葉酸修飾的聚乙烯亞胺聚合物載PD-L1 siRNA體外靶向胃癌細胞的研究*

羅 信， 彭 霞， 陳廣成， 侯婧瑛， 吳淑云， 王凌云△

(中山大學孫逸仙紀念醫院 1消化內科， 2急診科， 廣東 廣州 510120； 3中山大學腫瘤防治中心胸外科， 廣東 廣州 510060)

葉酸修飾的聚乙烯亞胺聚合物載PD-L1 siRNA體外靶向胃癌細胞的研究*

羅 信1， 彭 霞1， 陳廣成1， 侯婧瑛2， 吳淑云3， 王凌云1△

(中山大學孫逸仙紀念醫院1消化內科，2急診科， 廣東 廣州 510120；3中山大學腫瘤防治中心胸外科， 廣東 廣州 510060)

目的構建高效的siRNA納米載體靶向SGC-7901胃癌細胞，并下調胃癌表達的程序性死亡配體1(PD-L1)。方法檢測葉酸(FA)-PEG-SS-PEI-SPION納米載體與siRNA復合后的粒徑、電位等表征；體外實驗檢驗siRNA的結合能力、復合物細胞毒性、細胞攝入能力及轉染效率；磁共振(MR)成像檢測示蹤能力；檢驗胃癌細胞PD-L1下調效應及共培養T細胞的細胞因子水平。結果N/P比值為10時，FA-PEG-SS-PEI-SPION完全復合siRNA，形成電位為(9.14±0.80) mV、粒徑為(116.7±2.5) nm的多聚復合物。靶向組的轉染率為(95.06±0.44)%，與非靶向組的(93.87±1.05)%相當；平均熒光強度為1 892.67±81.51，高于非靶向組的1 324.33±186.58 (P<0.05)。普魯士藍染色和激光共聚焦顯微鏡成像證實了復合物的細胞攝入。體外MR成像驗證了聚合物的MR造影成像能力。靶向組PD-L1 的mRNA最低相對表達量為9.07%±0.79%，Western blot顯示PD-L1的表達顯著降低。共培養實驗顯示IFN-γ和TNF-α的分泌水平增加，IL-10的分泌水平降低(P<0.05)。結論本研究構建了FA-PEG-SS-PEI-SPION納米載體，并證明了其體外靶向細胞及載siRNA下調PD-L1表達的能力和MR示蹤的能力，是一種高效和安全的靶向治療納米載體。

程序性死亡配體1； 胃癌； 葉酸； 磁共振成像； siRNA

胃癌在亞洲、東歐和拉丁美洲的許多國家中是發病率最高的惡性腫瘤，是腫瘤死亡的第3大病因[1-2]。目前胃癌的主要治療手段是手術和化療，而免疫檢查點的靶向治療是一種具有前景的胃癌治療方法。其中，程序性死亡配體1(programmed death ligand-1，PD-L1)能和表達在活化T細胞上面的程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)結合，參與逃逸腫瘤中免疫細胞的監視[3]。PD-L1可以通過促進對調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)的誘導和維持來抑制T細胞反應[4]。胃癌中具有過表達PD-1/PD-L1的特征[5-7]，而且PD-L1的高表達與胃癌的不良預后密切相關[8-10]。以上均提示PD-L1在胃癌的進展中起到關鍵作用，阻斷PD-1/PD-L1可以逆轉免疫逃逸和改善預后。目前的臨床研究多集中于使用多克隆抗體阻斷PD-L1治療胃癌，但是還沒有使用聚合物基因載體進行胃癌PD-L1阻斷治療的報道。小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)作為一種較成熟的基因治療手段，具有安全性好、特異性高等優勢，因此本實驗探究并構建一種多功能siRNA載體聚合物靶向輸送于葉酸受體(folic acid receptor，FR)和PD-L1過表達的胃癌細胞系SGC-7901中[11]，以驗證該聚合物載體對胃癌的應用價值。非病毒載體中，聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)類陽離子聚合物的體外基因轉染效率是最高的。PEI的正電荷含量較高，可以和帶負電荷的siRNA結合，并且通過“質子海綿效應”使PEI/siRNA復合物逃逸溶酶體降解[12-13]。然而，PEI高陽離子電荷密度也造成了細胞毒性的增大。為了降低細胞毒性，我們把PEI和聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]通過二硫鍵(-SS-)連接。PEG修飾降低了細胞毒性并增強了靜脈應用時的血清中穩定性，而二硫鍵使PEI-siRNA可以敏感地在細胞胞漿中的高谷胱甘肽環境中釋放。葉酸(folic acid，FA)可以與過表達于多數腫瘤表面的FR結合[14-15]，增加內吞作用介導的細胞攝入，因此，FA可以作為FR過表達的腫瘤的理想特異靶向配體。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)Fe3O4是磁共振(magnetic resonance，MR)成像T2加權增強造影劑，可以使基因載體具備MR成像的功能，有助于監控藥物體內循環分布，并增強病灶的MR成像對比度。本研究通過復合FA、PEG、PEI和SPIO構建FA-PEG-SS-PEI-SPION，形成多功能基因載體納米顆粒，又通過載siRNA阻斷胃癌PD-L1表達，使之具備潛在的臨床應用價值。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

