免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)的研究與開發(fā)*

劉 超,王曉榮,許新岳,王換換,王 翔

(南京工業(yè)大學電氣工程與控制科學學院,南京 211816)

免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)的研究與開發(fā)*

劉 超,王曉榮*,許新岳,王換換,王 翔

(南京工業(yè)大學電氣工程與控制科學學院,南京 211816)

針對目前市場上上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)體積較大、不具便攜性、線性范圍窄等缺點,基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫分析原理,充分運用電子學、光電學、機械學等多個學科,對免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)進行研究與開發(fā)。主要內(nèi)容包含光學系統(tǒng)設(shè)計、平臺驅(qū)動系統(tǒng)設(shè)計、嵌入式系統(tǒng)設(shè)計、計算機系統(tǒng)設(shè)計。通過測試,檢測系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性與測量精度,測量相對誤差小于1.5%,表明符合設(shè)計要求,具有一定的應(yīng)用價值。

免疫層析試紙條;上轉(zhuǎn)換發(fā)光;光電檢測;嵌入式系統(tǒng)

上轉(zhuǎn)發(fā)光技術(shù),是以上轉(zhuǎn)發(fā)光材料UCP(Up-Converting Phosphor)[1]顆粒作為示蹤物的一種新型的檢測技術(shù)。將UCP顆粒進行表面的修飾和活化后,便可以結(jié)合種類繁多的生物活性分子,用來作為醫(yī)學檢測的標記物。目前我國醫(yī)學方面即時檢驗POCT(Point Of Care Testing)領(lǐng)域幾乎被國外進口廠家所壟斷,而且市場上的上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)大都有體積較大、不具便攜性、線性范圍窄等缺點。

通過上轉(zhuǎn)發(fā)光結(jié)合免疫層析技術(shù)應(yīng)運而生的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析平臺,是我國自主研制的即時檢驗免疫分析技術(shù)[2]。該系統(tǒng)性價比高,性能優(yōu)異,適用性強的優(yōu)勢,必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益,進一步推動企業(yè)和行業(yè)發(fā)展。本文結(jié)合以上背景,運用多個學科綜合知識,對免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)進行研究與開發(fā)。

1 免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測原理

1.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光原理

一般地,用能量較高的光去激發(fā)材料,才能得到能量較低的光,但是有些材料受激發(fā)時,激發(fā)光能量要高于光源,這種現(xiàn)象稱為反斯托克斯發(fā)光,又稱為上轉(zhuǎn)換發(fā)光[3]。其原理和過程有激發(fā)態(tài)吸收(ESA)、能量傳遞上轉(zhuǎn)換(ETU)和光子雪崩(PA)3種:激發(fā)態(tài)吸收是上轉(zhuǎn)換發(fā)光的基本過程,是同一個離子從基態(tài)通過連續(xù)多光子吸收到達能量較高的激發(fā)態(tài)的過程;能量傳遞是指通過非輻射過程將兩個能量相近的激發(fā)態(tài)離子藕合,其中一個把能量轉(zhuǎn)移給另一個回到低能態(tài),另一個離子接受能量而躍遷到更高的能態(tài);光子雪崩是能量相同的粒子會泵吸能量不同的粒子,使得粒子間能量轉(zhuǎn)換效率大于一。由于發(fā)生了交叉弛豫作用,粒子處于平衡狀態(tài)的時間會變短,從而產(chǎn)生的光強增大,這時便會出現(xiàn)上轉(zhuǎn)換現(xiàn)象[4]。根據(jù)上轉(zhuǎn)換發(fā)光的機理,普通發(fā)光、單離子吸收雙光子發(fā)光和上轉(zhuǎn)換發(fā)光的原理圖如圖1所示。

圖1 3種發(fā)光情況出現(xiàn)的原理圖

1.2 免疫層析試紙條檢測原理

免疫層析試紙條基于免疫標志物顯色或者發(fā)光的原理,通過檢測帶和質(zhì)控帶來定性或定量地檢測待測物。使用時,將樣品滴到樣品墊上,由于吸水墊可以產(chǎn)生虹吸作用,所以樣品會流經(jīng)結(jié)合墊,結(jié)合墊中具有UCP及抗體結(jié)合物,樣品中如果具有待測物質(zhì)便會與其發(fā)生反應(yīng)。在層析過程中免疫復(fù)合物被富集在層析材料的T線區(qū)域,而游離的標記物則越過T線與C線上的受體發(fā)生高特異性免疫反應(yīng),達到與標記的結(jié)合物自動分離和富集,因此根據(jù)顏色的有無或發(fā)光強度可以定性或者定量地判定待測物質(zhì)的存在或濃度。圖2是免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖。

