M1/M2型巨噬細胞極化參與腎組織炎癥損傷和修復進程*

吳蓮鳳， 陸 紅， 洪煒龍， 張 行， 劉樂平， 白永恒△

(溫州醫科大學附屬第一醫院 1醫學檢驗中心， 2肝膽胰外科實驗室， 浙江 溫州 325000)

M1/M2型巨噬細胞極化參與腎組織炎癥損傷和修復進程*

吳蓮鳳1， 陸 紅1， 洪煒龍2， 張 行2， 劉樂平2， 白永恒2△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1醫學檢驗中心，2肝膽胰外科實驗室， 浙江 溫州 325000)

目的研究M1/M2型巨噬細胞在腎組織炎癥損傷和修復進程中的分布趨勢及作用。方法將45只雄性SD大鼠隨機分為缺血再灌注損傷(IRI)組和單側輸尿管梗阻(UUO)組兩部分。IRI組分為假手術(sham)組及術后0、6、24和72 h組；UUO組分為sham組及梗阻3、7和14 d組；每個時相5只大鼠。全自動生化分析儀檢測血肌酐和尿素氮水平；HE與免疫組織化學染色分別觀察腎組織損傷及CD68的表達；流式細胞術檢測M1(CD68+、F4/80+和CD16/32+)和M2(CD68+、F4/80+和CD206+)型巨噬細胞的分布；ELISA檢測誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg-1)、轉化生長因子β1(TGF-β1)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結果IRI早期，腎組織損傷程度隨再灌時間延長而加劇，并與CD68+巨噬細胞浸潤呈一致性變化趨勢；至24 h，組織損傷與巨噬細胞浸潤最為嚴重；但之后隨時間延長，損傷和巨噬細胞浸潤反而減輕。UUO組中，腎損傷隨梗阻時間延長而加劇，14 d時纖維化明顯；而巨噬細胞浸潤第7天最為嚴重，之后又有減輕。流式細胞術分析顯示IRI和UUO損傷早期浸潤的巨噬細胞以M1型為主，iNOS表達較高；IRI和UUO損傷后期巨噬細胞均向M2型極化，Arg-1水平明顯增加；巨噬細胞這種變化趨勢與腎組織在不同時間節點出現損傷與修復表征存在明顯相關性。深入分析發現，M1型巨噬細胞可通過誘導TNF-α高表達促進早期炎癥損傷，M2型巨噬細胞通過提高TGF-β1水平促進后期纖維增生性修復。結論UUO和IRI過程中均存在巨噬細胞極化：M1型巨噬細胞可誘導早期損傷，M2型巨噬細胞則參與損傷后期的纖維性修復。M1和M2型巨噬細胞在損傷修復過程中的極化特征可為臨床治療提供指導。

輸尿管梗阻； 缺血再灌注損傷； M1型巨噬細胞； M2型巨噬細胞； 極化

巨噬細胞浸潤腎小球和小管間質是絕大多數腎損傷的主要病理特征[1]。巨噬細胞作為一類可塑性和異質性很強的細胞群體，在體內復雜的微環境中，可被極化成M1和M2兩種不同的表型，并具備不一樣的生理學功能[2]。目前，巨噬細胞這兩種活化表型在腎組織損傷和修復過程中的角色仍不十分清楚。研究發現：M1型巨噬細胞與腎損傷的誘導明顯相關，清除M1型巨噬細胞可降低腎損傷程度[3]；相反，M2型巨噬細胞可減少炎癥反應，促進組織修復[4]，可能為抗腎損傷的一種潛在治療工具。因此，研究不同活化表型巨噬細胞在腎損傷及修復過程中的變化趨勢及作用，對闡明疾病的分子機制及相關治療起到關鍵性作用。本研究以臨床上常見的缺血再灌注損傷 (ischemia-reperfusion injury，IRI)和單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)2種腎損傷類型作為研究對象，通過比較不同活化表型的巨噬細胞在疾病不同時期的極化差異，明確巨噬細胞極化在腎損傷及修復過程中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物、試劑和儀器

45只雄性SD大鼠購置于溫州醫科大學動物實驗中心，合格證編號為SCXK(溫)2013-0023，體重約220～240 g，飼養條件為(22±2) ℃室溫、12 h/12 h光暗環境、標準飼料進食及自由飲水，隨機分為IRI組和UUO組。所有實驗動物喂養程序嚴格按照溫州醫科大學制定的實驗動物保護條例執行。