大部分化學材料，如PEI (25 kD)、單甲氧基PEG (mPEG-OH, 2 kD)、丁二(酸)酐、二環己基碳二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)和N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)購自Sigma-Aldrich。平均測量直徑為6 nm的疏水SPION 根據前述的方法合成[16]。α-羥基-ε-氨基-聚乙二醇(HO-PEG-NH2；Mn=3.6 kD，Mw/Mn=1.3)根據前述的方法制備[17]。 PD-L1和對照siRNA(scrambled siRNA，siSCR) 購自蘇州吉瑪基因公司。siRNA的序列如下：siRNA-1的正義鏈為5’-GGAUCCAGUCACCUCUGAATT-3’，反義鏈為5’-UUCAGAGGUGAC-UGGAUCCTT-3’；siRNA-2的正義鏈為5’-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3’，反義鏈為5’-UUGAUUCUCAGUGU GCUGGTT-3’；siRNA-3的正義鏈為5’-GGCACAUCCUCCAAAUGAATT-3’，反義鏈為5’-UUCAUUUGGAGGAUGUGCCTT-3’；siRNA-4的正義鏈為5’-GGAGAAUGAUGGAUGUGAATT-3’，反義鏈為5’-UUCACAUCCAUCAUUCUCCTT-3’；scrambled siRNA的正義鏈為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’， 反義鏈為 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。qPCR 引物購自北京六合華大。 PD-L1的正義鏈為5’- GTGGCATCCAAGATACAAACTCAA-3’，反義鏈為 5’- TCCTTCCTCTTGTCACGCTCA-3’; GAPDH的正義鏈為5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，反義鏈為5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’。人胃癌細胞系SGC-7901 來自上海生物化學與細胞研究所，培養于無葉酸 RPMI-1640，并添加10%胎牛血清和5% L-谷氨酰胺-盤尼西林-鏈霉素溶液 (Sigma-Aldrich)。

2 多功能納米多聚復合物的合成及制備

2.1基因納米載體的合成 FA-PEG-SS-PEI 聚合物的合成和活化方法見前述[18]。為了讓葉酸和HO-PEG-NH2共軛[19]，先把葉酸溶解于無水DMSO (20 mL)。然后加入NHS和DCC 并且在室溫下攪拌過夜。在氬氣環境下，混合物使用0.22 μm過濾器過濾以去除副產物1，3-二環己基脲(1,3-dicyclohexylurea，DCU)，并和含TEA (pH 8.0)的HO-PEG-NH2DMSO溶液室溫下反應24 h，用去離子水滲析(截留分子量為1 kD)、低壓凍干。然后把3-(2-羧基-乙基丙基二硫醚)-丙酸、NHS和二甲氨基吡啶溶解于無水DMSO(20 mL)，室溫下攪拌過夜。加入FA-PEG-OH 并反應24 h。混合物再次對去離子水滲析(截留分子量為1 kD), 并低壓凍干。最后，上述產物、NHS和DCC都用無水DMSO (20 mL)溶解并在室溫下攪拌過夜。然后，混合物用0.22 μm 過濾器過濾，去除副產物DCU。把超支化PEI加入混合物室溫反應24 h以生成FA-PEG-SS-PEI產物。混合物在蒸餾水中用膜透析(MWCO: 14 kD)純化3 d并低壓凍干。非靶向mPEG-SS-PEI以相同的方法合成。

