大葉茜草素抑制大鼠CFSC-2G細胞活化和膠原合成*

李俊峰， 舒建昌， 楊欽河， 馬 民， 張玉佩， 顏顯欣

(1暨南大學附屬第一醫院消化科， 廣東 廣州 510630； 2暨南大學附屬第四醫院消化科， 廣東 廣州 510175； 3暨南大學中醫學院， 廣東 廣州 510632)

大葉茜草素抑制大鼠CFSC-2G細胞活化和膠原合成*

李俊峰1△， 舒建昌2▲， 楊欽河3， 馬 民3， 張玉佩3， 顏顯欣3

(1暨南大學附屬第一醫院消化科， 廣東 廣州 510630；2暨南大學附屬第四醫院消化科， 廣東 廣州 510175；3暨南大學中醫學院， 廣東 廣州 510632)

目的觀察大葉茜草素(mollugin)對大鼠肝星狀細胞系CFSC-2G活化和膠原合成的影響并探討其分子機制。方法小劑量(10 μmol/L)過氧化氫(H2O2)誘導CFSC-2G細胞30 min后，再加入不同濃度(0、20、40、60和120 μmol/L)的mollugin處理。MTT法檢測細胞活力，real-time PCR和Western blot法分別檢測核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(HO-1)、核因子κB(NF-κB) p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax以及肝星狀細胞活化標志物α-平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的mRNA和蛋白表達，并用Western blot法檢測p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化水平。結果低劑量H2O2可以誘導CFSC-2G細胞活化，mollugin明顯促進p38 MAPK磷酸化，上調Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達，下調NF-κB p65、Bcl-2和Bcl-xL的mRNA和蛋白表達，抑制H2O2誘導活化的CFSC-2G細胞活力和膠原合成(P<0.05)。結論Mollugin 可能通過上調Nrf2和HO-1并下調NF-κB p65和Bcl-2表達，抑制CFSC-2G細胞活化和膠原合成。

大葉茜草素; CFSC-2G細胞; 細胞活力； 膠原合成

肝纖維化是慢性肝損傷-修復、細胞外基質過度沉積和疤痕形成的病理過程，最終導致肝硬化或肝癌形成，是全世界肝病死亡的主要原因[1]。氧化應激通過核因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)和B細胞白血病/淋巴瘤2(B-cell leukemia/lymphoma-2, Bcl-2)等信號途徑誘導靜止狀態肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)活化并轉分化為表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和分泌Ⅰ型膠原蛋白(collagen type I, ColⅠ)的肌成纖維細胞樣細胞(myofibroblast-like cells, MF)，是肝纖維化形成的重要機制之一[2]。核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1(nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1, Nrf2/HO-1)是細胞內抗氧化反應的主要調控子，上調Nrf2和HO-1表達可以抑制氧化應激和親電子物質、保護肝組織和細胞并抑制HSC活化和膠原的合成[3-4]。大葉茜草素(mollugin)是從中藥茜草中提取的萘醌類化合物，具有抗氧化和抗炎癥等藥理作用[5]，它是否可通過抗氧化應激抑制肝星狀細胞的活化及膠原合成未見報道，本研究旨在探討mullogin對肝星狀細胞活化的作用及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細胞系 大鼠肝星狀細胞系CFSC-2G購自中科院上海細胞生物研究所。

1.2試劑 大葉茜草素(廣州來普達克生物技術有限公司);MTT(Sigma);抗磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK)兔單克隆抗體(Cell Signaling Technology);抗Nrf2和HO-1兔多克隆抗體，抗NF-κB p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、α-SMA、ColⅠ和β-actin抗體(Santa Cruz);Trizol和Taq DNA polymerase (Invitrogen);SYBR PrimeScript PCR 試劑盒(TaKaRa)。

2 方法

2.1細胞系CFSC-2G的培養 將CFSC-2G細胞置于含10%FBS和1%青-鏈霉素的 DMEM/F12培養基中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中常規傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

2.2MTT法檢測mollugin對CFSC-2G細胞生長的影響 取對數生長期的CFSC-2G細胞, 以每孔1×104個細胞的濃度接種于96孔板，每組設4個復孔，孵育24 h后，棄上清液，加入10 μmol/L H2O2預處理30 min，后再加入濃度分別為0、20、40、60和120 μmol/L的mollugin處理細胞，設不加H2O2及mollugin組為空白對照組，DMSO+H2O2為陰性對照組，繼續培養24 h，每孔加入MTT (5 g/L) 20 μL，避光孵育4 h；棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，應用酶標儀檢測各孔在570 nm波長下的吸光度(A)值，計算細胞抑制率。