圖2 免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)

本研究設(shè)計的檢測系統(tǒng)運用了多個學科的知識,首先運動平臺帶動試紙條運動,使得光電檢測系統(tǒng)可以對試紙條上的每一個點進行掃描,從而檢測到T帶和C帶上的UCP顆粒物含量,經(jīng)過運算便可以計算出待測液體中需要確定的生物分子含量。在檢測時,試紙條表面會被紅外光照射,由于每種UCP需要的激發(fā)光波長和頻率不一樣,所以要根據(jù)實際情況選擇所需的光源。試紙條受到激發(fā)后,會發(fā)出可見光。此時便需要通過成像系統(tǒng)濾除雜散光,將一定波長的上轉(zhuǎn)換光聚集到光電檢測元件上,光電檢測原件檢測光信號并將其轉(zhuǎn)換為電壓信號,方便后續(xù)處理。最后由嵌入式系統(tǒng)采集并處理采集來的電信號,并依據(jù)一定算法計算出結(jié)果[5]

2 系統(tǒng)架構(gòu)及實現(xiàn)方案

2.1 整體架構(gòu)

上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)主要由4部分組成,包括光學系統(tǒng)、平臺驅(qū)動系統(tǒng)、嵌入式系統(tǒng)、計算機系統(tǒng),整個系統(tǒng)的框圖如圖3所示。

圖3 系統(tǒng)整體架構(gòu)

光學系統(tǒng)中,免疫層析試紙條表面受到半導體激光器的激發(fā),發(fā)出UCP上轉(zhuǎn)換光。通過成像系統(tǒng)將UCP上轉(zhuǎn)換光分布成像在光電倍增管光敏面上。光電倍增管將接收到的上轉(zhuǎn)換光信號轉(zhuǎn)換為電壓信號。

平臺驅(qū)動系統(tǒng)中,步進電機帶動工作平臺一起運動,從而帶動平臺上的試紙條運動,使得光學系統(tǒng)采集到試紙條上每一個點的上轉(zhuǎn)換光信號。

嵌入式系統(tǒng)中,電壓信號通過濾波電路、AD采樣傳輸給主芯片,在經(jīng)過一系列算法后,計算出待測液體的濃度值,并實時顯示,方便用戶觀察。

計算機系統(tǒng)中,將嵌入式系統(tǒng)通過串口傳輸過來的數(shù)據(jù)進行顯示、存儲。

將前3個分系統(tǒng)置于密閉箱中,并通過USB連接到計算機系統(tǒng),實物架構(gòu)如圖4所示。

圖4 實物架構(gòu)圖

2.2 光學系統(tǒng)和平臺驅(qū)動系統(tǒng)

光學系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、光電探測器3個部分構(gòu)成,其結(jié)構(gòu)如圖5所示。980 nm半導體激光器發(fā)出的光由柱面鏡形成光斑,通過分色鏡的反射,照射在免疫層析試紙條上。激發(fā)出來的上轉(zhuǎn)換發(fā)光通過聚焦鏡的準直,再透過分色鏡和濾光鏡,濾去雜散光,最后經(jīng)由聚焦鏡聚焦于光電倍增管光敏面上[6]。

圖5 光學系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

針對層析試紙條進行一維掃描測量,設(shè)計了平臺驅(qū)動系統(tǒng),帶動試紙條進行一維運動。平臺驅(qū)動系統(tǒng)主要由一維運動平臺、步進電機、步進驅(qū)動器、步進電機控制器4個部分組成。試紙條放置在由步進電機驅(qū)動的一維運動平臺上,來進行試紙條的一維掃描測量。一維運動平臺由傳動螺母、絲桿、聯(lián)軸器、傳感器組成。步進電機帶動絲桿使平臺在一維軌道上不斷運動。運動的長度和步進電機轉(zhuǎn)動的角度有關(guān),而運動方向由電機轉(zhuǎn)動方向決定。傳感器實時捕捉平臺運動的狀態(tài),并將信號傳輸給步進電機控制器,使電機的運動狀態(tài)發(fā)生改變。

3 嵌入式系統(tǒng)

