1.2 血清激素水平測定

所取的不同月齡的雄魚血清通過ELISA方法測定血清中P4和DHP的含量(pg/mL)。所用試劑盒為美國TSZ公司的Fish Progesterone(P)ELISA Kit和Fish 17α, 20βOH-PROG ELISA Kit。

1.3 組織學觀察

精巢在波恩氏液中固定22 h, 然后轉入70%乙醇中保存。固定的樣品梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 常規石蠟包埋, 做連續切片, 厚度為3μm, 蘇木精-伊紅染色(HE), 顯微鏡觀察(Nikon E200), 并拍照記錄。

1.4 實時熒光定量PCR

通過熒光定量PCR研究和在大菱鲆成體各組織及不同月齡性腺中的表達模式。選用上海飛捷總RNA抽提試劑盒提取總RNA, 根據Nanodrop 2000 測定的RNA濃度, 按照Takara反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。以合成的cDNA為模板,(ubiquitin)和(radial spoke protein 4)為內參, 擴增參數如下: 95℃30 s; 95℃10 s, 55℃30 s循環40圈。熒光定量引物見表1。

表1 實驗用引物及序列

1.5 切片原位雜交

用梯度乙醇脫水4%PFA固定的精巢樣品, 透蠟處理, 石蠟包埋切片, 切片厚度為3 μm。切片脫蠟復水, 4%PFA15 min固定, PBST洗滌3次, 每次5 min, 蛋白酶K(10 μg/mL)37oC消化15 min, 再用PBST洗滌3次, 每次5 min。65℃預雜交2 h, 終質量濃度為1 ng/μL的探針80℃變性 10 min后滴加在切片上, 200 μL/片, 封口膜覆蓋, 65℃孵育過夜。第二天洗滌, 室溫2% blocking buffer 封閉2 h, 熒光抗體孵育過夜。第三天再洗滌, 封閉, 地高辛抗體孵育過夜。第四天洗滌, 用NTMT稀釋NBT/BCIP后避光顯色, 待樣品達到理想色度后, 用PBST洗滌3次, 每次5 min, 終止顯色, 50%甘油封片, 拍照觀察。原位探針引物見表1, 根據設計的引物從精巢cDNA中擴增/目的條帶, 膠回收連接到PGEM-T easy 載體, 轉化到大腸桿菌感受態, 挑選陽性克隆測序。選取含正確插入方向的單克隆, 提取質粒, 酶切純化, 用T7和SP6RNA轉錄酶分別合成/a反義和正義探針。

1.6 統計學處理

激素和基因的表達變化以平均值±標準誤差表示, 每組數據包括3個平行樣品。統計學處理使用spss17.0進行單因素方差分析LSD法, 檢驗水平均為<0.05。

2 結果

2.1 組織學觀察

通過組織學切片觀察大菱鲆6月齡~22月齡的精巢發育過程。在6月齡~10月齡階段, 大菱鲆精巢中的生殖細胞全部為精原細胞(圖1a, 1b)。從12月齡開始, 隨魚體生長, 精巢中逐漸觀察到初級精母細胞(圖 1c), 之后初級精母細胞占總生殖細胞的比例逐漸增加。在16月齡的精巢中觀察到大量的初級精母細胞和少量精子細胞(圖1e), 之后精子細胞的數量不斷增加(圖 1f), 在22月齡時, 出現少量精子混雜在精子細胞中(圖1g)。

圖1 大菱鲆6~22月齡精巢發育形態特征

a. 6月齡, 精原細胞; b. 10月齡, 精原細胞; c. 12月齡, 主要類型為精原細胞和初級精母細胞; d. 14月齡, 主要類型為精原細胞和初級精母細胞; e. 16月齡, 主要類型為初級精母細胞和精子細胞; f. 20月齡, 主要類型為初級精母細胞和精子細胞; g. 22月齡, 主要類型為初級精母細胞, 精子細胞和精子; SG. 精原細胞; PS. 初級精母細胞; ST. 精子細胞; SP. 精子

a. 6 mah, spermatogonia; b. 10 mah, spermatogonia; c. 12 mah, the major types include spermatogonia and primary spermatocytes; d.14 mah, the major types include spermatogonia and primary spermatocytes; e. 16 mah, the major types include primary spermatocytes and spermatids; f. 20 mah, the major types include primary spermatocytes and spermatids; g. 22 mah, the major types include primary spermatocytes, spermatids and sperm; SG. Spermatogonia; PS. primary spermatocytes; ST. spermatids; SP. sperm