2.2mPEG-SS-PEI-SPION/FA-PEG-SS-PEI-SPION的合成 mPEG-SS-PEI/FA-PEG-SS-PEI 包裹的SPIO納米顆粒載體可通過配體交換的方法合成[20]。mPEG-SS-PEI/FA-PEG-SS-PEI (200 mg)溶解于2 mL的三氯甲烷，然后SPIO (10 mg)被分散到上述溶液中。混合物在室溫下攪拌過夜反應，然后沉淀成大量的正己烷。沉淀用離心的方法收集并用正己烷洗滌2次、真空干燥，以去除有機溶劑。如上制備的產物在超聲下分散于雙蒸水并使用220 nm的過濾膜清除濾過較大的沉淀。

2.3制備復合siRNA的陽離子膠束 RNA (4 mg)和適量的納米載體分別溶解于PBS。2種溶液用移液器混勻，然后放置室溫60 min復合。N/P比是納米載體中的氮原子數與siRNA中的磷原子數之比。復合siRNA的納米載體的量是由N/P比決定的。

3 主要實驗方法

3.1粒徑大小和Zeta電位的測量 PD-L1 siRNA 和經修飾的PEI在無RNA酶的水中通過把稀釋的siRNA溶液和聚合物溶液混合，以不同的N/P復合。混合物在室溫下孵育1 h，而后用無RNA酶水稀釋到1 mL。粒徑大小和zeta電位使用帶He-Ne激光的 Zetasizer Nano (Malvern Instruments)，通過動態光散射的方法測定。散射光在氣溫25 ℃、以90°成角檢測。測量重復3次。

3.2凝膠阻滯電泳 siRNA和FA-PEG-SS-PEI-SPION或PEG-SS-PEI-SPION的結合能力可以通過瓊脂糖凝膠電泳來確定。把PEG-SS-PEI-SPION 或FA-PEG-SS-PEI-SPION和人scrambled siRNA以不同N/P與去離子無RNA酶水混合，產生 PEG-SS-PEI-SPION/siRNA和FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA復合物。每個樣的siRNA量設定為10 pmol。混合物在室溫孵育1 h使聚合物完全復合。然后，聚合物與6× agarose gel loading buffer 混合，上樣到1% 瓊脂糖凝膠中并在TBE緩沖液、100 V電壓下電泳20 min。siRNA條帶用紫外光成像系統(Bio-Tanon)觀察。

3.3聚合物的細胞毒性檢測 細胞毒性實驗使用MTS分析(購自Promega)。SGC-7901細胞以每孔5.0×103種于96孔板過夜，并用前述形成的聚合物/siRNA處理。72 h后，細胞在含MTS溶液的培養基中37 °C孵育3.5 h。酶標儀(Bio-Rad)于490 nm處于讀取吸光度(A490)。相對細胞存活率(%)=(樣品A490-空白A490)/(對照A490-空白A490) × 100%。每個N/P比值獨立重復3次。

3.4流式細胞術 SGC-7901細胞以每孔2×105的密度種在6孔板上。聚合物/FAM共軛的scrambled siRNA(siSCR-FAM)以不同的N/P復合并以100 pmol siRNA每孔的數量加進細胞培養液中。經過4 h孵育，轉染培養液棄去，細胞使用PBS洗滌，并用FACSVerseTM流式細胞儀(Becton Dickinson)分析。FAM陽性的細胞占收集的比例代表了轉染率的大小，FAM的幾何平均吸光度代表了平均熒光指數(mean fluorecence index，MFI)，間接表示細胞攝入的平均數量。獨立重復3次。

3.5普魯士藍染色 FA-PEG-SS-PEI-SPION/PEG-SS-PEI-SPION多聚物含Fe3O4并且可以在普魯士藍染色下觀察到。為了明確(FA-)PEG-SS-PEI-SPION/siRNA多聚復合物的細胞攝入，我們進行了普魯士藍染色實驗。SGC-7901細胞使用0～40 mg/L鐵濃度的FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR復合物轉染處理4 h；去除轉染培養基，洗滌細胞并用4%多聚甲醛在室溫下固定10 min；細胞再次用PBS洗滌3次，并添加普魯士藍染色液；經過30 min室溫下孵育，細胞用PBS洗滌3次并且在倒置顯微鏡下觀察。