蘇木精-伊紅染色試劑(HE試劑，上海碧云天生物公司)；抗CD68單克隆抗體(Santa Cruz)；誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶1(arginase-1， Arg-1)、轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α) ELISA檢測試劑盒(上海西唐生物公司)；流式抗體CD68、F4/80、CD16/32及CD206(BioLegend)。

FACSVerse流式細胞儀(BD)；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀(ThermoScientific)；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡(Leica)；AU5800自動化生化分析儀(Beckman Coulter)。

2 方法

2.1IRI模型的制備 將禁食1 d的IRI組大鼠，用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉。麻醉成功后常規消毒，于腹正中切口，分離右腎動脈，將腎門處腎動脈利用無創動脈夾夾閉，不夾閉其側靜脈和輸尿管，腎臟由鮮紅色逐漸變為暗紅色，即表示缺血成功。后將腸管等恢復至腹腔內，用血管鉗夾閉腹腔。45 min后再次打開腹腔，去除動脈夾，恢復血流，此時可見腎動脈開始充盈，并且由暗紅色逐漸變成鮮紅色，顯示再灌注成功，縫合腹壁。分別于術后0、6、24和72 h取腎組織，每個時相組5只大鼠，同時分離外周血清用于檢測肌酐和尿素氮水平。假手術組大鼠打開腹腔，僅作分離右腎動脈，但不進行右腎動靜脈及輸尿管的夾閉。

2.2UUO模型的制備 UUO組大鼠術前準備同IRI組，10%水合氯醛成功麻醉后，常規消毒，腹正中線開口，分離腎臟及輸尿管，將左側輸尿管靠近腎盂并與腎盂固定距離處進行結扎，術中注意無菌操作，然后將腹內臟器復位后，腹壁縫合。分別于術后3、7和14 d取腎組織，每個時相組5只大鼠，同時分離外周血清用于檢測肌酐和尿素氮水平；假手術組僅進行分離腎臟及輸尿管，隨即縫合腹壁。

2.3HE染色 分別將2組模型大鼠腎臟按不同時相取出后，放入4%多聚甲醛中固定，然后進行組織脫水、透明、浸蠟和包埋及切成組織切片，經脫蠟、梯度乙醇脫水和HE染色，最后中性樹膠封片。通過顯微鏡觀察腎臟病理改變。

2.4免疫組織化學染色檢測CD68的表達 各組腎組織采用4%多聚甲醛固定后制成石蠟切片，連續進行厚4 μm切片。CD68 I抗按1∶500稀釋。脫蠟至水，檸檬酸鹽高溫修復，以 II 抗相同來源的血清封閉。以I抗稀釋液代替I抗作為陰性對照，細胞內或胞膜出現黃褐色為陽性表達。最后檢測各組石蠟切片的平均吸光度(A)值(Image-Pro Plus 6.0軟件分析)。

2.5ELISA檢測iNOS、Arg-1、TGF-β1和TNF-α的含量 取200 mg腎組織，用2 mL的PBS進行充分勻漿溶解，離心分離出上清液，制成100 g/L蛋白原液，根據試劑盒說明書，采用ELISA法，檢測樣品吸光度(A)值，根據標準曲線，計算出樣本濃度。

2.6流式細胞術檢測巨噬細胞極化 取大鼠腎組織于生理鹽水中，無菌剪碎，用2.5 mL注射器將腎組織反復擠壓成勻漿，最后通過400目的鋼絲網，獲得單個細胞，調整細胞懸液為1×109/L，取標本100 μL分別加入5 μL抗CD68、F4/80、CD16/32及CD206抗體，室溫下孵育25 min，通過流式細胞儀進行測試。

3 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件包進行統計學分析，計量資料結果以均數±標準差(mean±SD)表示，方差分析中各組均數間的兩兩比較應用LSD-t檢驗；兩樣本關聯性比較采用相關性分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 IRI和UUO模型大鼠血肌酐和尿素氮水平的變化

與sham組相比，雖然IRI與UUO模型大鼠血肌酐和尿素氮水平在損傷后期有輕度增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)，見圖1。我們推測這與各模型組大鼠另一側腎發揮代償性作用有關。

Figure 1. The levels of serum creatinine and blood urea nitrogen in the kidneys of IRI and UUO rats. Mean±SD.n=5.

