基于骨架化模型的染色體形態表征

高 明, 王 婷, 王一鳴, 田 寧

(沈陽師范大學 物理科學與技術學院, 沈陽 110034)

材料科學

基于骨架化模型的染色體形態表征

高 明, 王 婷, 王一鳴, 田 寧

(沈陽師范大學 物理科學與技術學院, 沈陽 110034)

染色體作為遺傳物質的重要載體,其空間構象(主要指染色體數量、結構、定位等形態信息)與包括基因表達、表觀遺傳在內的一些基本的細胞生命活動關聯緊密。染色體形態改變是引起人類某些重大疾病(如唐氏綜合癥、惡性腫瘤等)的重要原因之一。為實現染色體形態的準確、量化分析,針對光學成像設備采集染色體圖像含冗雜信息過多的問題,基于骨架化理論,通過二值轉換及距離變換等計算方法,抽取染色體的拓撲結構,以減少冗余信息。進一步,提出利用骨架長度、端粒數目及著絲粒分界比,數字化表征染色體的拓撲形態。因此,利用自動化手段建立了一種量化表征染色體形態信息的方法,這將為染色體識別及形態研究提供重要思路。

骨架化; 染色體; 拓撲形態

0 引 言

染色體作為遺傳物質的重要載體,其生物形態與表觀修飾,遺傳與變異,及重大疾病的產生關聯緊密[1-3]。染色體形態主要通過熒光標記技術(如熒光原位雜交)結合光學成像技術而獲得[4-5]。并通過染色體圖像的體積、表面積、形狀等幾何指標來表征染色體的生物形態[2]。這些幾何指標只是一種半定量的形態表征手段,它們的精確度往往受到光學成像技術分辨率的限制。因此需要更完善的方法來全面表征染色體的生物形態[6]。

在自動化研究中,骨架提取及邊緣檢測在圖像識別領域中應用廣泛[7-10]。其中利用圖像骨架來表征圖像形態,是有效剔除冗雜信息,保留圖像拓撲結構特征的有效技術手段[8]。骨架化方法已廣泛應用于植物根莖模擬、葉片脈絡分析、肺血管重建等領域[11-13]。鑒于此,本文以骨架化理論為基礎,獲得染色體的拓撲結構(即染色體骨架),并以長度、端點數目、著絲粒分界比等指標數字化表征染色體骨架,以區分不同染色體的形狀特征。本文提出的染色體骨架分析,將為染色體識別及形態研究提供重要的途徑。

1 實驗方法

1.1 樣品制備

1) 將雌性ICR小鼠于處死前4 h注射3 μg/g的秋水仙素,4 h后脫頸椎處死,摘取后肢股骨;

2) 用低滲液(0.075 mol/L KCl)反復沖洗骨髓腔,收集骨髓細胞;

3) 再將骨髓細胞移入預溫至37 ℃的低滲液至8 mL,置于37℃水浴鍋內30 min;

4) 然后,加入1 mL新制固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1),混勻后以1 500 r/min離心5 min;

5) 棄上清,再加入5 mL固定液,混勻固定15 min,離心5 min后,再棄上清;

6) 再加入0.3 mL固定液制成細胞懸混液;

7) 在干凈、濕冷載玻片上20 cm處滴2滴細胞懸液;

8) 氣干后,DAPI染色5 min,清洗后,即可顯微鏡下觀察。

1.2 染色體骨架化

1) 圖像預處理

光學系統成像時,在數據采集與傳輸的過程中,常受到外界干擾,從而對光學圖像引入噪聲及失真。這些噪聲或圖像失真使得人們對熒光圖像的觀察受到影響,對圖像信息的理解受到干擾。成像系統采集的圖像g,與真實圖像f的關系為g=f×h+n。其中h為成像系統的點擴散函數,n為噪聲。鑒于此,本文圖像預處理過程,首先為去噪。熒光顯微鏡產生的主要噪聲為椒鹽噪聲,中值濾波是有效去除椒鹽噪聲的方法[1]。隨后進行盲反卷積操作。根據成像設備的參數(激發波長為358 nm,物鏡為尼康100倍油鏡,物鏡油折射率為1.515),構建系統的點擴散函數,再盲反卷積,以盡量恢復真實的熒光圖像。

2) 圖像分割

光學圖像獲得后,需要將圖片中前景與背景分離開,以便研究前景圖像的形態特點。圖像分割是指將數字圖像根據不同的特征,細分為若干個圖像子區域的過程。每個子區域對應的是一個具有某種共同視覺特性的像素集合。本文以人機交互的方式設定分割閾值,即人眼的視覺識別與圖像數字直方圖的分界協同確定閾值,并將灰度大于閾值的像素點設定為前景圖像,小于閾值的設定為背景圖像。