3.1 硬件設(shè)計

嵌入式系統(tǒng)是檢測系統(tǒng)中最為關(guān)鍵的部分,為了使免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)達到高可靠性、高精度、高穩(wěn)定性,必須對其硬件進行合理設(shè)計。嵌入式系統(tǒng)主要實現(xiàn)對光學系統(tǒng)輸出的電壓信號進行采集、處理、存儲、傳輸,以及步進電機的控制。依據(jù)上述功能要求嵌入式系統(tǒng)的主要構(gòu)成為AD采樣模塊—采集數(shù)據(jù)、CPU—處理及控制、光耦—控制平臺、液晶屏—顯示濃度值以及濃度曲線、外部Flash—存儲數(shù)據(jù)、USB數(shù)據(jù)傳輸—傳輸數(shù)據(jù)、電源—供電。將這些器件置于一塊PCB板上,其硬件架構(gòu)如圖6所示。

圖6 嵌入式系統(tǒng)硬件架構(gòu)圖

系統(tǒng)中采集的模擬信號為光學系統(tǒng)傳輸過來電壓信號,雖然光電探測器SiPM模塊輸出范圍為0～5 V,但是由于上轉(zhuǎn)換光信號較為微弱,該模塊的輸出范圍為0～1 V。所以選用AD7705芯片來進行A/D轉(zhuǎn)換。

AD7705是一款Σ-Δ16位用來進行A/D轉(zhuǎn)換的芯片,自帶校正功能[7],其內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖7所示。它由前端模擬調(diào)節(jié)電路包含增益可編程放大器(PGA)與緩沖器、可編程數(shù)字濾波器以及Σ-Δ調(diào)制器等組成。當AD7705接收到傳感器信號后,會根據(jù)自身的量程將信號范圍放大。

圖7 AD7705內(nèi)部結(jié)構(gòu)

AD7705 芯片的接口屬于串行通信,與主芯片連接時使用三線制。外圍電路如圖8所示,AIN1(+)、AIN1(-)和AIN2(+)、AIN2(-)為兩組模擬信號輸入端,可以配置成差分輸入和單極性輸入;CS為片選信號端,低電平有效;DOUT用來輸出結(jié)果,DIN 用來輸入待轉(zhuǎn)換的傳感器信號;SCLK為芯片提供時序脈沖,一般和CPU相連,來給出高低電平,低電平表示AD 轉(zhuǎn)換結(jié)束可以讀取數(shù)據(jù),高電平表示數(shù)據(jù)正在更新中;REF(+)、REF(-)為基準信號輸入端。當外接基準電壓2.5 V時,精度較高,因此選用了LM285D芯片進行供電,它可以穩(wěn)定地輸出2.5 V電壓。

圖8 AD7705相關(guān)電路

3.2 算法設(shè)計

免疫層析試紙條上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)最終顯示結(jié)果為待測液體的圖譜與濃度值,結(jié)果都是通過嵌入式軟件處理計算得出的。

在實際的檢測過程中,由于受到噪聲干擾,波形圖并不會和理想的一樣。不僅曲線比較毛糙,還會出現(xiàn)基線發(fā)生漂移且受到干擾等情況。因此需要先進行濾波去噪以及基線擬合來去除干擾,再檢峰并計算峰面積值。上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫試條檢測的算法流程圖如圖9所示。

本系統(tǒng)采用滑動平均的方法對原始數(shù)據(jù)進行濾波,每次采用前5個光強值做平均替換后一個光強值。這種方法既可以使曲線變得平滑,又可以防止有效信號被濾除。由于溫度和背景光等干擾,光強曲線的基線會出現(xiàn)漂移,使用最小二乘法對原始數(shù)據(jù)擬合出本底數(shù),并將原始數(shù)據(jù)減去本底數(shù)。最終濃度值的計算,將在做好前期處理的檢測帶與控制帶峰值附近取M點求平均值,將得到的C、T平均值做比值,再將計算出的T/C值代入標準濃度與T/C值擬合的線性方程中,最后反推出樣品濃度。

圖9 算法流程圖

3.3 軟件設(shè)計

軟件程序根據(jù)系統(tǒng)中各個功能模塊進行劃分,主要可以歸納為:A/D采樣模塊、算法設(shè)計模塊、外部存儲模塊、液晶屏模塊及USB通訊模塊等。軟件系統(tǒng)的總體架構(gòu)如圖10所示。