抑制率(%)=(A空白對照組-A實驗組)/A空白對照組。

2.3Real-time PCR檢測mRNA表達 根據GenBank編號查到相應蛋白質，根據編碼序列設計引物。Nrf2上游引物5′-TACTCCCAGGTTGCCCACA-3′，下游引物5′-CATCTACAAACGGGAATGTCTGC-3′；HO-1上游引物5′-AGATTGCCCAGAAAGCCCTGGAC-3′，下游引物 5′-AACTGTCGCCACCAGAAAGCTGAG-3′；Bcl-2上游引物5′-CATTTCCACGTCAACAGAATTG-3′，下游引物5′-AGCACAGGATTGGATATTCCAT-3′；Bcl-xL 上游引物5′-GAACGGCGGCTGGGATACTTTT-3′，下游引物5′-GAGAAGGGGGTGGGAGGGTAGA-3′；Bax上游引物5′-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3′，下游引物5′-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3′；α-SMA上游引物5′-TGAAGAGCATCCCACCCT-3′，下游引物5′-ACGAAGGAATAGCCACGC-3′；Collagen I上游引物5′-CAGCCGCTTCACCTACAGC-3′， 下游引物5′-TTTTGTATTCAATCACTGTCTTGCC-3′；β-actin上游引物5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，下游引物5′-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。按照Trizol試劑盒說明提取細胞總RNA，采用Oligo(dT)引物和隨機引物進行逆轉錄，以cDNA為模板進行熒光定量PCR。反應條件為：預變性 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s， 共40個循環，用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。

2.4Western blot檢測蛋白表達 收集裂解細胞BCA法定量蛋白，蛋白經SDS-PAGE分離后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后，加入稀釋的Ⅰ抗(p38 MAPK單克隆抗體1∶500；Nrf2和HO-1多克隆抗體1∶800；Bcl-2、Bcl-xL和Bax單克隆抗體1∶1 000；β-actin抗體1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀釋HRP標記的Ⅱ抗，室溫下孵育2 h。加ECL顯色劑經凝膠成像分析系統檢測，ImageJ軟件進行灰度分析，以目標蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標蛋白的相對量，進行定量分析。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Mollugin抑制H2O2活化的CFSC-2G細胞活性

小劑量H2O2增加了CFSC-2G細胞活力。mollugin抑制了H2O2預處理的CFSC-2G活力，差異具有統計學意義(P<0.05)，其中120 μmol/L的mollugin抑制作用最明顯，因此選擇120 μmol/L 作為后續實驗的基礎濃度，見圖1。

Figure 1. The effects of mollugin at different concentrations on the viability of CFSC-2G cells treated with H2O2. Mean±SD．n=4．▲P<0.05vsblank control group;*P<0.05vsH2O2group.

圖1Mollugin抑制經H2O2活化的CFSC-2G細胞活性

2 Real-time PCR結果

H2O2預處理組與空白對照組比較，肝星狀細胞活化標志物α-SMA和ColⅠ、抗氧化調控因子Nrf2和HO-1以及促細胞增殖蛋白Bcl-2、Bcl-xL和Bax的mRNA表達明顯增加，表明H2O2誘導CFSC-2G細胞活化和增殖。 Mollugin上調Nrf2和HO-1 mRNA表達，抑制Bcl-2、Bcl-xL、Bax、α-SMA和ColⅠ mRNA的表達，表明mollugin 明顯抑制H2O2預處理的CFSC-2G細胞活化和膠原合成，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖 2。

3 Western blot實驗結果

H2O2上調Nrf2、HO-1、NF-κB p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、α-SMA和ColⅠ蛋白表達。Mollugin促進CFSC-2G細胞p38 MAPK磷酸化和Nrf2、HO-1蛋白的表達，抑制NF-κB p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、α-SMA和ColⅠ蛋白的表達，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3～5。

Figure 2. Mollugin promoted the mRNA expression of Nrf2 and HO-1, and inhibited Bcl-2, Bcl-xL， α-SMA and ColⅠmRNA expression in H2O2-treated CFSC-2G cells. Mean±SD．n=4．*P<0.05vsblank control group;▲P<0.05vsH2O2group.

圖2Mollugin對Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、α-SMA和ColⅠmRNA表達的影響

Figure 3. Mollugin promoted p-p38 MAPK， Nrf2 and HO-1 protein expression in H2O2-treated CFSC-2G cells. Mean±SD．n=4.*P<0.05vsblank control group；▲P<0.05vsH2O2group.

圖3CFSC-2G細胞p-p38MAPK、Nrf2和HO-1的蛋白表達情況

討 論

Figure 4. Mollugin inhibited NF-κB p65, Bcl-2 and Bcl-xL protein expression in H2O2-treated CFSC-2G cells. Mean±SD．n=4.*P<0.05vsblank control group;▲P<0.05vsH2O2group.

圖4大葉茜草素抑制NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達

Figure 5. Mollugin inhibited α-SMA and ColⅠprotein expression in H2O2-treated CFSC-2G cells. Mean±SD．n=4.*P<0.05vsblank control group;▲P<0.05vsH2O2group.