圖1IRI和UUO模型大鼠血肌酐與尿素氮水平

2 IRI模型大鼠腎組織炎癥細胞浸潤程度及CD68在其中的動態表達

HE染色結果示，IRI模型中sham組腎小管及間質區結構正常，未見炎癥細胞浸潤、充血及水腫；在IRI 0 h時，腎小管上皮細胞開始腫脹，少數出現壞死；隨時間延長，腎小管上皮細胞腫脹加劇，并出現凝固性壞死，呈空泡樣和顆粒樣變性，間質明顯充血、水腫及炎癥細胞浸潤；在IRI 24 h時損傷程度最嚴重；而在IRI 72 h，腎小管損傷明顯減輕，間質炎癥細胞浸潤減少，提示組織進入修復階段，見圖2A。免疫組織化學染色結果示，與sham組相比，各時相IRI組織中CD68+巨噬細胞數量均升高；在IRI 24 h時，浸潤的巨噬細胞達到最高值，之后下降；至IRI 72 h時，CD68+巨噬細胞數量較IRI 24 h明顯減少(P<0.05)，見圖2B、C。

3 UUO模型大鼠腎組織炎癥細胞浸潤程度及CD68在其中的動態表達

HE染色結果示，與sham組相比，UUO組術后隨時間延長，腎小管擴張程度加劇，腎間質面積明顯擴大，在UUO 14 d時，腎皮質已基本被間質占據，提示梗阻后期出現纖維化表征；炎癥細胞在梗阻最初階段即有浸潤，而后逐漸增加，UUO 7 d時炎癥細胞浸潤最為明顯，但到14 d時，間質炎癥細胞相對減少，這可能與間質區域纖維基質過度增生累積有關，見圖3A。免疫組織化學染色結果可見，隨著梗阻時間延長，腎組織中CD68+的巨噬細胞數量明顯升高；在UUO 7 d時，浸潤的巨噬細胞達最高值，之后下降；在UUO 14 d時，CD68陽性的巨噬細胞數量較UUO 7 d明顯減少(P<0.05)，見圖3B、C。

4 M1和M2型巨噬細胞在IRI模型大鼠腎組織中的分布

IRI模型中，sham組巨噬細胞基本為M2型；IRI組0 h時，M1型相對含量開始升高；到IRI 6 h時，M1型分布達最高值，而M2型相對含量則最低；之后，隨著缺血再灌時間延長，M1型相對含量又開始下調，M2型隨之升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. Tissue injury evaluated by HE staining (A,×200) and infiltration of CD68-positive macrophages determined by immunohistochemical staining (B and C,×400) in the kidneys of IRI rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsshan group.

圖2HE染色及免疫組織化學染色檢測IRI模型大鼠腎損傷程度及CD68陽性巨噬細胞的浸潤

Figure 3. Tissue injury evaluated by HE staining (A，×200) and infiltration of CD68-positive macrophages determined by immunohistochemical staining (B and C，×400) in the kidneys of UUO rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group.

圖3HE染色及免疫組織化學染色檢測UUO模型大鼠腎損傷程度及CD68+巨噬細胞的浸潤

5 M1和M2型巨噬細胞在UUO模型大鼠腎組織中的分布

UUO模型中，sham組巨噬細胞基本為M2型；UUO組中，伴隨梗阻時間的延長，M1型巨噬細胞相對含量明顯增加，而M2型不斷下調；到7 d時，M1型達高值，而M2型為低值；之后一直到梗阻14 d時，M1型巨噬細胞開始下降，而M2型又開始升高(P<0.05)，見圖5。

6 巨噬細胞極化標志物iNOS與Arg-1在IRI和UUO模型大鼠腎組織中含量的變化

在IRI組中，iNOS各時相的含量均較sham組高，并且高峰出現在IRI 24 h(P<0.05)；Arg-1各時相的活性表達與Sham組比較，先逐漸減低，至IRI 6 h最低，之后24 h又明顯增高(P<0.05)。在UUO組中，iNOS活性表達的峰值出現在UUO 3 d，之后出現遞減趨勢(P<0.05)；Arg-1各時相的活性表達與Sham組比較，先逐漸減低，至UUO 7 d最低，之后14 d又出現增高(P<0.05)，見圖6。

Figure 4. Distribution of M1 and M2 macrophages in the kidneys of IRI rats determined by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group.