3.6體外MR成像 為了證明聚合物載體復合了SPIO并具備MR增強造影能力和具有增強MR診斷靈敏度的應用潛力，我們進行了SGC-7901細胞的體外MR成像。SGC-7901細胞以每孔2×105的密度接種于6孔板培養過夜并且分別使用0、5、10、20和40 mg/L鐵濃度的PEG-SS-PEI-SPION/siRNA或FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA處理。轉染后4 h，收集SGC-7901細胞并且用PBS洗滌3次。離心后，細胞使用500 μL 1% 瓊脂糖/PBS 溶液重懸并轉移到96孔板，待溶液冷卻，使細胞分散固定于孔板上凝固的瓊脂糖。接著，在室溫下使用帶11 cm環形線圈的Intera 1.5T MRI System (Philips)進行體外MR掃描成像。

3.7RT-qPCR實驗 SGC-7901細胞的種板和轉染方法如前所述。RNA的提取、純化和逆轉錄成cDNA使用RNAiso Plus Kit和 PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa)，并根據廠商的說明操作。qPCR使用SYBR? Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑操作，并且在CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)分析。數據分析方法使用2-ΔΔCt法。實驗獨立重復3次。

3.8Western blot實驗 SGC-7901細胞以每孔2×105種于6孔板，并且轉染siRNA的方法同前所述。3 d后收集并用RIPA lysis buffer (Santa Cruz)裂解細胞，提取蛋白。蛋白樣品在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳濃縮分離，并轉移到PVDF膜上，使用化學發光法曝光。在實驗中使用了單克隆兔PD-L1抗體(Abcam)和多克隆兔β-tubulin抗體(CST)。

3.9SGC-7901/活化T細胞共培養模型的建立 健康人的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)使用淋巴細胞梯度密度離心法(Sigma-Aldrich)分離。PBMCs以每孔2×105種于96孔板并用anti-CD3e (10 g/L)和 anti-CD28 (2 g/L)(eBioscience)刺激T細胞活化72 h。SGC-7901細胞使用FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA-2或FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR預處理4 h，3 d后收集并將純化活化的T細胞與SGC-7901細胞以10∶1的比例共培養48 h。收集共培養上清液，并用ELISA的方法檢測TNF-α、IFN-γ和IL-10的表達量。

4 統計學處理

數據應用 SPSS 20.0 統計軟件分析，結果以均數±標準誤(mean±SEM)表示，均數比較采用非配對的t檢驗和方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA 表征檢測

如圖1，隨著N/P比值的上升，FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA復合物的zeta電位大小從N/P=5時的(3.12±0.50) mV逐漸上升，siRNA的復合更加完全，N/P=20時zeta電位達到(15.34±0.90) mV。N/P=1時復合物的粒徑為(195.4±2.0) nm，隨著N/P比值升高，粒徑逐漸減小，在較大N/P比值時達到約120 nm左右。N/P=10時，復合物的平均直徑達到了(116.7±2.5) nm。納米載體的粒徑小于200 nm，能有效地穿透細胞膜被細胞攝取，并且適當的正電位提示siRNA的負電荷被中和，使得復合物能在不破壞細胞膜完整性的情況下被細胞內吞。

2 凝膠阻滯電泳

如圖2，N/P比值為1時， siRNA電泳條帶相比裸siRNA對照暗，這表明了多聚物與部分siRNA的結合。隨著N/P比值的逐漸增大，siRNA電泳條帶逐漸變暗。當N/P為4或5時，無FA的非靶向組siRNA條帶較暗，此時siRNA結合程度比FA靶向組高；當N/P為10或者以上的時候，2組siRNA電泳條帶都幾乎消失，表示此時多聚物完全結合了siRNA。

Figure 1. The characterization of the FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA. Zeta potential and particle size of FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA at variousN/Pratios. Mean±SEM.n=3.

圖1FA-PEG-SS-PEI-SPION的表征

Figure 2. siRNA binding of PEG-SS-PEI-SPION and FA-PEG-SS-PEI-SPION. Agarose gel electrophoresis of PEG-SS-PEI-SPION/siRNA (A) and FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA (B) at variousN/Pratios. Na: naked siRNA.

