痰濕質酒精性股骨頭壞死CYP2C8基因rs17110453位點多態性研究

柳海平，周明旺，李盛華，陳威，葉丙霖，郭鐵峰，陳嫻

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

論著·臨床研究

痰濕質酒精性股骨頭壞死CYP2C8基因rs17110453位點多態性研究

柳海平，周明旺，李盛華，陳威，葉丙霖，郭鐵峰，陳嫻

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

目的 探討酒精性股骨頭壞死（AIONFH）高發中醫體質類型痰濕質與CYP2C8基因多態性關系。方法 選取2014年2月－2015年9月于甘肅省中醫院門診及住院部漢族非創傷性股骨頭壞死（NONFH）患者152例，其中AIONFH患者50例作為病例組，同期納入無血緣關系的健康志愿者45人作為對照組，建立所有患者及志愿者病例資料數據庫。判定AIONFH患者中醫體質類型，采用溶液型DNA提取試劑盒提取DNA，檢測DNA濃度及純度，采用普通PCR擴增出目的片段，凝膠電泳檢測擴增的目的基因，并確認其片段長度，進行目的基因測序，結合凝膠電泳及基因測序結果進行統計分析，得出AIONFH痰濕質、非痰濕質患者與對照組的CYP2C8基因多態性與AIONFH發病關系。結果 比較病例組與對照組的CYP2C8基因rs17110453位點多態性，2組各基因型間差異無統計學意義（χ2＝0.253，P＞0.05）；2組等位基因差異無統計學意義（χ2＝0.077，P＞0.05）；病例組CC基因型的發病風險是AA基因型的1.37倍（95%CI：0.339～5.540），兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。AIONFH痰濕質患者與非痰濕質、對照組的基因型及等位基因分布差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論 CYP2C8基因rs17110453位點多態性A/C突變與痰濕質AIONFH的發病風險無明顯聯系，未發現CYP2C8基因rs17110453位點多態性與AIONFH明確關系。

酒精性股骨頭壞死；中醫體質；痰濕質；基因多態性

非創傷性股骨頭壞死（n-traumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH），又稱股骨頭缺血性壞死，屬中醫學“骨痿”“骨蝕”等范疇。NONFH的發病機制復雜，激素、酒精、鐮狀紅細胞病、代謝性疾病、腫瘤、腎臟移植等均與NONFH的發生有一定聯系。即使有上述諸多因素影響，也僅有部分患者發生NONFH，部分個體未出現任何早期癥狀[1]。這種現象逐漸受到重視，其中，用基因多態性學說來解釋上述現象逐漸得到眾多學者青睞。

對酒精性股骨頭壞死（alcohol-induced osteonecrosis of femoral head，AIONFH）患者中醫體質類型深入研究發現，其高發體質為痰濕質[1]。痰和濕是較為常見的病理產物和致病因素，可逐漸引起以“黏滯重濁”為主要表現的體質特征[2]，極易引起脂質代謝紊亂和血液黏滯性增加等異常狀態，可能成為AIONFH發病的高危因素[3]。痰濕質與男性過量飲酒、過食膏粱厚味有密切聯系[4]。目前，NONFH基因多態性研究主要集中于患者血管內皮細胞功能的相關基因、脂代謝相關基因等，尚缺乏藥物代謝相關基因CYP450家族的基因多態性研究。因此，筆者利用基因多態性尋找該疾病的易感基因，探索易感基因與高發中醫體質類型之間可能存在的內在分子生物學聯系，為預防AIONFH提供新的思路與方法，并為治療提供一定的理論依據。

1 臨床資料

1.1 研究對象

病例來源于2014年2月－2015年9月本院門診及住院部的漢族NONFH患者。共收集152例患者病歷資料及血液標本，建立所有患者及健康志愿者資料數據庫。其中AIONFH患者50例為病例組，痰濕質31例，非痰濕質19例，男性46例，女性4例，年齡20～70歲，平均年齡（43.3±11.2）歲；同期收集本院健康體檢中心體檢的健康志愿者45人為對照組，男性35人，女性10人，年齡18～65歲，平均年齡（39.8±10.6）歲。2組性別、年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 西醫診斷標準

