河南省豬源沙門氏菌的分離鑒定與血清分型

過效民

（河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008）

河南省豬源沙門氏菌的分離鑒定與血清分型

過效民

（河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008）

為了了解河南省豬源沙門氏菌的血清型分布，從鄭州、開封、焦作、許昌4個地市豬屠宰場抽取盲腸內容物840批，通過對細菌的分離培養、純化，采用PCR和BD PhoenixTM-100全自動微生物鑒定系統對分離的沙門氏菌進行鑒定，應用玻片凝集試驗進行血清型鑒定。共分離沙門氏菌67株，分離率為8.0%，其中德爾卑沙門氏菌32株、鼠傷寒沙門氏菌31株，表明河南省豬源沙門氏菌以德爾卑沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為主。

沙門氏菌；分離；鑒定；血清分型

沙門氏菌是可導致人畜食物中毒和發病的重要病原菌，據統計，全世界各類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒排在榜首[1]。人畜感染沙門氏菌后可呈無癥狀帶菌狀態，也可表現為有臨床癥狀的致死疾病，它能加重病態或死亡率，也能降低動物的生產繁殖能力。沙門氏菌的血清型眾多，目前已檢出的血清型多達2 600種，我國約有300種血清型37個血清組，雖然世界各國流行的沙門氏菌有所差異，但主要血清型都包括腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌等[2]。

該試驗從河南省4個地市豬的屠宰場抽取盲腸內容物樣品，進行沙門氏菌分離、鑒定，隨后進行血清分型，以期掌握河南省豬源沙門氏菌血清型分布情況，為河南省畜禽養殖業防控因沙門氏菌引起的疾病以及維護公共衛生安全提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

2016年1月 至2016年12月抽取鄭州、開封、焦作、許昌4個地區規模化豬屠宰場豬盲腸內容物樣品840批，其中鄭州220批，開封200批，焦作220批，許昌200批。

1.1.2 菌株

鼠傷寒沙門氏菌質控菌株ATCC14028（購自中國獸醫藥品監察所）。

1.1.3 培養基與試劑

滅菌50 ml離心管、革蘭氏陰性細菌鑒定板，一次性無菌采樣棒（BHI），沙門氏菌顯色培養基，swarm半固體瓊脂，營養瓊脂，沙門氏菌診斷血清，一次性接種棒，PCR預混酶。

1.1.4 儀器設備

低溫可疊放搖床，梯度PCR儀，凝膠成像系統。

1.1.5 引物

沙門氏菌invA基因引物P1：5’-GTGAAATTATCGCC ACGTTCGGG-3’，P2：5’-CATCGCACCGTCAAAGGAAC-3’，擴增片段長度為284 bp。

1.2 試驗方法

1.2.1 預增菌

將使用一次性無菌采樣棒采集的豬盲腸內容物樣品盡快送往實驗室，36℃培養16～20 h，同時設陽性和陰性對照。

1.2.2 PCR初篩

采用菌液PCR，無菌吸取5 μl預增菌菌液為模板進行PCR擴增，同時設陽性對照、陰性對照和空白對照。

反應體系：Taq PCR Master Mix 25 μl，ddH2O 18 μl，P1、P2各1 μl，模板5 μl。

PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環；72℃后延伸5 min；4℃保存。同時設置陽性對照、陰性對照。

1.2.3 電泳

配制濃度為1.5%的瓊脂糖溶液，于微波爐中加熱溶解，待冷卻至50～60℃時，加入溴化乙錠（使其終濃度達到0.5 μg/ml）混勻，倒入已插上梳子的膠槽內。待凝固后，轉入電泳槽中，在每個泳道中加入8 μl的PCR產物，160 V，電泳15～20 min。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀上成像。

1.2.4 樣品的分離、純化及鑒定

取PCR初篩陽性菌液1～2環，劃線于沙門氏菌顯色培養基上，36℃培養20～24 h，選取單個典型菌落進行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于營養瓊脂培養基，采用藥敏試驗進行鑒定。

1.2.5 血清分型

先測Ο抗原，用無菌槍頭取營養瓊脂上經鑒定的沙門氏菌與載玻片上加有10 μl沙門氏菌A-F群“Ο”多價診斷血清混勻，輕輕搖動玻片，于30 s內讀取結果，凝集為陽性，渾濁或清亮為陰性，同時設無菌生理鹽水為對照。測完“Ο”多價后再測“Ο”單價。

測完Ο抗原后測H抗原，先測Ⅰ項，用一次性接種棒將營養瓊脂上沙門氏菌輕輕點接到swarm半固體瓊脂中央上，注意不要刺破瓊脂。用無菌槍頭取swarm半固體瓊脂上的菌落先進行HMA、HMB、HMC、HMD多價測定，然后進行單價測定；Ⅰ項測定完畢后，選出需要測Ⅱ項的，用一次性接種棒點接在加有相應誘導劑的swarm半固體瓊脂上，然后按Ⅰ項方法進行Ⅱ項的測定。

