山仔水庫(kù)主要水華藍(lán)藻種類(lèi)的分離與鑒定

周志華+翁笑艷+舒惠琳+莊惠如

摘要：以福州山仔水庫(kù)藍(lán)藻發(fā)生期的水樣為材料，分離獲得了2株形態(tài)不同的藍(lán)藻。在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以16SrRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)分離獲得的2株水花藍(lán)藻進(jìn)行了分子鑒定。結(jié)果顯示：山仔水庫(kù)夏秋發(fā)生的水華優(yōu)勢(shì)種為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa ），春末發(fā)生的水華優(yōu)勢(shì)種為浮游魚(yú)腥藻（Anabaena planctonica ）。研究首次對(duì)山仔水庫(kù)不同季節(jié)的水花藍(lán)藻種類(lèi)進(jìn)行了生物鑒定，其結(jié)果可為藍(lán)藻水華的監(jiān)測(cè)與防治提供基礎(chǔ)性資料。

關(guān)鍵詞：山仔水庫(kù)；藍(lán)藻水花；分子鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：X52

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：16749944（2017）22001304

1 引言

水華是淡水水體富營(yíng)養(yǎng)化進(jìn)程中形成的有害現(xiàn)象，是湖庫(kù)生態(tài)系統(tǒng)退化的典型表征。藍(lán)藻是最簡(jiǎn)單、最原始的的原核生物之一，是形成水花的最常見(jiàn)物種。已知藍(lán)藻約有2000多種，由于藍(lán)藻具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，分布極廣，因此也具有較高的遺傳多樣性。

山仔水庫(kù)是福州市及其周邊地區(qū)的第二飲用水源地。山仔水庫(kù)自2000 年首次發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻水華以來(lái)，藍(lán)藻水華現(xiàn)象常年頻發(fā)[1，2]。本課題在生態(tài)調(diào)研中，發(fā)現(xiàn)庫(kù)區(qū)的水華優(yōu)勢(shì)種有明顯的季節(jié)更替現(xiàn)象。根據(jù)形態(tài)特征初步判斷水華優(yōu)勢(shì)種為微囊藻屬（Microcystis）和魚(yú)腥藻屬（Anabaena）的種類(lèi)[3，4]。傳統(tǒng)的藻類(lèi)種類(lèi)鑒定方法主要是依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定。由于藍(lán)藻不同物種間的差別十分細(xì)微，且環(huán)境因素對(duì)藻體的形態(tài)也有很大的影響，因此，在光學(xué)顯微鏡下，藍(lán)藻種類(lèi)的鑒定存在一定的困難與偏差。此外，魚(yú)腥藻屬的定種一般需要孢子的形態(tài)特征，而本次調(diào)研沒(méi)有發(fā)現(xiàn)孢子，故形態(tài)上無(wú)法定種。因此有必要進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定。

分子生物學(xué)方法由于操作容易、結(jié)果可靠，已被廣泛應(yīng)用在環(huán)境微生物群體的測(cè)定和鑒別上。目前用于藍(lán)藻分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)生研究的方法主要有核糖體的16SrRNA和ITS等基因，并取得一定效果[5，6]。本專(zhuān)題在山仔水庫(kù)藍(lán)藻水華爆發(fā)期間，分離純化獲得兩株水華藍(lán)藻。在形態(tài)分類(lèi)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提取水華藍(lán)藻的基因組DNA，克隆其16SrRNA基因并進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交GenBank，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以確定兩種水華藍(lán)藻的遺傳屬性。

2 材料與方法

2.1 藻株分離純化

于2015年4月至2016年5月的水華發(fā)生期間，在山仔水庫(kù)藍(lán)藻水華聚集處用浮游生物網(wǎng)多次采集帶有藍(lán)藻水華的水樣。獲取的水樣立即送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。 絲狀體種類(lèi)采用毛細(xì)管分離法；單細(xì)胞和群體類(lèi)型的種類(lèi)則采用平板分離法。

分離后的藻細(xì)胞經(jīng)多次平板分離純化，最后挑取純化后的單藻落用錐形瓶進(jìn)行擴(kuò)培。培養(yǎng)用BG11培養(yǎng)基，于恒溫光照培養(yǎng)箱保種培養(yǎng)，光強(qiáng)為1500～2000 lx，光暗周期12：12 h，溫度控制為25±1 ℃。