2.2 激素含量變化

P4和DHP在6月齡時高表達, 之后在12~14月齡初級精母細胞增加時表達量逐漸降低, 在14月齡時表達量最低, 之后在出現大量精子細胞的16~20月齡階段表達量顯著升高, 隨精子細胞變態形成精子P4和DHP的表達量再次顯著降低(圖2)。

圖2 6~22月齡雄性大菱鲆血清中P4和DHP的含量

a. P4; b. DHP; 每組數據為3個平行樣的平均值土標準差; 標注的不同字母表明具有顯著性的差異(< 0.05)

a. progesterone (P4); b. 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one(DHP); the concentrations of steroids levels are represented as means ± SEM of three independent samples; Different letters above histograms indicate significant difference (< 0.05)

2.3 組織表達模式分析

對和在10月齡大菱鲆不同組織中的表達結果分析顯示,在垂體和精巢中表達量顯著高于其他組織, 其次是卵巢, 在其他組織中的表達量都非常低(圖3a)。在腦中表達量顯著高于其他組織。其次是垂體和眼, 在其他組織中的表達量都非常低(圖3b)。

2.4 pgr, mPRα, sycp3, amh在不同時期性腺中的表達

在6月齡精原細胞增殖期就已經表達, 之后持續顯著上升, 在20月齡精巢中主要細胞類型為精子細胞時表達量最高, 在22月齡出現少量精子時期顯著降低(圖4a)。在6~14月齡階段主要細胞類型為精原細胞和初級精母細胞時表達量較低, 在16月齡出現大量初級精母細胞和少量精子細胞時顯著升高, 16~22月齡階段略有降低, 但仍顯著高于6~14月齡階段(圖4b)。在6月齡就已經開始表達, 之后持續升高, 在16月齡出現大量初級精母細胞和少量精子細胞時表達量顯著升高, 隨精子細胞數量增加,相對表達量略有下降, 在22月齡出現少量精子時期時表達量最高(圖4c)。的表達量從6月齡開始持續升高, 在14月齡出現少量初級精母細胞時達到最高峰, 顯著高于其他時期。之后隨精子細胞數量的不斷增加,的表達量顯著下降, 在之后的16~22月齡階段持續低表達(圖4d)。

圖3 Real-Time PCR檢測在10月齡大菱鲆不同組織中pgr和mPRαmRNA的表達

B. 腦; P. 垂體; G. 鰓; H. 心臟; L. 肝臟; S. 脾; K. 腎; ST. 胃; I. 腸; T. 精巢; O. 卵巢; E. 眼; M. 肌肉; SK. 皮膚。實驗使用10月齡雄魚為材料, 設3次重復。數值代表mRNA的相對表達量。3次重復數據以平均值±標準差展示。通過單因素方差分析, 不同字母表明具有顯著性差異(<0.05)

B. brain; P. pituitary; G. gill: H. heart; L. liver; S. spleen; K. kidney; ST. stomach; I. intestines; T. testis; O. ovary; E. eye; M. muscle; SK. skin; Relative mRNA level represents the mean ± SEM of three independent samples. Different letters indicate significant difference ofand mPRα mRNA levels (< 0.05)

圖4 Real-Time PCR檢測pgr, mPRα, sycp3和amh在6~22月齡性腺中的表達水平

相對表達量為3個平行樣的平均值士標準差。圖上標注的不同字母表明具有顯著性的差異(<0.05)

Relative mRNA levels are represented as mean ± SEM of multiple independent samples. Different letters indicate significant difference of,,andmRNA levels (< 0.05)