圖2PEG-SS-PEI-SPION和FA-PEG-SS-PEI-SPION與siRNA的結合能力

3 復合物的細胞毒性

如圖 3所示，N/P為10的時候，FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA和PEG-SS-PEI-SPION/siRNA 復合物處理組的細胞存活率分別為(95.08±2.24)%和(94.47±2.04)%。隨著N/P比值的升高，納米多聚復合物的毒性逐漸增大。當N/P比值等于或低于20時，SGC-7901的72 h存活率比脂質體復合物處理對照要高。此外，FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA和PEG-SS-PEI-SPION/siRNA細胞毒性的差異并沒有統計學顯著性，這表示靶向的葉酸修飾具有良好的生物相容性和低毒性。

Figure 3. The cytotoxicity of PEG-SS-PEI-SPION and FA-PEG-SS-PEI-SPION. Mean±SEM.n=3.

圖3PEG-SS-PEI-SPION和FA-PEG-SS-PEI-SPION的細胞毒性

4 轉染效率

當N/P比值為4和6時，由于siRNA還未完全結合， FA-PEG-SS-PEI-SPION的轉染率和MFI分別都比PEG-SS-PEI-SPION要低(P<0.05)。當N/P比值升高到10時，siRNA已經完全結合，FA-PEG-SS-PEI-SPION的轉染率達到95.06%±0.44%，和PEG-SS-PEI-SPION (93.88%±1.05%)比較差異沒有統計學顯著性，并且擁有更高的MFI(P<0.05)，提示細胞攝入聚合物的平均數量更多。這表明FA共軛修飾促進了細胞的聚合物攝入，FA修飾的靶向組聚合物理論上擁有比非靶向聚合物更高的轉染效率，見圖4。

5 聚合物的細胞攝入

聚合物中的SPIO成分含鐵離子，使用普魯士藍染色實驗可以顯示納米聚合物的細胞攝入。隨著聚合物鐵濃度的上升，FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR處理組SGC-7901細胞的胞漿里可見逐漸增多的藍染顆粒。此外，使用激光共聚焦顯微鏡可以觀察細胞對復合物的攝入。相比PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM處理，FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM處理的細胞胞漿內可見更多的綠色熒光。這提示FA-PEG-SS-PEI-SPION可以傳遞更多的siRNA進入SGC-7901細胞，并且可能具有更高的PD-L1下調效力，見圖5。

Figure 4. Transfection efficiency of PEG-SS-PEI-SPION and FA-PEG-SS-PEI-SPION. Transfection efficiency (A) and mean fluorescence index (B) of PEG-SS-PEI-SPION/siRNA, FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA and Lipofectamine/siRNA. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsPEG-SS-PEI-SPION at the sameN/Pratio.

圖4PEG-SS-PEI-SPION和FA-PEG-SS-PEI-SPION的轉染效率

6 體外MR成像

為了驗證聚合物載體的MR增強造影能力，使用不同鐵濃度的聚合物轉染SGC-7901細胞并進行體外MR成像實驗。非靶向組處理和靶向組處理的細胞T2信號都隨著處理濃度升高而降低。2組T2值都隨著處理濃度升高而降低，FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR靶向組的降低幅度更高(P<0.01)，見圖6。

7 PD-L1的下調

為平衡低細胞毒性和高轉染率，我們采用了N/P=10來復合siRNA和納米載體。在4條PD-L1 siRNA序列中，荷載siRNA-1和siRNA-2聚合物處理組的PD-L1 mRNA相對表達量分別為23.47%±4.59%和9.07%±0.79%。Western blot實驗結果顯示，SGC-7901細胞上的PD-L1蛋白表達水平變化和mRNA水平的變化是一致的。與對照組相比，荷載siRNA-1和siRNA-2處理組PD-L1的表達水平均顯著減少，其中荷載siRNA-2處理組具有最顯著的下調PD-L1蛋白表達水平的效果。SGC-7901細胞的PD-L1蛋白水平能在處理3 d后顯著下降，并且持續到至少轉染后的第6天，見圖7。

Figure 5. The cellular internalization of FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA polyplex. A: Prussian blue staining of the SGC-7901 cells treated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR at Fe concentrations of 10, 20 and 40 mg/L (×200); B: confocal images of SGC-7901 cells treated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM and PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM. PP: PEG-SS-PEI-SPION; FP: FA-PEG-SS-PEI-SPION; siSCR-FAM: scrambled siRNA conjugated with FAM.