NONFH診斷標準包括臨床表現、MRI檢查、X線檢查、CT檢查、核素骨掃描等6項，患者具有股骨頭壞死的臨床癥狀且具有其他輔助檢查的任意1項，即可診斷[5]。AIONFH的診斷標準：單側或雙側股骨頭壞死、無外傷史、明確長期大量飲酒史（每周飲酒量≥320 mL）[6]。

1.3 中醫體質判定標準

依據中華中醫藥學會《中醫體質分類與判定》[7]標準判定。痰濕質多由水液內停、痰濕凝聚引起，主要表現為腹部肥滿、容易困倦、喜食肥甘醇酒、口黏、痰多、胸悶、多汗且黏、身重不爽等。本研究中非痰濕質指除痰濕質以外的其他8種體質，包括平和質、氣虛質、陽虛質、陰虛質、濕熱質、血瘀質、氣郁質、特稟質。

1.4 納入標準

①符合上述診斷標準，包括不同病變程度及治療方式；②年齡18～70歲；③長期大量飲酒史；④愿意接受病例調查、血液標本采集，能有效配合隨訪者。

1.5 排除標準

①有明顯髖部外傷史并確診為創傷性股骨頭壞死者；②病例調查及血液標本采集過程中不愿繼續配合者；③合并類風濕關節炎、強直性脊柱炎、髖臼發育不良等累及髖關節疾病者；④合并嚴重心腦血管病變或其他嚴重的代謝異常疾病及骨腫瘤者；⑤精神疾病、智力障礙或無法理解并配合調查者。

1.6 剔除及脫落標準

①依從性不佳，未能按要求完成病例調查者；②病例調查表中一般信息缺失且缺失項目＞20%者；③病例調查表關鍵信息不完整，無法判斷具體體質者。

2 方法

2.1 血液標本采集

用含EDTA抗凝劑的無菌管采集患者空腹外周血3 mL，及時混勻并盡快保存至-80 ℃冰箱。在使用血液標本前，避免反復凍融，以免引起DNA提取量嚴重降低。

3.3.2 痰濕質患者與對照組比較 痰濕質患者與對照組基因型分布差異無統計學意義（χ2＝0.317，P＞0.05），等位基因分布差異無統計學意義（χ2＝0.012，P＞0.05）；痰濕質患者CC基因型的發病風險是AA基因型的1.5倍（95%CI：0.321～7.008），差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表3。

表3 AIONFH痰濕質患者與對照組CYP2C8基因rs17110453位點基因型及等位基因比較[n（%）]

3.3.3 非痰濕質患者與對照組比較 非痰濕質患者與對照組基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2＝0.056，P＞0.05；χ2＝0.099，P＞0.05），見表4。

表4 AIONFH非痰濕質患者與對照組CYP2C8基因rs17110453位點基因型及等位基因比較[n（%）]

3.3.4 痰濕質、非痰濕質患者比較 痰濕質與非痰濕質患者基因型及等位基因分布差異無統計學意義（χ2＝3.475，P＞0.05；χ2＝0.000，P＞0.05），見表5。

表5 AIONFH痰濕質與非痰濕質患者CYP2C8基因rs17110453位點基因型及等位基因比較[n（%）]

4 討論

AIONFH作為NONFH比較常見的一種類型，常因長期、大量飲酒引發。早在1972年有學者研究發現飲酒與股骨頭壞死之間存在著重要關系，該研究指出，每周飲酒量400～1000 mL的NONFH發生率是＜400 mL人群的3倍，當飲酒量＞1000 mL時，其NONFH的發生率是＜400 mL人群的5倍之多[6]。也有研究發現，AIONFH患者大多存在酗酒或近期內大量飲酒史，部分患者在長期飲酒數年內可能出現單側或雙側髖關節不適癥狀[9]。隨著近年來飲酒人群的不斷增加[10]，AIONFH的發病率可能呈現逐年上升趨勢，不排除超過激素成為引發NONFH的最常見因素的可能[3]。至今AIONFH的發病機制尚未完全明確，嚴重阻礙疾病的治療，預防該病顯得愈加重要。