2.5 pgr, mPRα在減數分裂期大菱鲆精巢上的定位

通過原位雜交技術定位和在16月齡的精巢中的分布, 在精巢邊緣位置在間質細胞中表達(圖5b),沒有檢測到信號(圖5c)。該位置的精巢中主要細胞類型為精原細胞和初級精母細胞(圖5a)。圖5d和5e分別為和的對照組。

圖5 pgr和mPRα在16月齡大菱鲆精巢中的定位

SG. 精原細胞; PS. 初級精母細胞; Ser. 間質細胞

SG. Spermatogonia; PS. primary spermatocytes; Ser. sertoli cells

3 討論

低等脊椎動物中, 雌魚生殖細胞先增殖進入減數分裂階段, 而雄魚處于有絲分裂阻滯[1], 如尼羅羅非魚雌魚孵化后35 d進入減數分裂Ⅰ期, 而雄魚在孵化后85 d進入減數分裂Ⅰ期; 雌性黑鯛魚孵化后120 d進入減數分裂Ⅰ期, 而雄魚在孵化后150 d出現少量進入減數分裂階段的生殖細胞。減數分裂Ⅰ期是一個相當特殊的過程, 包括同源染色體的配對、聯會和同源染色體重組。之后初級精母細胞分裂為兩個子細胞, 重新生成的細胞緊接著發生第二次分裂。

減數分裂進程一旦出錯, 精子發生就會停滯并最終導致不育。通過組織切片觀察表明大菱鲆在6~10月齡階段為精原細胞增殖期, 大菱鲆精巢中的生殖細胞類型只有精原細胞, 精原細胞不斷增殖, 之后在12~14月齡階段逐漸出現初級精母細胞, 表明精巢從精原細胞增殖期開始進入減數分裂Ⅰ期。在16~20月齡階段, 初級精母細胞和精子細胞為主要的生殖細胞類型, 精原細胞僅在精巢邊緣存在, 表明精巢開始進入第二次減數分裂階段。在22月齡的精巢中可以觀察到精子細胞占主導地位, 并出現少量精子混雜在精子細胞中。基因編碼的蛋白主要表達在初級精母細胞中, 是第一次減數分裂偶線期同源染色體配對過程中聯會復合體的主要結構蛋白, 因此可以作為減數分裂Ⅰ期的標記基因。本實驗中, 在6月齡的大菱鲆精巢中已經開始低表達, 但在組織切片中沒有觀察到精母細胞, 雖然此時精巢中的精原細胞還沒有開始減數分裂, 但是已經開始表達, 推測的表達可能開始于精原細胞增殖期。在6~14月齡期間的表達量持續增加, 表明隨月齡增加, 精巢發育, 越來越多的精原細胞發育成初級精母細胞, 這也和組織切片觀察到的吻合, 在16和22月齡時高表達, 表明雖然在這兩個時期主要細胞類型分別為精子細胞和精子, 但在精巢邊緣仍有精原細胞源源不斷的發育成初級精母細胞。在6~14月齡階段持續升高, 在之后的16~22月齡階段顯著降低。由此表明,在大菱鲆精原細胞增殖期和減數分裂起始階段顯著高表達, 在進入減數分裂Ⅱ期后表達量顯著降低。推測促進精原細胞增殖并發育成初級精母細胞, 而精子細胞和精子對的表達起抑制作用。(Anti-Mullerianhormone)是一類以多肽形式存在的細胞生長因子, 是轉化生長因子P超家族(TGF-P)的分泌型糖蛋白。哺乳動物睪丸sertoli細胞分泌的引起繆勒氏管退化。雖然硬骨魚類并不存在繆勒氏管, 但是仍存在基因的表達。在銀漢魚()和尼羅羅非魚中認為是雄性性別決定的必要基因[10-11]。本實驗研究結果與半滑舌鰨()上的研究結果類似, 在半滑舌鰨中,在孵化后70 d之前表達量低, 在70 d時達到最高峰, 而在8月齡生精期的表達量下降[12]。同樣, 在青鳉()和日本牙鲆()中,主要在未成熟的精巢中表達, 在精子發生前停止表達, 如果持續表達則會抑制精子發生過程[13-14]。在尼羅羅非魚魚中,在5~180 日齡的精巢的sertoli細胞和葉邊細胞中持續高表達。敲除銀漢魚和尼羅羅非魚中位于Y 染色體上的復制基因, 會導致雄性XY型胚胎個體朝卵巢方向發育[10-11]。另外,是sertoli細胞的起源基因[15], 大菱鲆的表達量在14月齡后顯著降低, 也表明在進入減數分裂后, sertoli細胞占精巢總細胞的比例顯著降低。