2 結果

2.1 樣品中沙門氏菌的分離鑒定結果

經預增菌培養、PCR初篩及樣品的分離純化，最后經藥敏試驗鑒定，共分離沙門氏菌67株，分離率為8.0%，具體結果見表1。

表1 河南省豬屠宰場沙門氏菌分離情況

2.2 沙門氏菌血清分型結果

分離的67株沙門氏菌共分為5個型，分別為Derby（德爾卑）、Typhimurium（鼠傷寒）、Give（吉韋）、Reading（里定）、Tumodi（圖莫迪），其中德爾卑沙門氏菌32株，鼠傷寒沙門氏菌31株，吉韋沙門氏菌2株，里定沙門氏菌和圖莫迪沙門氏菌均為1株，具體結果見表2。

表2 河南省豬源沙門氏菌血清型分布

3 討論

近年來，沙門氏菌的污染在全世界范圍內對食品安全問題產生了嚴重的影響。由沙門氏菌活菌導致的食物中毒屬于感染型中毒，主要是由于活菌進入生物體腸道內通過淋巴系統進入血液引起全身感染，導致胃腸道的黏膜發炎引起腹瀉、體溫升高等癥狀[3]。在我國，由細菌污染導致的人食物中毒中70%以上是由沙門氏菌引起的，引起沙門氏菌中毒的食物中，畜產品占90%[4]。動物源性食品中重要的致病菌出現主要來自動物養殖期間的感染和屠宰加工過程中的污染兩個方面。因此，對屠宰場沙門氏菌的檢測及血清分型對公共衛生以及產業經濟有著十分重要的意義。

通過對河南省屠宰場抽取豬盲腸內容物樣品進行沙門氏菌分離鑒定，共分離沙門氏菌67株，分離率為8.0%，其中焦作、鄭州、開封、許昌的分離率分別為12.7%（28/220）、9.1%（20/220）、6.5%（13/200）和 3.0%（6/200）。這一結果與狄文婷等[5]所研究的大連新鮮豬肉中沙門氏菌的分離率17.6%相比較低，與岳秀英等[6]所研究的四川養豬場豬肛拭子樣品中沙門氏菌的分離率5.68%相比稍高，表明不同地區、不同采樣部位中沙門氏菌分離率存在差異。

通過對67株沙門氏菌進行血清型鑒定，共有德爾卑沙門氏菌32株，鼠傷寒沙門氏菌31株，吉韋沙門氏菌2株，里定沙門氏菌和圖莫迪沙門氏菌均為1株。其中鄭州、開封、許昌均為德爾卑沙門氏菌最多，其次為鼠傷寒沙門氏菌；焦作鼠傷寒沙門氏菌最多，其次為德爾卑沙門氏菌。這一結果與陳玲等[7]人在對南方食品中沙門氏菌污染情況的調查一致。而與Wang[8]等在對安徽雞屠宰場的調查發現中，印第安納沙門氏菌和嬰兒沙門氏菌是主要的兩種血清型的結果不一致。表明因地域、環境和用藥情況不同，不同樣品來源、不同地區或同一地區不同時間沙門氏菌的流行優勢菌株有所不同。

該試驗結果表明，河南省不同地區的豬屠宰場沙門氏菌的污染情況存在差異，血清型種類也各異，這是由于各地區養殖環境、氣候條件、用藥情況及屠宰場的衛生情況不同所致。以后應進一步規范養殖場合理用藥，改善屠宰場環境衛生，防止屠宰過程中沙門氏菌交叉污染，從動物性食品的源頭控制沙門氏菌的污染，保證食品衛生安全。

[1]王士平.沙門氏菌食物中毒急救及防控措施[J].臨床合理用藥雜志，2012，5（8）：9-10.

[2]徐桂云，樊世杰.家禽沙門氏菌感染現狀及不同國家的防治策略[J].中國家禽，2012，34（9）：7-12.

[3]王潤蠢.環介導等溫擴增技術快速檢測肉中沙門氏菌的研究[D].河北農業大學，2010.

[4]王娟，王君瑋，曲志娜，等.畜禽產品中致病菌污染的危害、現狀與對策[J].中國動物檢疫，2013，30（12）：24-28.

[5]狄文婷，杜雄偉，吳靜，等.豬源沙門氏菌的分離與耐藥性分析[J].江蘇農業科學，2014，42（10）：278-280.

[6]岳秀英，葛榮，汪開毓，等.四川省豬源沙門氏菌及耐藥性變遷調查[J].四川動物，2015，（5）：707-713.

[7]陳玲，張菊梅，楊小鵑，等.南方食品中沙門氏菌污染調查及分型[J].微生物學報，2013，（12）：1326-1333.

[8]Wang H，Ye K，Wei X，et al.Occurrence，antimicrobial resistance and biofilm formation of Salmonella isolates from a chicken slaughter plant in China[J].Food Control，2013，33（2）：378-384.

S852.61

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1004-5090（2017）10-0006-02

2017-08-15）