miR-221通過下調PTEN促進肺癌A549細胞增殖

鄭禮平， 張 楠， 梁翠微， 杜均祥， 龔五星

(珠海市人民醫院， 暨南大學附屬珠海醫院腫瘤科， 廣東 珠海 519000)

miR-221通過下調PTEN促進肺癌A549細胞增殖

鄭禮平△， 張 楠， 梁翠微， 杜均祥， 龔五星

(珠海市人民醫院， 暨南大學附屬珠海醫院腫瘤科， 廣東 珠海 519000)

目的探討微小RNA-221(miR-221)對肺癌A549細胞增殖的影響及其相關作用機制。方法通過脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000 把miR-221 mimics轉染入肺癌細胞A549 內，RT-qPCR檢測miR-221和PTEN mRNA的表達；Western blot檢測PTEN蛋白表達；CCK-8及平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。構建含PTEN3’-UTR的螢光素酶報告載體，檢驗miR-221對PTEN的靶向調控作用。結果轉染miR-221后肺癌細胞中miR-221表達水平明顯高于對照組及空白組(P<0.01)，PTEN mRNA及蛋白表達均顯著下降(P<0.05)；細胞增殖及集落形成能力明顯增強(P<0.05);miR-221能抑制PTEN的螢光素酶活性。結論miR-221能夠抑制肺癌A549細胞中PTEN的表達，并促進細胞增殖。

肺癌； A549細胞； 微小RNA-221； PTEN蛋白； 細胞增殖

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年升高趨勢，對人類健康造成重大影響。2015年我國肺癌新發病例達73.3萬，死亡病例為61萬，發病率和死亡率均排在我國惡性腫瘤的首位[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一組進化保守的內源性單鏈非編碼小分子RNA，是人體內普遍表達的小型基因調控因子[2-3]。miRNA能與靶基因mRNA的互補序列結合，調控體內多種蛋白的表達，對細胞的增殖、分化及凋亡等產生重要影響[4]。miR-221基因定位在X染色體p11.3區的1 kb區域內，屬于成簇分布的miRNA基因。研究發現miR-221在乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌等多種腫瘤均有高表達[5-7]，提示miR-221可能在腫瘤的發生發展中起重要作用。我們前期運用RT-qPCR技術檢測了10例肺癌組織及癌旁正常組織中miR-221的表達，結果顯示癌組織中miR-221是癌旁正常組織中的4.23倍。本課題通過研究miR-221過表達對肺癌A549細胞增殖的影響及作用機制，為肺癌的治療提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

肺癌細胞株A549購自中國科學院上海細胞所;RPMI-1640培養基及胎牛血清購自Gibco;PTEN抗體購自Abcam；miR-221 mimics和miR-NC購自上海吉瑪制藥；CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所；雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega;RNA提取試劑Trizol和脂質體LipofectamineTM2000購自Invitrogen。

2 細胞培養和轉染

肺癌A549細胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養，37℃、5% CO2、相對濕度95%的恒溫培養箱中。在細胞生長接近于90%融合時，用胰酶將細胞消化，并吹打成單細胞懸液后收集離心，然后用RPMI-1640培養基稀釋，制成5×108/L的懸液。將細胞轉種于6孔培養板中,于37℃、5% CO2培養箱中培養24h，在細胞融合為80%～90%時進行轉染。在轉染前2h更換成無血清的新鮮培養基。實驗分組：實驗組，轉染miR-221 mimics；對照(control)組，轉染miR-NC；空白(blank)組，單用無血清培養基培養。按LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書進行相應轉染，在轉染24～48 h后收集細胞進行相應檢測。

3 主要方法

3.1RT-qPCR檢測磷酸酶和張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog protein,PTEN)mRNA及miR-221的表達 在轉染24 h后，通過Trizol法進行各組細胞總RNA的提取，后通過紫外分光光度計來檢測RNA的濃度以及純度，控制RNA的純度在1.8～2.0左右。按照RT-qPCR試劑盒給出的操作說明書進行cDNA的合成。擴增反應條件設置為：95℃預變性30 s;95℃變性5 s，55℃ 延伸20 s，72℃退火20 s，40個循環，以U6作為內參照。運用2-ΔΔCt法進行運算分析。