早期關于孕激素對硬骨魚精子發生的研究主要集中在促進精子成熟排精和提高精子活力方面[2], 對孕激素通過孕酮受體對精原細胞增殖至減數分裂階段的調節機制研究的較少。目前在硬骨魚中得到兩種具有生物活性的孕激素: 17α,20β-雙羥孕酮(DHP)和17α,20β-21-三羥孕酮(20β-s), 而在已報到的硬骨魚減數分裂起始階段起作用的都是DHP[16-17]。本實驗中, P4和DHP水平在精原細胞增殖期顯著高于減數分裂Ⅰ期。這和在斑馬魚, 大西洋鮭()和大西洋鱈魚()中DHP水平在減數分裂起始階段增高的結果相似[5, 18-19]。用DHP體內處理斑馬魚, 誘導早期精原細胞增殖分化成后期的精原細胞和精母細胞[15]。另外DHP體外處理日本鰻鱺()精巢會刺激精原細胞DNA復制和減數分裂起始[3]。這些都說明DHP參與于早期精子發生的調節過程。因此推測在大菱鲆中P4和DHP促進精原細胞增殖和減數分裂起始。另外在減數分裂Ⅱ期, P4和DHP的表達量再次顯著升高, 這和在鮭科()魚類的研究中相似[2, 20], 因此推測P4和DHP在大菱鲆中促進精子細胞變態成熟。

在斑馬魚、尼羅羅非魚、大西洋鱈魚等魚中已證明DHP是的天然配體[4, 6, 19]。在斑馬魚中DHP也可以和特異結合[21]。本實驗中,的表達量在10月齡時就開始顯著升高, 之后持續升高, 至20月齡達到最高峰后顯著下降。表明從精原細胞增殖期就開始顯著增加, 之后表達量持續升高, 直至精巢進入精子細胞變態成熟期, 才顯著降低。推測促進精原細胞增殖和減數分裂。之前在斑馬魚、尼羅羅非魚、日本鰻鱺中的研究結果表明,僅在生殖細胞減數分裂啟動的關鍵時期出現顯著上升[3-4, 6], 本實驗結果延長了發揮作用的時期, 推測孕激素通過調節基因表達量促進精原細胞增殖和減數分裂兩個階段。本實驗中大菱鲆精巢中的表達量在6~14月齡階段較低, 之后顯著升高, 表明在精原細胞增殖期和減數分裂Ⅰ期表達量低, 在減數分裂Ⅱ期細胞類型主要為精子細胞和精子時,的表達量顯著升高。之前的研究主要集中在在精子上的表達和作用[22], 在減數分裂期精巢中的表達還沒有研究。本實驗定量在大菱鲆不同時期精巢中的表達水平, 推測在精子發生早期不發揮作用, 在減數分裂Ⅱ期和精子變態成熟階段作為主要的孕酮受體發揮重要作用。

定位結果表明, 在精巢中的生殖細胞類型主要為精原細胞和初級精母細胞時,在sertoli 細胞上表達, 這和尼羅羅非魚上的結果相似[4]。而沒有明顯信號, 結合熒光定量結果推測可能是由于這個階段的表達量很低, 所以沒有檢測到明顯信號。

[1] Lau E L, Lee M F, Chang C F, et al. Conserved sex-specific timing of meiotic initiation during sex differentiation in the protandrous black porgy[J]Biol Reprod, 2013, 88(6): 1-13.