2.2 形態(tài)分類(lèi)鑒定

分別取水華發(fā)生期的水樣和分離純化藻株的培養(yǎng)物制成臨時(shí)水裝片，直接于Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，并根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[7，8]進(jìn)行形態(tài)分類(lèi)鑒定。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

將分離純化后的藻株富集培養(yǎng)，取生長(zhǎng)期藻細(xì)胞用DNA試劑盒提取藍(lán)藻基因組DNA。用于擴(kuò)增藍(lán)藻16SrRNA的引物為原核生物通用引物（由鉑尚生物公司合成）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，并將測(cè)序結(jié)果和從Genebank上下載的序列通過(guò)分子進(jìn)化遺傳分析軟件Mega5.05進(jìn)行對(duì)位排列，并采用鄰接法（NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩株水華藍(lán)藻形態(tài)特征

在山仔水庫(kù)藍(lán)藻水華發(fā)生期間，直接采集水華樣品進(jìn)行光學(xué)顯微觀察，鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，春季發(fā)生的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)為一種絲狀體型的藍(lán)藻；夏秋發(fā)生的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)為不定型膠群體藍(lán)藻。兩種水華藍(lán)藻種類(lèi)的形態(tài)特征如下。

（1）群體體型的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)（見(jiàn)圖1）。其藻體呈橄欖綠色，為不規(guī)則團(tuán)塊狀，或形成穿孔的網(wǎng)狀團(tuán)塊膠群體。群體膠被無(wú)色透明，邊緣部份水化。細(xì)胞球形、近球形，直徑約3～5 μm。群體中細(xì)胞分布均勻，有時(shí)密貼。細(xì)胞原生質(zhì)體灰綠色、藍(lán)綠色，具偽空泡（氣囊）。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)微囊藻屬種的描述，其形態(tài)特征與銅綠微囊藻種類(lèi)接近。故初步鑒定為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa ）。

（2）絲狀體型的藍(lán)藻（見(jiàn)圖2）。藻體單生，無(wú)明顯膠被。藻絲直或稍微彎曲，末端不變細(xì)。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞球形或扁球形，寬為7.7～11.4 μm，長(zhǎng)約4.9～11.4 μm，細(xì)胞具氣囊。異形胞為球形或扁球狀，直徑約8.3～10.7 μm，未發(fā)現(xiàn)有孢子。從藻體形態(tài)來(lái)看，該絲狀藍(lán)藻與文獻(xiàn)[9]中魚(yú)腥藻屬的形態(tài)特征描述相符。由于未發(fā)現(xiàn)孢子，而孢子的形態(tài)、位置是魚(yú)腥藻屬的定種依據(jù)之一，故只能初步鑒定山仔水庫(kù)的絲狀藍(lán)藻為魚(yú)腥藻（Anabaena sp.）。

3.2 兩株水華藍(lán)藻16SrRNA序列

經(jīng)分離純化后，獲得2株純化培養(yǎng)物。膠群體型和絲狀體型的水華優(yōu)勢(shì)藻分別編號(hào)為：藻株B1-14和藻株B1-15。取生長(zhǎng)期藻細(xì)胞分別提取不同藻株的基因組DNA，并擴(kuò)增藍(lán)藻16SrRNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳和溴化乙錠染色后，兩種藍(lán)藻都具有明亮的條帶（圖3），大小均在1000bp和2000bp之間，與預(yù)想的結(jié)果一致，因此可基本斷定它們就是目的片段。

3.3 兩株水華藍(lán)藻16Sr RNA同源性分析

將上述的序列提交GenBank，分別得到兩者的登錄號(hào)， 藻株B1-14的登錄號(hào)為KP635086， 藻株B1-15的序列號(hào)為KP635087。將兩者的16SrRNA與NCBI中的序列進(jìn)行Blast，結(jié)果顯示，藻株B1-14的16SrRNA序列與微囊藻屬的銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）具有99%的同源性；藻株B1-15的16SrRNA序列與魚(yú)腥藻屬的浮游魚(yú)腥藻（Anabaena planctonica）具有99%的同源性。由系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出（圖4、5），山仔水庫(kù)分離的藻株B1-14與M.aeruginosa的進(jìn)化關(guān)系最近，與其它Microcystis sp.的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；藻株B1-14與A. planctonica 的進(jìn)化關(guān)系最近，與其它Anabaena sp.的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)合形態(tài)分類(lèi)鑒定，可以確定這兩株分離自山仔水庫(kù)的水華優(yōu)勢(shì)種為銅綠微囊藻和浮游魚(yú)腥藻。分別定名為Microcystis aeruginosa B1-14和Anabaena planctonica B1-15。endprint