圖5FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA多聚復合物的細胞攝入

8 對T細胞功能的影響

為了確定聚合物荷載siRNA是否通過抑制PD-L1表達來影響T細胞功能，我們建立了SGC-7901/活化T細胞共培養模型。如圖8，ELISA實驗顯示T細胞與FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA預處理的SGC-7901細胞共培養后IFN-γ 和TNF-α水平顯著增加，而IL-10水平顯著下降。

討 論

PD-L1作為進展期胃癌的潛在治療靶點，已經被證明是有效的預后生物標志物，而且它的多克隆抗體應用已進行到Ⅲ期臨床試驗階段(NCT02625623和NCT02625610)。阻斷PD-1/PD-L1相互作用的多克隆抗體已經被批準應用于進展期黑色素瘤和轉移性非小細胞肺癌。對于進展期胃癌，早前的多個臨床試驗已經證明了多克隆抗體的安全性和有效性[21-22]。然而，PD-L1并不只在腫瘤細胞上表達，而是廣泛表達于造血細胞和非造血細胞上[23-24]，并且PD-1/PD-L1和B7-1/PD-L1 等作用在調節效應T細胞功能和限制自身免疫反應過程中起關鍵作用。非靶向的阻斷以上相互作用可能導致除治療效應外的相關的不良反應，并且相關機制仍未完全揭示[25-26]。為了探索更高效特異的PD-1/PD-L1阻斷方法，本實驗通過化學修飾陽離子聚合物納米載體來實現對PD-L1的干擾。

RNA干擾可引起相應的mRNA被酶降解，是一種特異的轉錄后基因沉默機制。通過這種機制，含21～25個堿基對的siRNA，可以特異性地沉默基因的表達。使用siRNA治療手段阻斷PD-1/PD-L1相互作用的方法安全且易于獲得。目前使用siRNA基因治療的障礙在于裸siRNA容易被環境中的核酸酶降解、被細胞內溶酶體降解，siRNA所帶的負電荷和細胞膜的排斥作用使得siRNA難以穿透細胞膜進入細胞，并且在人體應用還存在腎臟排出和藥物是否集聚于靶標腫瘤部位等問題。

由于陽離子聚合物作為基因載體的高轉染效率，PEI及其衍生物被廣泛運用于基因運載[27-28]。然而，作為治療用的基因運載工具，未經修飾的PEI具有顯著的細胞毒性，這嚴重限制了它在治療上的進一步運用。為了減少細胞毒性，我們使用PEG修飾，

Figure 6.InvitroMR imaging of SGC-7901 cells. A: T2-map of SGC-7901 cells treated with PP/siSCR or FP/siSCR at Fe concentrations of 0, 5, 10, 20 and 40 mg/L; B: comparison of the corresponding T2values. PP: PEG-SS-PEI-SPION； FP: FA-PEG-SS-PEI-SPION; siSCR: scrambled siRNA. Mean±SEM.n=3.

圖6體外細胞MR成像

Figure 7. The effect of PD-L1 knockdown on the expression of PD-L1 at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells. A: the mRNA levels of PD-L1 in the SGC-7901 cells treated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA; B: the protein expression of PD-L1 in the SGC-7901 cells 72 h after transfection determined by Western blot; C: the protein expression of PD-L1 in the SGC-7901 cells at day 1 (D1) to day 6 (D6) after transfection determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.

圖7SGC-7901細胞中PD-L1的下調效應

Figure 8. The IFN-γ (A), TNF-α (B) and IL-10 (C) levels in the culture medium of the cocultured T cells. T-cell alone: activated T cells without coculturing; SGC-7901: SGC-7901 cells pretreated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR; treated SGC-7901: SGC-7901 cells pretreated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA-2. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsT-cell/SGC-7901.