首先,激光激發(fā)的上轉(zhuǎn)換光信號被PMT接收后轉(zhuǎn)換為電壓信號,再經(jīng)過AD采樣后轉(zhuǎn)化為光強數(shù)值信號,并發(fā)送給STM32F103RB。它接收到這些信號后,存入外部FLASH,使得后續(xù)程序可以調(diào)用這些數(shù)據(jù),并對這些數(shù)據(jù)進行處理。AD模塊將模擬信號轉(zhuǎn)換為電壓信號后,CPU需要先通過滑動平均算法對數(shù)據(jù)進行濾波,再通過最小二乘法擬合直線,最后進行比值計算等,從而計算出待測物濃度。最終,將檢測的濃度結(jié)果值和原始的光強曲線傳輸?shù)接嬎銠C系統(tǒng)進行進一步研究。

圖10 嵌入式軟件架構(gòu)圖

4 計算機系統(tǒng)設(shè)計

借助LabVIEW開發(fā)平臺,將各個功能的程序封裝為一個圖標,調(diào)用程序圖塊,來實現(xiàn)功能。利用LabVIEW圖形顯示的基本方法——波形圖和電子表格函數(shù),更加方便、直觀的顯示存儲的數(shù)據(jù)[8]。圖11為使用LABVIEW調(diào)用儲存于計算機系統(tǒng)中的濃度為750 ng/mL的光強曲線圖,圖中數(shù)據(jù)已通過算法處理。

圖11 750 ng/mL數(shù)據(jù)處理后的光強曲線

5 測試分析和總結(jié)

5.1 穩(wěn)定性測試

為了檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性,實驗時采用濃度為200 ng/mL的同一根試紙條測量10次。然后通過公式:

(1)

計算出變異系數(shù),式中xmax表示樣品濃度測量最大值,xmin表示樣品濃度測量最小值,表示標準氣的濃度。

將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定性曲線,如圖12所示,T/C線較為平緩,可以表明此系統(tǒng)比較穩(wěn)定。

圖12 同一試紙條多次測量曲線

5.2 重復(fù)性測試

測試時,選取8種不同濃度的標準液體,然后對每種標準液體進行十次測量,實驗數(shù)據(jù)如表1所示。衡量重復(fù)性的計算公式為:

u=(SD/Mean)×100%

(2)

式中:SD表示測得數(shù)據(jù)的標準差,Mean表示測得數(shù)據(jù)的平均值,可以計算出系統(tǒng)以8種不同濃度待測液體測量時的不確定度,從計算結(jié)果可以得知不確定度皆小于1.5%,從而表明系統(tǒng)有很好的重復(fù)性。

5.3 總結(jié)

該系統(tǒng)基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫分析原理,通過激光激發(fā)上轉(zhuǎn)換光設(shè)計光學系統(tǒng),利用一維運動平臺帶動試紙條運動設(shè)計平臺驅(qū)動系統(tǒng),通過光強檢測確定樣品濃度設(shè)計嵌入式系統(tǒng),利用計算機實現(xiàn)歷史數(shù)據(jù)調(diào)用與顯示設(shè)計了計算機系統(tǒng)。4個分系統(tǒng)相互配合,從實驗結(jié)果可以表明,該系統(tǒng)具有良好的實用性與可行性,滿足檢測需求。

表1 不同濃度試紙條重復(fù)測量得到的T/C值

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ResearchandDevelopmentofImmunoassayTestStripUp-ConversionLuminescenceDetectionSystem

LIUChao,WANGXiaorong*,XUXinyue,WANGHuanhuan,WANGXiang

(College of Electrical Engineering and Control Science,Nanjing TECH University,Nanjing 211816,China)

Regarding to the shortcomings of larger volume,less portability,narrow linear range and others of the present market,up-conversion luminescence detection system,a subject is proposed based on up-conversion luminescence immunity analysis principle. It will make full use of the comprehensive knowledge of multiple disciplines including electronics,photonics,mechanics and so on,conduct research and development on immune chromatography test paper strip up-conversion luminescence detection system driving. The main contents include optical system design,platform drive system design,embedded system design,computer system design. After experiments,it has good stability and measurement accuracy,the measurement relative error is less than 1.5%. The test shows that the test system meets the design requirements,and has certain application value.

immune chromatography test strip;up-conversion luminescence;photoelectric detection;embedded system

10.3969/j.issn.1005-9490.2017.06.049

2016-09-25修改日期2017-01-03

TN247

A

1005-9490(2017)06-1588-05

劉超(1991-),男,碩士研究生,研究方向為嵌入式系統(tǒng),近紅外光譜,705458806@qq.com;

王曉榮(1972-),男,漢族,副教授主要研究方向為分析儀器主要研究方向為分析儀器和嵌入式系統(tǒng),wang@njtech.edu.cn。