圖5Mollugin抑制CFSC-2G細胞α-SMA和ColⅠ蛋白表達

Nrf2/HO-1是細胞內抗氧化反應的主要調控子，氧化應激誘導p38 MAPK磷酸化，導致細胞質內Nrf2抑制劑Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)降解，促使Nrf2移位至細胞核內并結合抗氧化反應元件(anti-oxidant response element，ARE),從而介導HO-1表達[9]。NF-κB是一種重要的氧化還原敏感核轉錄因子，與肝星狀細胞活化和肝纖維化形成密切相關。H2O2可磷酸化NF-κB抑制蛋白(nuclear factor-κB inhibitor protein, IκB)，促使NF-κB p65從NF-κB/IκBα復合體解離出來，移位至細胞核內，上調 Bcl-2和Bcl-xL等表達，促進HSC增殖，抑制其凋亡[7，10]。 HO-1抑制NF-κB p65表達，抑制肝纖維化形成[11]。

大葉茜草素通過激活p38 MAPK磷酸化，上調Nrf2/HO-1，下調NF-κB p65、Bcl-2和Bcl-xL表達，保護神經細胞、結腸上皮細胞免受炎性損傷、抑制腫瘤細胞增殖及誘導腫瘤細胞凋亡[12-14]。高濃度的ROS誘導HSC死亡，而低劑量的ROS誘導HSC活化、增殖和膠原的形成[15]。H2O2具有較長的半衰期，良好的膜通透性和細胞內濃度高，常被作為第二信使物質模擬細胞內氧化應激系統誘導HSC活化[16]。本實驗采用小劑量(10 μmol/L)H2O2預處理具有原代細胞特性的大鼠肝星狀細胞CFSC-2G，構建氧化應激誘導肝星狀細胞活化模型，觀察大葉茜草素對活化的CFSC-2G細胞生長、抗氧化調控因子Nrf2和HO-1及促細胞炎癥和增殖蛋白NF-κB p65、Bcl-2、Bcl-xL和Bax表達的影響，結果顯示小劑量H2O2可以誘導CFSC-2G細胞活化和增殖；大葉茜草素促進p38 MAPK磷酸化，上調抗氧化調控因子Nrf2/HO-1，下調促細胞炎癥和增殖蛋白NF-κB p65、Bcl-2和Bcl-xL及肝星狀細胞活化標志物α-SMA和ColⅠ mRNA和蛋白的表達，抑制了H2O2預處理的CFSC-2G細胞活化和膠原的合成。

綜上所述，大葉茜草素可能通過上調Nrf2/HO-1和下調NF-κB p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、α-SMA和ColⅠ，促進p38 MAPK磷酸化表達，抑制肝星狀細胞的活化和膠原合成，為預防和治療肝纖維化提供新的靶點和藥物。

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Mollugin inhibits viability and collagen synthesis of rat CFSC-2G cells

LI Jun-feng1, SHU Jian-chang2, YANG Qin-he3, MA Min3, ZHANG Yu-pei3, YAN Xian-xin3

(1DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFourthAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510175,China;3CollegeofTraditionalChineseMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:ljfmed@163.com)

AIM: To investigate the effects of mollugin on the viability and collagen synthesis of rat hepatic stellate cell line CFSC-2G.METHODSThe activation of CFSC-2G cells was induced with low concentration (10 μmol/L) of hydrogen peroxide (H2O2) for 30 min in the experiment. The viability of the CFSC-2G cells after exposed to mollugin at different concentrations (0, 20, 40, 60 and 120 μmol/L) was detected by MTT assay. The mRNA and protein expression levels of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2), heme oxygenase-1 (HO-1), nuclear factor-κB (NF-κB) p65, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, and hepatic stellate cell activation markers α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen type I (Col Ⅰ) were detected by real-time PCR and Western blot. The phosphorylation level of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) was determined by Western blot.RESULTSMollugin significantly inhibited the viability and collagen synthesis of activated CSFC-2G cells induced by H2O2. The expression of Nrf2, HO-1 and Bax at mRNA and protein levels, and the phosphorylation level of p38 MAPK were promoted, while the levels of NF-κB p65, Bcl-2, Bcl-xL, α-SMA and ColⅠwere inhibited by mollugin (P<0.05).CONCLUSIONMollugin may inhibit H2O2-induced viability and collagen synthesis of the CSFC-2G cells by activating Nrf2 and HO-1, and blocking the NF-κB p65 and Bcl-2 expression.

Mollugin; CFSC-2G cells; Cell viability; Collagen systhesis

1000- 4718(2017)12- 2259- 05

2017- 05- 02

2017- 08- 08

廣東省中醫藥局資助項目(No.20141069)

▲共同第一作者

△通訊作者 Tel: 020-38688918; E-mail: ljfmed@163.com

R285.5； R575

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.023

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)