3) 二值化

圖像的二值化就是將圖像上的所有像素點的灰度值分別設置為0或255這兩個不同的值,這樣就將整個圖像的視覺效果呈現出只有黑和白的(二值)圖像。在這里將要處理圖像的前景像素的灰度值均設置為255,圖像的背景像素的灰度值均設置為0,使灰度圖像變為黑白(二值)圖像。

4) 骨架提取

5) 圖像后處理

由不規則的染色體邊界及圖像噪聲等因素的干擾,所抽取的染色體骨架存在著很多毛刺(異化分支)。這種畸變(毛刺)將影響染色體拓撲形態的表征。本文以分支長度和方向為指標,判定原骨架中各分支是否為毛刺,以保證修剪后骨架質量更能準確地表征染色體拓撲形態。分支長度的劃分標準一般為小于最長分支1/3的視為毛刺。分支方向的劃分標準為分叉中夾角小于90°的一般視為毛刺。自動化修剪后骨架仍需人工檢驗,以摒除計算誤差。

1.3 染色體骨架分析

1) 骨架長度

對二值圖像骨架提取后的骨架進行長度的計算。結合單個像素代表的幾何大小(0.84 μm×0.84 μm),計算染色體骨架的8鄰域長度,獲得染色體骨架尺寸。

2) 端粒數目

處理后的圖像骨架由單個像素點連接而成,每個染色體骨架端點數目代表染色體的端粒數目。(端點在8鄰域范圍內只有一個像素點)。分別對每個染色體骨架進行觀察、記錄并整理出端粒數。

3) 著絲粒分界比

不同染色體的著絲粒位置也各有不同,對圖像進行骨架提取的染色體骨架中分叉點代表染色體的著絲粒位置。(分叉點在8鄰域范圍內有≥3個像素點)。一條染色體骨架中,端點到分叉點的距離之比,定義為著絲粒分界比。

2 實驗結果

2.1 染色體圖像預處理、分割、二值化結果

依實驗方法,原始圖片(圖1a)經2×2中值濾波去除噪聲(圖1b),而后經盲反卷積修復(圖1c),圖像質量得到了極大的改善。以灰度64為閾值分界,分割染色體圖像的前景與背景,圖片中灰度值64～255的像素選定為染色體區域,即為前景目標;灰度值0～63的像素設定為背景目標,圖1d顯示分割結果。隨后,將分割圖像進行二值變換,灰度圖轉變為二值圖(圖1e)。

圖1 染色體原始圖像的預處理(a～c)、分割(d)及二值轉換(e)Fig.1 Preprocessing(a～c), segmentation(d) and binaryzation(e) of original image of chromosomes

2.2 染色體骨架提取及毛刺去除結果

由上節骨架提取算法,從染色體二值圖像中可獲得染色體骨架,可以看到染色體的初提取骨架存在很多毛刺(圖2a),這些毛刺是一種非結構性分支,由圖像噪聲及細節引入。以分支長度和方向為指標,設置毛刺劃分門限,并以人類視覺觀察為最終較驗體系,對初提取骨架進行毛刺篩查及剔除,毛刺去除后的染色體最終骨架見圖2b和圖2c?？梢?最終骨架可正確反映染色體臂長及著絲粒位置,是染色體結構的準確體現。

圖2 染色體骨架初提取示意(a)及毛刺去除效果(b,c)Fig.2 Initial skeleton extraction of chromosomes (a) and deburring (b, c)

2.3 染色體骨架分析結果

本文以長度、端粒數目及著絲粒分界比來分析染色體骨架(圖3),從而確定染色體的形態特點。本文中,以染色體骨架長度長短的順序依次命名染色體(圖4),并在表1中顯示了ICR雌性小鼠中期骨髓細胞40條染色體骨架的形態分析結果。

圖3 染色體骨架分析示意Fig.3 Illustration of chromosome skeleton analysis

圖4 依骨架長度命名染色體Fig.4 Chromosomes named after skeleton length

染色體編號長度/μm端粒數目著絲粒分界比rst15.7441.11rst25.7841.25rst35.0741.89rst45.0542.03rst55.0541.57rst65.0441.62rst75.042>10rst85.022>10rst94.732>10rst104.732>10rst114.7142,76rst124.7042.89rst134.4142.15rst144.4042.13rst154.3842.23rst164.3742.26rst174.0641.52rst184.0441.34rst193.7239.83rst203.7139.94染色體編號長度/μm端粒數目著絲粒分界比rst213.7041.19rst223.7041.25rst233.7041.29rst243.6941.51rst253.682>10rst263.682>10rst273.6834.21rst283.6734.03rst293.4041.56rst303.3941.37rst313.392>10rst323.392>10rst333.362>10rst343.352>10rst353.0541.23rst363.0341.47rst372.732>10rst382.722>10rst392.702>10rst402.692>10