圖8共培養T細胞的細胞因子分泌

形成聚合物的親水外層，作為對表面陽離子的保護屏障，通過抑制與血液成分和細胞外基質的非特異結合來穩定聚合物[13]。經過PEG修飾，聚合物細胞毒性較低，而同時具有高轉染效率。為了增強聚合物的靶向性，我們在基因傳遞載體中引進了FA基團，以此來增強受體介導的內吞作用。葉酸受體廣泛表達于一系列腫瘤上，因此葉酸FA可以被用作靶向基團，并且可以增強腫瘤細胞對聚合物的攝取。

由于其磁特性和生物可降解性，SPION被廣泛運用于磁性靶向和腫瘤診療中的磁共振增強影像[29-30]。SPIO可以通過配體交換等方法和PEI形成聚合物膠束。而通過和帶陽離子的聚合物PEI的靜電結合，帶負電荷的核酸可以同時共軛于磁性納米顆粒。這個PEI及其修飾衍生物的特性，使siRNA和SPION的不同特性可以結合于一體，并同時具有靶點基因沉默和磁共振顯像增強的功能。總之，聯合傳遞siRNA和SPIO納米顆粒到腫瘤位點可以增強治療效應，減少非靶向不良反應并且增強T2成像的對比度。這使我們可以觀察納米藥物的生物學分布并且以此預測治療的效果，無創性地監控腫瘤的進展。本課題組結合以上特點構建FA-PEG-SS-PEI-SPION納米聚合物載體并用實驗表明細胞上PD-L1表達水平在FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA-2處理后顯著下調，阻斷了癌細胞和T細胞的PD-1/PD-L1作用。

PD-1主要表達在活化的淋巴細胞表面，而PD-L1則主要表達在許多腫瘤細胞和巨噬細胞、樹突狀細胞等表面。作為活化T細胞上表達的共抑制受體，PD-1與腫瘤細胞上表達的PD-L1相互結合，抑制T細胞的增殖和遷移，減少細胞毒作用介質的釋放，最終抑制淋巴細胞對腫瘤的殺傷功能[31]。作為活化T細胞上表達的共抑制受體，PD-1與腫瘤細胞上表達的PD-L1相互作用。為了探究在聚合物/ PD-L1 siRNA處理下的T細胞功能改變，我們建立了SGC-7901/活化T細胞的共培養模型。細胞因子的水平可以反映T細胞功能狀態和免疫微環境的狀態。IFN-γ具有調節免疫的功能，TNF-α具有誘導殺傷腫瘤細胞的功能，均可由浸潤CD8+T細胞分泌，并刺激腫瘤細胞表面的PD-L1表達[32]，參與腫瘤免疫應答。由T細胞分泌的IL-10是一種起免疫抑制作用的細胞因子，它可以由PD-L1刺激生成[33-34]。共培養模型中以上細胞因子水平的改變提示有效地阻斷了PD-1/PD-L1相互作用并增強細胞毒性T細胞的功能。

本實驗構建并且描述了FA-PEG-SS-PEI-SPION聚合物的特征，并且成功地把PD-L1 siRNA輸送入SGC-7901細胞。體外實驗證明了FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA復合物的MR增強造影成像能力和下調PD-L1表達的能力，納米聚合物輸送PD-L1 siRNA可以阻斷PD-1/PD-L1作用進而調節T細胞功能。因此FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA納米多聚復合物對胃癌的免疫治療具有非常大的潛能，本項目可以在下一步開展更多體外及體內功能實驗以闡明此多聚復合物的應用前景。

(致謝:誠摯感謝中山大學孫逸仙紀念醫院放射科沈君教授和中山大學化學與化學工程學院張路博士為本實驗提供的技術幫助和指導。)

[1] Torre LA, Siegel RL, Ward EM, et al. Global cancer incidence and mortality rates and trends: an update[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2016, 25(1):16-27.

[2] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.

[3] Zou W, Chen L. Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8(6):467-477.

[4] Francisco LM, Salinas VH, Brown KE, et al. PD-L1 regulates the development, maintenance, and function of induced regulatory T cells[J]. J Exp Med, 2009, 206(13):3015-3029.

[5] Wang W, Li F, Mao Y, et al. A miR-570 binding site polymorphism in theB7-H1 gene is associated with the risk of gastric adenocarcinoma[J]. Hum Genet, 2013, 132(6):641-648.