CYP450是肝酶最常見的一種酶系，主要通過影響體內幾乎所有的脂溶性藥物在肝臟內的代謝過程，目前在人體鑒別出12種以上CYP450亞族，其中人體藥物代謝酶的CYP亞族主要為CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4。近年來關于上述幾種常見亞型的基因多態性研究相對較多，研究發現上述多種亞型的基因多態性與疾病發生存在重要聯系。如Brunner-Ziegler S等[11]研究發現，CYP2C9基因突變的患者股骨頸部位的骨密度較常人明顯降低，且CYP2C9基因突變型患者患有骨質疏松的風險比常人高出4倍，并且CYP2C9亞族CYP2C9*2和CYP2C9*3對抗凝藥物較常人敏感，上述機制可能與股骨頭壞死的發生具有一定聯系。Iwakiri K等[12]研究發現，CYP3A4低活性可能引起股骨頭壞死并對其發展產生重要影響。

CYP2C8作為CYP450家族中的重要一員，近年來關于其基因多態性的研究相對較少。Yi X等[8]研究發現，CYP2C8基因位點rs17110453的多態性與人體局部缺血性疾病有重要聯系，并且該位點的突變可明顯提高其發病風險。鑒于近年來眾多學說認為NONFH的發生與局部的缺血存在重要關系[13]，本課題研究CYP2C8的基因多態性與痰濕質AIONFH的相關性，旨在明確CYP2C8的多態性與AIONFH發病風險是否具有一定關聯，并在此基礎上了解容易引起局部缺血的痰濕質[3]與AIONFH之間的分子生物學基礎和上述因素之間的重要聯系。

本研究結果顯示，病例組與對照組的基因型、等位基因差異無統計學意義，提示CYP2C8基因rs17110453位點的基因多態性對AIONFH發病風險無明顯影響。痰濕質患者與對照組基因型及等位基因分布分析結果顯示，CYP2C8基因rs17110453位點的多態性與痰濕質無直接關系。

上述研究結果并不能完全說明CYP2C8基因多態性與AIONFH痰濕質患者之間沒有必然聯系。其原因可能有以下幾點：①本項研究的結果建立在50例AIONFH的基礎上，可能樣本量過小，對研究結果產生偏倚，從而影響了結果的準確性；②CYP2C8基因存在眾多可能致病的位點，本研究所選擇的rs17110453位點可能與該病的相關性較弱，不排除該基因其他相關位點與痰濕質AIONFH存在重要聯系，需要進一步選取更多的樣本、位點進行研究；③CYP2C8作為CYP450家族中比較重要的一種亞型，該基因可能在人體的代謝作用與酒精之間的關系不夠緊密或者沒太大影響，從而出現該基因位點的多態性與AIONFH無顯著關系。

[1] 李盛華,周明旺,潘文,等.酒精性股骨頭壞死與中醫體質類型的關系[J].西部中醫藥,2014,27(3)：80-82.

[2] 王琦,葉加農,朱燕波,等.中醫痰濕體質的判定標準研究[J].中華中醫藥雜志,2006,21(2)：73-75.

[3] 王東坡.痰濕體質及其基因表達特征研究[D].北京：北京中醫藥大學,2006.

[4] 李曉屏,陳璋秀.412例中醫體質辨識的調查與分析[J].中醫藥導報,2011,17(1)：33-34.

[5] 趙德偉,胡永成.成人股骨頭壞死診療標準專家共識(2012年版)[J].中華關節外科雜志(電子版),2012,6(3)：479-484.