圖4流式細胞分析檢測M1和M2型巨噬細胞在IRI模型大鼠腎組織中的分布

Figure 5. The distribution of M1 and M2 macrophages in the kidneys of UUO rats determined by flow cytometry analysis. Mean±SD.n=5.*P<0.05vssham group.

圖5流式細胞術分析檢測M1和M2巨噬細胞在UUO模型大鼠腎組織中的分布

7 炎癥因子TNF-α及促纖維化因子TGF-β1在IRI和UUO模型腎組織中的表達

在IRI和UUO組中，炎癥因子TNF-α在損傷后隨即升高(P<0.05)，與損傷的時間無明顯的相關性；而促纖維化因子TGF-β1的含量雖然在損傷后表達開始升高，尤其在UUO中、后期時增加更為明顯(P<0.05)，見圖7。這提示炎癥損傷在損傷過程中均發生，而纖維化表現在損傷后期才發生。

討 論

巨噬細胞是腎損傷發生過程中重要的炎癥細胞[1]。早期在動物模型上進行經典的巨噬細胞損耗和補充實驗，結果證實了巨噬細胞與腎損傷有著重要關系[5]；隨后的研究也證實了巨噬細胞不但可誘導腎損傷，而且也可能參與腎病的修復及緩解[6]。巨噬細胞在腎損傷中的這種生物學效應差異與其表型異質性有關。在不同的微環境下，巨噬細胞能極化為誘導炎癥損傷(M1型/經典活化型)或促進修復(M2型/替代活化型)兩種截然不同的功能狀態[2]。這兩種巨噬細胞不同活化表型可能參與了腎組織的炎癥損傷和修復進程[7]。

Figure 6. The levels of iNOS and Arg-1 in the kidneys of IRI and UUO rats measured by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group.

圖6ELISA檢測IRI和UUO大鼠腎組織中iNOS及Arg-1的含量

Figure 7. The levels of TNF-α and TGF-β1 in the kidneys of IRI and UUO rats determined by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSham group.

圖7ELISA檢測IRI和UUO大鼠腎組織中TNF-α和TGF-β1含量的變化

本研究構建了IRI及UUO臨床上常見的兩種腎損傷模型(IRI模型為模擬損傷及修復過程，UUO模型為持續損傷過程)，從而觀察在腎損傷不同病理階段，不同極化亞型巨噬細胞參與極化的情況。雖然我們并未發現肌酐和尿素氮在損傷后水平明顯增加，但通過組織病理染色發現，IRI及UUO模型大鼠腎損傷程度隨時間延長均呈現不同程度的損傷。在損傷早期，CD68陽性的巨噬細胞浸潤數量隨之損傷程度增加而增加；在IRI 24 h，浸潤的巨噬細胞數量最多，此時腎損傷最為嚴重，之后腎損傷逐漸修復，CD68陽性巨噬細胞數量也隨之減低；在UUO早期巨噬細胞浸潤數量與腎損傷程度呈現一致的變化趨勢，其在7 d時，浸潤的巨噬細胞數量最多，損傷最嚴重，之后巨噬細胞數量減少，但腎間質出現明顯的纖維化表征。這些結果證實了IRI及UUO兩種腎損傷過程中都存在巨噬細胞的參與，這與之前的報道一致。炎癥損傷及修復機制可能與巨噬細胞向不同的M1和M2表型極化相關。

在損傷早期，浸潤的巨噬細胞主要以M1表型為主。M1型巨噬細胞可誘導活性氧的產生，促進一氧化氮的合成，并釋放各種炎癥因子如TNF-α、IL- 1及合成活化金屬酶等，造成腎小球固有細胞和基底膜損傷，進而引起蛋白尿和腎小球炎癥[8]。我們實驗也證實了兩種模型動物中TNF-α的表達水平出現不同程度的增加，提示TNF-α可能參與了M1型巨噬細胞介導的炎癥損傷過程。在損傷的后期，M1型巨噬細胞逐漸下降，相反地，M2型巨噬細胞明顯增加。IRI后期，腎組織表現為損傷修復，而UUO后期則表現為間質纖維化。M2型巨噬細胞既可釋放抗炎因子抑制腎組織局部的炎癥損傷，同時也可以分泌TGF-β，抑制炎癥，促進基質累積，導致間質的纖維化[9]。我們實驗也發現IRI和UUO模型中TGF-β1表達水平明顯增加，尤其在UUO后期，這一變化趨勢與M2型巨噬細胞一致，提示TGF-β1可能參與了M2介導的組織修復及纖維化進程。事實上，損傷適度且可控時，少量的基質累積產生可能是有益的，可促進組織修復；但在損傷為持續性且不可控狀態下，大量的基質累積反而引起了間質的纖維化。一方面，間質纖維化引起了本研究觀察到的現象——浸潤的巨噬細胞在腎組織單位面積上的減少，同時另一方面，我們推測腎損傷后出現纖維增生性修復這種差異性功能表現形式與M2型巨噬細胞有關[10]。考慮到M2型巨噬細胞又可細分為M2a、M2b和M2c，這些亞型可能決定了巨噬細胞在不同微環境中的功能狀態[7]，故在未來的研究中，需要深入分析這些亞型的表型特征及功能，以進一步明確其在腎損傷修復中的作用。