3.2Western blot檢測PTEN蛋白的表達 在瞬時轉染48 h后，按照說明書進行總蛋白的提取，BCA法進行蛋白濃度測定。取各樣品50 μg，進行SDS-PAGE分離，其后將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶于搖床上室溫封閉1 h；加入PTEN抗體和GAPDH抗體，在4℃孵育過夜。于次日用TBST在室溫漂洗3次；同樣方法稀釋Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST進行3次漂洗，最后用ECL化學發光法試劑盒進行顯影及曝光。

3.3CCK-8法檢測細胞增殖 將上述3組對數期的A549細胞接種在96孔板內，每孔1 000個細胞。培養24 h，待細胞貼壁后進行轉染。分別在轉染10、20、30、40、50、60 h后，置換成不含血清的新鮮培養基。后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃孵育2 h后終止培養。酶標儀測定450 nm的吸光度(A)，每組平行重復5孔，重復實驗3次。

3.4平板克隆形成實驗 按LipofectamineTM2000說明書進行轉染，24 h后用胰酶把細胞吹散為單細胞懸液，1 000/孔接種于平皿，置于恒溫培養箱中培養7 d后用多聚甲醛進行固定，1%結晶紫染色，流水緩慢清洗后于自然環境干燥。顯微鏡下計算克隆形成數(含有50個細胞以上的集落為1個克隆):克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

3.5雙螢光素酶報告基因檢測 合成含有能夠和相應miR-221互補結合的靶基因PTEN3’-UTR序列片段及突變的3’-UTR序列片段。將這2個片段分別克隆至pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點上。將A549細胞以4×108/L接種在6孔板中。將螢光素酶報告載體與miR-221 mimics及對照序列miR-NC進行共轉染，按LipofectamineTM2000說明書進行。在轉染48 h后將細胞收集處理，根據Promega公司雙螢光素酶報告基因進行檢測。

4 統計學處理

用SPSS 19.0軟件進行統計分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-221 mimics轉染后A549細胞中miR-221表達升高

RT-qPCR結果顯示，轉染miR-221 mimics能夠顯著提高A549細胞中miR-221的表達。實驗組miR-221表達量較空白組明顯升高(P<0.01)；對照組和空白組間miR-221含量無明顯差異，見圖1。

Figure 1. The miR-221 expression in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖1肺癌A549細胞中miR-221的表達

2 miR-221抑制PTEN的表達

RT-qPCR結果顯示，實驗組PTEN的mRNA表達水平較空白組明顯下降，比值是0.33±0.08(P<0.05)；對照組和空白組間mRNA含量無明顯差異，見圖2。取PTEN/GAPDH的灰度值比值作為蛋白的相對表達水平，空白組灰度值為1，實驗組及對照組分別為0.31±0.09和0.95±0.11。Western blot顯示實驗組PTEN蛋白水平較對照組和空白組明顯降低(P<0.05),見圖3。

Figure 2. The mRNA expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖2肺癌A549細胞PTEN的mRNA表達

Figure 3. The protein expression of PTEN in lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3肺癌A549細胞PTEN蛋白的表達

3 miR-221促進A549細胞增殖

CCK-8實驗顯示,轉染miR-221 mimics的實驗組細胞在30～60 h，吸光度明顯高于對照組及空白組(P<0.05)；而對照組及空白組間無明顯差異，見圖4。平板克隆形成實驗顯示,miR-221 mimics組集落形成數比對照組和空白組明顯增加(P<0.05)，而對照組與空白組集落形成數量之間無統計學差異,見圖5。

4 PTEN是miR-221的下游靶基因

運用生物信息學軟件TargetScan進行靶基因預測，顯示PTEN可能是miR-221的下游靶基因。雙螢光素酶報告基因檢測結果顯示，在含野生型PTEN的3’-UTR序列細胞中，轉染miR-221 mimics組與對照組相比，螢光素酶活性明顯下降(P<0.05)；而在含突變型PTEN的3’-UTR序列細胞中，實驗組與對照組和空白組的螢光素酶活性無明顯差異,見圖6。

Figure 4. Proliferation curves of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖4肺癌A549細胞的增殖曲線

Figure 5. Flat plate colony formation test results of lung cancer A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖5肺癌A549細胞的克隆形成率

Figure 6. The effect of miR-221 on the target sequence ofPTENdetected by luciferase enzymatic activity. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖6螢光素酶活性檢測miR-221對PTEN靶序列的作用