3 討 論

染色體是遺傳物質在細胞分裂中期的存在形式,是染色質緊密蜷縮的結果,其作為遺傳物質的重要載體, 其形態研究對發育、遺傳及變異等基礎研究有重要作用,在臨床應用中, 也是白血病等惡性血液病的重要診斷依據[1,14]。生物醫學中, 染色體形態研究的常用方法是基于Giemsa染色的G帶帶型分析[15-16],該方法比較成熟,可準確呈現染色體組型, 但該方法需要較多的生化操作, 且由于成像及染色的影響容易造成帶紋壓縮誤差。 因此,本文嘗試提出一種更簡潔方便的染色體形態研究方法。 利用骨架化理論分析ICR小鼠中期骨髓細胞的染色體拓撲結構,并以骨架長度、端粒數目及著絲粒分界比(著絲粒位置)標記染色體形態。 一副圖像的骨架是這幅圖像的重要形態特征,是圖像拓撲結構的直觀描述, 通常以計算圖像中軸線的方式獲得骨架。 利用骨架化方法獲得染色體的拓撲信息,是利用計算機技術輔助人類視覺觀察的重要改進, 這提高了染色體識別的工作效率,將染色體形態研究推向自動化。 本文獲得的ICR雌性小鼠染色體骨架形態包括X型、V型及U型, 其中X型對應著中著絲粒和近中著絲粒染色體,V型和U型對應的是近端著絲粒和端著絲粒染色體。 著絲粒分界比為1～1.70的染色體定義為中著絲粒染色體;1.71～3.00的定義為近中著絲粒染色體; 3.01～7.00的定義為近端著絲粒染色體;大于7.00的定義為端著絲粒染色體[16]。按此定義,本文數據顯示ICR雌性小鼠骨髓細胞中共有40條染色體,長度范圍為2.69～5.74 μm,其中14個為中著絲粒,8個為近中著絲粒,2個為近端著絲粒,16個為端著絲粒。 不同品系的實驗小鼠在基因表達、遺傳與變異、及惡性腫瘤研究中均具有非常重要的應用。 ICR小鼠是藥物篩查及病理研究中常用的動物模型,非常廣泛地應用于藥理、毒理、腫瘤等科學研究中[1,6-7]。本文對ICR雌性小鼠染色體形態的研究也為基于該品系小鼠的相關研究應用提供重要參考。

本文利用去噪、盲反卷積技術對染色體圖像進行預處理,并通過三維自動分割技術分離出染色體前景圖像;基于骨架化理論,應用距離變換算法獲得了染色體骨架;最后,通過長度、端粒數目及著絲粒分界比量化表征了染色體的拓撲形態。該方法可以準確提取染色體的結構化骨架,并能數字化染色體形態。這對于基于染色體形態的臨床診斷及基礎研究有重要實用價值。

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Morphologicalcharacterizationofchromosomesbasedonskeletonmodel

GAOMing,WANGTing,WANGYiming,TIANNing

(College of Physics Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Chromosome is the important carrier of genetic material, the spatial configuration(namely chromosomal numbers, structure and localization) of which has a close link with the fundamental biological processes in cell such as gene expression and epigenetic inheritance. Chromosomal morphology aberrations are related to the serious disease(such as down’s syndrome, malignant tumor) which threaten human health. To realize the accurate and quantitative analysis of chromosomal morphologies, this work extracted the topology structure of chromosomes based on the skeletonization theory of binary image conversion and distance transform, to overcome the problem of too much miscellaneous information caused by optical imaging equipment. Further, topological morphology of chromosomes was quantitatively characterized by skeleton length, telomere number and centromere boundary ratio. Based on the automation, this paper established a method of quantitatively characterizing the chromosomal morphology, and this paper will provide important thought for chromosome recognition and morphological study.

skeletonization; chromosome; topological morphology

2017-07-18。

遼寧省科技廳自然科學基金資助項目(2015020715)。

高 明(1964-),男,遼寧沈陽人,沈陽師范大學教授,博士;

田 寧(1985-),女,遼寧沈陽人,沈陽師范大學副教授,博士。

1673-5862(2017)04-0395-05

Q63

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.04.003