[2] Scott A P, Sumpter J P, Stacey N, et al. The role of the maturation-inducing steroid, 17, 20beta-dihydroxypregn- 4-en-3-one, in male fishes: a review[J]. J Fish Biol, 2010, 76(1): 183-224.

[3] Higuchi M, Miura C, Iwai T, et al. Trypsin regulates meiotic initiation in the Japanese eel () by promoting the uptake of taurine into germ cells during spermatogenesis[J]Biol Reprod, 2013, 89(3): 1-9, 58.

[4] Liu G, Luo F, Song Q, et al. Blocking of progestin action disrupts spermatogenesis in Nile tilapia () [J]J Mol Endocrinol, 2014, 53(1): 57-70.

[5] Chen S X, Bogerd J, Schoonen E, et al. A progestin (17alpha, 20beta-dihydroxy-4-pregnen-3-one) stimulates early stages of spermatogenesis in zebrafish[J]Gen Comp Endocrinol, 2013, 185: 1-9.

[6] Chen S X, Bogerd J, García-López A, et al. Molecular cloning and functional characterization of a zebrafish nuclear progesterone receptor[J]Biol Reprod, 2010, 82(1): 171-181.

[7] 張瑞, 闕華勇, 張國范, 等.海灣扇貝維甲酸受體_RXR_ cDNA克隆與表達分析[J]. 海洋科學, 2016, 40(9): 1-8. Zhang Rui, Que Huayong, Zhang Guofan, et al. Molecular cloning and expression of the retinoid X receptor gene in[J]. Marine Sciences, 2016, 40(9): 1-8.

[8] Salazar M. Progestin-mediated activation of MAPK and AKT in nuclear progesterone receptor negative breast epithelial cells: The role of membrane progesterone receptors[J]Gene, 2016, 591(1): 6-13.

[9] 郭佳偉, 譚訓剛, 尤鋒, 等. 大菱鲆周期蛋白依賴激酶基因cdk1、cdk6克隆及表達分析[J]. 海洋科學, 2016, 40(4): 11-21. Guo Jiawei, Tan Xungang, You Feng, et al. Cloning and expression analysis of cdk1 and cdk6 in[J]. Marine Sciences, 2016, 40(4): 11-21.

[10] Hattori R S, Murai Y, Oura M, et al. A Y-linked anti-Mullerian hormone duplication takes over a critical role in sex determination[J]Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(8): 2955-2959.

[11] Li M, Sun Y, Zhao J, et al. A tandem duplicate of anti-mullerian hormone with a missense SNP on the Y chromosome is essential for male sex determination in nile tilapia,[J]. PLoS Genet, 2015, 11(11): 1-23.

[12] Liu S, Sun B, Liang Z, et al. Cloning and expression of anti-mullerian hormone gene in halfsmooth tongue-sole[J]Journal of Fishery Sciences of China, 2013, 20(1): 35-43.

[13] Yoshinaga N, Shiraishi E, Yamamoto T, et al. Sexually dimorphic expression of a teleost homologue of Mullerian inhibiting substance during gonadal sex differentiation in Japanese flounder,[J]Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 322(2): 508-513.

[14] Shiraishi E, Yoshinaga N, Miura T, et al.Mullerian inhibiting substance is required for germ cell proliferation during early gonadal differentiation in medaka ()[J]Endocrinology, 2008, 149(4): 1813- 1819.

[15] Liang Y Q, Huang G, Ying G, et al. The effects of progesterone on transcriptional expression profiles of genes associated with hypothalamic-pituitary-gonadal and hypothalamic-pituitary-adrenal axes during the earlydevelopment of zebrafish ()[J]Chemosphere, 2015, 128: 199-206.

[16] Miura T, Higuchi M, Ozaki Y, et al. Progestin is an essential factor for the initiation of the meiosis in spermatogenetic cells of the eel[J]Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(19): 7333-7338.

[17] Tubbs C, Tan W, Shi B, et al. Identification of 17, 20beta, 21-trihydroxy-4-pregnen-3-one (20beta-S) receptor binding and membrane progestin receptor alpha on southern flounder spermand their likely role in 20beta-S stimulation of sperm hypermotility[J]Gen Comp Endocrinol, 2011, 170(3): 629-639.