討 論

miRNA是人體內長度約22個核苷酸的非編碼雙鏈小RNA。 miRNA能與相應的信使RNA的互補序列結合，在轉錄和翻譯水平調控靶基因的表達，進而在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發揮重要作用[8]。在多種腫瘤的發生及發展過程都存在miRNA的表達異常。根據miRNA對腫瘤細胞的影響，將其分為致癌miRNA和抑癌miRNA。研究發現，即使是同一種miRNA在不同的腫瘤中表達也會有差異，有時甚至截然不同，對腫瘤細胞的影響也千差萬別[9]。前期我們運用PCR技術檢測，發現miR-221在肺癌組織中表達較癌旁正常組織明顯增加，提示miR-221可能在肺癌的發展中起重要作用。

miR-221在人類組織及細胞中發現比較早、存在范圍廣泛，并且在多種腫瘤中都發現其表達異常，其作用得到了越來越多的重視。研究發現在肝癌細胞中miR-221含量較正常肝細胞明顯升高，其負向調控細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CDKN1B/p27以及CDKN1C/p57，促進肝癌細胞增殖[10]。Pallante等[11]通過微陣列芯片分析甲狀腺癌組織及正常甲狀腺組織，結果發現miR-221在癌組織中顯著升高；而沉默miR-221表達后，癌細胞的增殖水平明顯降低。在本研究中，在A549細胞中轉染miR-221 mimics后，肺癌細胞增殖能力明顯升高；集落形成數比對照組、空白組均明顯增加。這與我們前期發現miR-221在肺癌組織中表達增加是吻合的。

為了進一步確定miR-221的下游作用靶點，我們運用了公認的TargetScan靶基因預測軟件，并結合相關文獻，提示第10號染色體缺失的PTEN可能是其作用靶點之一。PTEN是第1個被發現的有磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼的蛋白含有脂質磷酸酶及蛋白磷酸酶的雙重特異性酶活性，與腫瘤的關系密切[12]。研究發現在肺癌中PTEN表達的缺失會導致其不能抑制PI3K/AKT信號通路，進而促進肺癌的發展[13]。在人白血病K562細胞中轉染PTEN后，細胞生長明顯受到抑制，且能增強青蒿琥酯的抑癌作用[14]。在本實驗中，轉染miR-221 mimics后肺癌細胞中PTEN蛋白及mRNA表達明顯下降，且雙螢光素酶報告基因進一步確定了PTEN為miR-221的下游靶基因。miR-221抑制PTEN表達后會如何影響下游信號通路還需我們進一步地研究。

綜上所述，本研究通過細胞轉染使miR-221在肺癌細胞中過表達，檢測細胞的增殖能力，并進一步探討其作用機制。研究結果表明miR-221能夠抑制PTEN的表達，進而促進肺癌細胞的增殖。本研究揭示肺癌中miR-221調控的新機制，有望為肺癌的治療提供可能的作用靶點。

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miR-221 promotes proliferation of lung cancer A549 cells by down-regulating PTEN

ZHENG Li-ping, ZHANG Nan, LIANG Cui-wei, DU Jun-xiang, GONG Wu-xing

(DepartmentofOncology,ZhuhaiPeople’sHospital,ZhuhaiHospitalAffiliatedtoJinanUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zlpzs1987@126.com)

AIM: To explore the effect of microRNA-221 (miR-221) on the proliferation of lung cancer A549 cells， and to investigate its mechanism.METHODSThe A549 cells were transfected with miR-221 mimics by Lipofectamine 2000. The expression of miR-221 was detected by RT-qPCR. The expression of PTEN at mRNA and protein le-vels was detected by RT-qPCR and Western blot, respectively. The cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay. The 3’-UTR ofPTENwas cloned into luciferase reporter vector and its enzymatic activity was detected to verify whether miR-221 targeted toPTEN.RESULTSThe expression level of miR-221 in the A549 cells was significantly increased after transfection with miR-221 mimics as compared with negative control group and blank group (P<0.01). The mRNA and protein levels of PTEN were significantly down-regulated compared with control group and blank group (P<0.05). In addition, miR-221 over-expression significantly promoted the proliferation of A549 cells (P<0.05). Moreover, miR-221 inhibited the enzymatic activity of luciferase reporter vector ofPTEN.CONCLUSIONOver-expression of miR-221 significantly promotes the proliferation ability of human lung cancer A549 cells by down-regulation of PTEN.

Lung cancer; A549 cells; MicroRNA-221; PTEN protein; Cell proliferation

1000- 4718(2017)12- 2208- 04

2017- 05- 15

2017- 05- 27

△通訊作者 Tel: 0756-2158932; E-mail: zlpzs1987@126.com

R734.2; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.015

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)