4 討論與結(jié)論

浮游植物種類(lèi)鑒定不僅是水生生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)，更是水環(huán)境監(jiān)測(cè)和水華預(yù)警中不可缺少的環(huán)節(jié)。以山仔水庫(kù)藍(lán)藻發(fā)生期的水樣為材料，分離獲得2株形態(tài)不同的藍(lán)藻。在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以16SrRNA基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)分離獲得的2株水花藍(lán)藻進(jìn)行分子鑒定。鑒定結(jié)果表明：山仔水庫(kù)2015年4月至2016年5月期間，夏秋發(fā)生的水華優(yōu)勢(shì)種為銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa ），該種類(lèi)隸屬于藍(lán)藻門(mén)（Cyanophyta）、 藍(lán)藻綱（Cyanophyceae）、色球藻目（Chroococcales）、色球藻科（Microcystaceae），微囊藻屬（Microcystis）。山仔水庫(kù)春末發(fā)生的水華優(yōu)勢(shì)種為浮游魚(yú)腥藻（Anabaena planctonica ），該種類(lèi)隸屬于藍(lán)藻門(mén)（Cyanophyta）、藍(lán)藻綱（Cyanophyceae）、念珠藻目（Nostocales）、念珠藻科（Nostocaceae）、魚(yú)腥藻屬（Anabaena）。兩者均屬于普生性種類(lèi)，是最常見(jiàn)的水華藍(lán)藻。

在湖泊、水庫(kù)等淡水水體中，產(chǎn)生水華的主要優(yōu)勢(shì)種大多是藍(lán)藻門(mén)的微囊藻屬和魚(yú)腥藻屬的種類(lèi)。已有的研究報(bào)道中[2，10，11]，山仔水庫(kù)藍(lán)藻水華優(yōu)勢(shì)種主要是水華微囊藻（Microcystis flos-aquae）。水華微囊藻與銅綠微囊藻在群體外形上比較相似，尤其是幼齡期的群體更難加以區(qū)別。但水華微囊藻的成熟期群體不形成穿孔的網(wǎng)狀膠群體，群體內(nèi)的細(xì)胞排列比較密集，因此，本次調(diào)研中微囊藻樣品的形態(tài)學(xué)特征與此不符。此外，通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果也佐證了山仔水庫(kù)夏秋季節(jié)的主要水華優(yōu)勢(shì)種為銅綠微囊藻而非水華微囊藻。

本研究結(jié)果還顯示，山仔水庫(kù)不同種類(lèi)的藍(lán)藻水花具有明顯的季節(jié)更替現(xiàn)象。夏秋季節(jié)庫(kù)區(qū)的主要水華優(yōu)勢(shì)種為銅綠微囊藻，而春末庫(kù)區(qū)水花的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)為浮游魚(yú)腥藻。筆者認(rèn)為，對(duì)水花藍(lán)藻種類(lèi)的鑒定，僅僅依據(jù)一兩次的取樣和形態(tài)鑒定，顯然是有局限性的，因此，采集有效的水樣，以及采用多種現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)水花藍(lán)藻進(jìn)行種類(lèi)鑒定是很有必要的。本研究首次對(duì)山仔水庫(kù)不同季節(jié)的水花藍(lán)藻種類(lèi)進(jìn)行生物鑒定，研究結(jié)果可為山仔水庫(kù)藍(lán)藻水華的監(jiān)測(cè)與防治提供可靠的基礎(chǔ)性資料。

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Abstract： In this paper， the water samples of cyanobacteria bloom in Fuzhou Shanzai reservoir were used as materials. Two strains of blue-green algae in different morphologywere isolated from the water samples.On the basis of morphological identification， the 16SrRNA gene was further used as molecular marker to identify 2 blue-green algae.The results showed that the dominant species of bloom in summer and autumn wasMicrocystis aeruginosa. The dominant species of water bloom in late spring is Anabaena planctonica.For the first time， the species of cyanobacteria in different seasons were evaluated by bioassay. The results can provide basic data for monitoring and controlling cyanobacteria bloom.

Key words： Shanzai reservoir； cyanobacteria bloom； molecular identificationendprint