[18] Chen S X, Jan B, Eva A, et al. Cloning, pharmacological characterization, and expression analysis of Atlantic salmon (L.) nuclear progesterone receptor[J]Reproduction, 2011, 141(4): 491-500.

[19] Chen S X, Fernanda A, Eva A, et al. Cloning, pharma-co-logical characterization and expression analysis of Atlantic cod(L.)nuclear progesterone receptor[J]. Gen Comp Endocrinol, 2012, 179(1): 71-77.

[20] Milla S, Terrien X, Sturm A, et al. Plasma 11-deoxycor-ticosterone (DOC) and mineralocorticoid receptor testicular expression during rainbow troutspermiation: implication with 17alpha, 20beta- dih-yd-roxyprogesterone on the milt fluidity[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2008, 6: 19.

[21] Hanna R N, Zhu Y. Expression of membrane progestin receptors in zebrafish () oocytes, testis and pituitary[J]Gen Comp Endocrinol, 2009, 161(1): 153- 157.

[22] Tan W, Aizen J, Thomas P. Membrane progestin receptor alpha mediates progestin-induced sperm hypermotility and increased fertilization success in southern flounder()[J]. Gen Comp Endocrinol, 2014, 200: 18-26.

(本文編輯: 譚雪靜)

Progestin actions and expression analysis of progestin receptors in the meiotic in male turbot ()

FENG Cheng-cheng1, 2, 3, LIU Yi-fan1, 3, AN Hao1, 2, 3, XU Shi-hong1, 3, WANG Yan-feng1, 3, SONG Zong-cheng4, LIU Qing-hua1, 3, LI Jun1, 3

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China; 4.Weihai Shenghang Aquatic Science and Technology Co., LTD, Weihai 264200, China)

To explore the function of progestin during spermatogonial proliferation and meiosis, we used histological methods to investigate the gonadal development process of the male turbot () 6 to 22 months of age. We detected the expression ofandvia the real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). Using enzyme-linked immunosorbent (ELISA) technology, qRT-PCR, and in-situ hybridization, we detected the serum P4 and DHP levels and the expression patterns of the nuclear progesterone receptor () and membrane progestin receptor alpha () during different development periods. The results reveal that the P4 and DHP levels were high during spermatogonial proliferation and meiosis Ⅱ. Theexpression was high from spermatogonial proliferation to meiosis I, whereas theexpression was high during meiosis Ⅱ and spermiogenesis. Our in-situ hybridization results indicatemRNA to be predominantly located in the Sertoli cells that were in contact with the proliferating spermatogonia and primary spermatocyte and that themRNA was undetectable. Taken together, our data indicate theexpression to be involved in mediating the progestin stimulation of spermatogonia proliferation and meiosis, whereas theplays an important role in meiosis Ⅱ and spermiogenesis.

; meiosis; progestin;;

[National Science Foundation of China, No. 31472264, 31572602; The Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, No.2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03; Modern Agro-Industry Technology Research System, No.nycytx-50; Youth Innovation Promotion Association CAS and Chinese Academy of Science and Technology Service Network Planning, No.KFJ-EW-STS-060]; Project from the National Infrastructure of Fishery Germplasm Resource, No.2016DKA30470]

Feb. 27, 2017

Q256

A

1000-3096(2017)08-0091-08

10.11759//hykx20170227002

2017-02-27;

2017-03-29

國家自然科學基金資助項目(31472264, 31572602); 鰲山科技創新計劃資助項目(2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03)資助; 鲆鰈類產業技術體系項目(nycytx-50); 中國科學院青促會項目(KFJ-EW-STS- 060); 國家科技基礎條件平臺建設運行項目(2016DKA30470)

豐程程(1989-), 女, 博士研究生, 主要從事海水魚類增養殖與生物技術研究, 電話: 15610052087, E-mail: fcc19891026@163.com;李軍,通信作者, E-mail: junli@qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, E-mail: qinghualiu@qdio.ac.cn