[6] FUKUSHIMA W, HIROTA Y. Alcohol[M]. Berlin： Springer Berlin Heidelberg, 2014.

[7] 中華中醫藥學會.中醫體質分類與判定(ZYYXH/T157-2009)[J].世界中西醫結合雜志,2009,4(4)：303-304.

[8] YI X, ZHANG B, WANG C, et al. CYP2C8 rs17110453 and EPHX2 rs751141 two-locus interaction increases susceptibility to ischemic stroke[J]. Gene,2015,565(1)：85-89.

[9] 郭鐵峰.血瘀質非創傷性股骨頭壞死患者相關基因多態性研究[D].蘭州：甘肅中醫學院,2014.

[10] 馬玉霞,張兵,王惠君,等.1993－2006年中國九省(區)居民酒類消費狀況及變化趨勢[J].中華預防醫學雜志,2011,45(4)：323-329.

[11] BRUNNER-ZIEGLER S, GIURGEA G A, SUNDER-PLASSMANN R, et al. CYP2C9 genotype and association with bone mineral density：a pilot study[J]. Gene,2013,526(2)：295-298.

[12] IWAKIRI K, ODA Y, KANESHIRO Y, et al. A less-invasive technique for the prevention of the occurrence of corticosteroid-induced osteonecrosis by a single-point blood sampling after oral administration of midazolam[J]. Journal of Bone & Joint Surgery, 2012,94(Suppl Ⅷ)：30.

[13] 凌峰,王燕,熊龍,等.股骨頭壞死病因發病機制的研究進展[J].實用臨床醫學,2011,12(11)：132-134,138.

Study on Alcohol-induced Osteonecrosis of Femoral Head of Phlegm-dampness Constitution with CYP2C8 Gene Polymorphism

LIU Hai-ping, ZHOU Ming-wang, LI Sheng-hua, CHEN Wei,

YE Bing-lin, GUO Tie-feng, CHEN Xian (Gansu Province Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China)

Objective To study the relation between alcohol-induced osteonecrosis of femoral head (AIONFH) related with high morbidity TCM constitution type with CYP2C8 gene polymorphisms. Methods Totally 152 Han nationality NONFH cases from Feburary 2014 to September 2015 from outpatient and the inpatient departments in Gansu Province Hospital of TCM were collected. 50 AIONFH cases were set as medical case group; meanwhile, 45 healthy volunteers were enrolled as control group. Database for medical materials of all patients and volunteers was established. TCM distribution for AIONFH patients was determined. Solution DNA extraction kit was used to extract DNA, and detect the concentration and purity of DNA. The target gene was amplified by PCR and the target gene was amplified by gel electrophoresis. The length of the fragment was confirmed to conduct target gene sequencing. With the results of sequencing and gel electrophoresis, the relation of AIONFH with CYP2C8 gene polymorphism in AIONFH patients with phlegm-dampness syndrome and the control group. Results The CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism was not statistically significant between the two groups (χ2=0.253, P＞0.05). There was no significant difference in allele between the two groups (χ2=0.077，P＞0.05). The risk of disease in CCgenotype was 1.37 times higher than the AA genotype (95%CI: 0.339-5.540), without statistical significance (P＞0.05). There was no significant difference in genotype and allele distribution between AIONFH patients with phlegm-dampness and non-phlegm-dampness and the control group (P＞0.05). Conclusion CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism A/C mutation has no obvious relation with AIONFH risk. There is no clear relationship between CYP2C8 gene loci rs17110453 gene polymorphism with AIONFH.

alcohol-induced osteonecrosis of femoral head; TCM constitution; phlegm-dampness constitution; gene polymorphism

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.007

R274.94

A

1005-5304(2017)01-0023-05

2016-04-27）

（

2016-05-11；編輯：季巍巍）

國家自然科學基金（81473712）；甘肅省自然科學基金（1308RJZA189）

周明旺，E-mail:15117192717@163.com