總而言之，在腎損傷及修復過程中，巨噬細胞極化起著關鍵的作用。M1型可誘導早期炎癥損傷，M2型則參與損傷后期的纖維性修復。M1和M2型巨噬細胞在損傷修復過程中的極化特征不僅可為分子機制的闡明提供理論依據，同時也為臨床治療提供一定的指導意義。

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M1/M2 macrophage polarization is involved in inflammatory injury and repair process of renal tissues

WU Lian-feng1, LU Hong1, HONG Wei-long2, ZHANG Xing2, LIU Le-ping2, BAI Yong-heng2

(1DepartmentofLaboratoryMedicine，2LaboratoryofHepato-Pancreato-BiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:baiyongheng@hotmail.com)

AIM: To investigate the distribution and mechanism of M1/M2 macrophages in inflammatory injury and repair process of renal tissues.METHODSSD male rats (n=45) were randomly divided into 2 parts: ischemia-reperfusion injury (IRI) and unilateral ureteral obstruction (UUO) renal injury. The rats with IRI were divided into sham operation group and operation groups (0, 6, 24, and 72 h after operation), and the rats with UUO were divided into sham operation group and operation groups (3, 7 and 14 d after operation). Automatic biochemical analyzer was used to detect serum levels of creatinine and urea nitrogen. The degree of renal injury in IRI group and UUO group were detected by HE staining. The expression of CD68 was examined by immunohistochemical staining. The levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS)， arginase-1 (Arg-1), transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA. The polarizations of M1 (CD68+, F4/80+and CD16/32+) and M2 (CD68+, F4/80+and CD206+) macrophages were analyzed by flow cytometry.RESULTSIn IRI group, the infiltration of CD68+macrophages and the degree of injury were increased with the prolongation of time in the renal tissues. At 24 h, the tissue injury and macrophage infiltration were the most serious, but then decreased. At 72 h, the tissue damage and CD68+macrophage infiltration were significantly reduced. In UUO group, obstructive injury was increased with the prolongation of time, and at 14 d， marked fibrous hyperplasia occurred. The infiltration of CD68+macrophages at 7 d was the most serious, but then reduced at 14 d. Flow cytometry analysis showed that M1 macrophages were the majority in the early stages of UUO and IRI, and the result of ELISA identified the higher level of iNOS. At the late stage of injury, the M1 macrophages were decreased, while the M2 macrophages were increased with higher level of Arg-1. M1 macrophage-mediated early injury was due to the induction of TNF-α expression， and M2 macrophage-mediated later recovery was due to enhancing TGF-β1 levels.CONCLUSIONThe polarization of M1 and M2 macrophages is involved in the processes of UUO and IRI. M1 macrophages play a key role in early injury, and M2 macrophages contribute to the late stage of fibrotic repair. The polarization of macrophages during renal injury and repair provides a guiding significance for the clinical treatment.

Ureteral obstruction; Ischemia-reperfusion injury; M1 macrophages; M2 macrophages; Polarization

1000- 4718(2017)12- 2245- 07

2017- 06- 27

2017- 10- 01

國家自然科學基金資助項目(No. 81772264)；浙江省自然科學基金資助項目(No. LY17H050005； No. LQ16H310005)；溫州市科技計劃項目(No. Y20140402)

△通訊作者 Tel： 0577-55579309； E-mail： baiyongheng@hotmail.com

R691.6； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.021

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)