[6] Savabkar S, Azimzadeh P, Chaleshi V, et al. Programmed death-1 gene polymorphism (PD-1.5 C/T) is associated with gastric cancer[J]. Gastroenterol Hepatol Bed Bench, 2013, 6(4):178-182.

[7] Saito H, Kuroda H, Matsunaga T, et al. Increased PD-1 expression on CD4+and CD8+T cells is involved in immune evasion in gastric cancer[J]. J Surg Oncol, 2013, 107(5):517-522.

[8] Zhang L, Qiu M, Jin Y, et al. Programmed cell death ligand 1 (PD-L1) expression on gastric cancer and its relationship with clinicopathologic factors[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9):11084-11091.

[9] 侯婧瑛， 向仍運， 陳淑芬， 等. Foxp3+Tregs和PD1在胃癌組織中的表達及其臨床病理意義[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(10):1744-1749.

[10] 吳淑云， 于 鐘， 侯婧瑛， 等. B7-H1、B7-H3、B7-H4在胃癌中的表達及其臨床意義[J]. 中華實驗外科雜志, 2014, 31(12):2852-2854.

[11] Ma H, Liu Y, Shi M, et al. Theranostic, pH-responsive, doxorubicin-loaded nanoparticles inducing active targeting and apoptosis for advanced gastric cancer[J]. Biomacromolecules, 2015, 16(12):4022-4031.

[12] Godbey WT, Wu KK, Mikos AG. Poly(ethylenimine) and its role in gene delivery[J]. J Control Release, 1999, 60(2-3):149-160.

[13] Li L, Wei Y, Gong C. Polymeric nanocarriers for non-viral gene delivery[J]. J Biomed Nanotechnol, 2015, 11(5):739-770.

[14] Wang S, Low PS. Folate-mediated targeting of antineoplastic drugs, imaging agents, and nucleic acids to cancer cells[J]. J Control Release, 1998, 53(1-3): 39-48.

[15] Sudimack J, Lee RJ. Targeted drug delivery via the folate receptor[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2000, 41(2):147-162.

[16] Sun S, Zeng H, Robinson DB, et al. Monodisperse MFe2O4(M = Fe, Co, Mn) nanoparticles[J]. J Am Chem Soc, 2004, 126(1):273-279.

[17] Lee H, Jeong JH, Park TG. A new gene delivery formulation of polyethylenimine/DNA complexes coated with PEG conjugated fusogenic peptide[J]. J Control Release, 2001, 76(1-2):183-192.

[18] Liang B, He ML, Chan CY, et al. The use of folate-PEG-grafted-hybranched-PEI nonviral vector for the inhibition of glioma growth in the rat[J]. Biomaterials, 2009, 30(23-24):4014-4020.

[19] Cammas S, Nagasaki Y, Kataoka K. Heterobifunctional poly(ethylene oxide): synthesis of alpha-methoxy-omega-amino and alpha-hydroxy-omega-amino PEOs with the same molecular weights[J]. Bioconjug Chem, 1995, 6(2): 226-230.

[20] Tromsdorf UI, Bigall NC, Kaul MG, et al. Size and surface effects on the MRI relaxivity of manganese ferrite nanoparticle contrast agents[J]. Nano Lett, 2007, 7(8):2422-2427.

[21] Muro K, Chung HC, Shankaran V, et al. Pembrolizumab for patients with PD-L1-positive advanced gastric cancer (KEYNOTE-012): a multicentre, open-label, phase 1b trial[J]. Lancet Oncol, 2016, 17(6):717-726.

[22] Brahmer JR, Tykodi SS, Chow LQ, et al. Safety and activity of anti-PD-L1 antibody in patients with advanced cancer[J]. N Engl J Med, 2012, 366(26): 2455-2465.

[23] Keir ME, Butte MJ, Freeman GJ, et al. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity[J]. Annu Rev Immunol, 2008, 26:677-704.

[24] Freeman GJ, Long AJ, Iwai Y, et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation[J]. J Exp Med, 2000, 192(7):1027-1034.

[25] Rosenberg JE, Hoffman-Censits J, Powles T, et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial[J]. Lancet, 2016, 387(10031):1909-1920.

[26] Fehrenbacher L, Spira A, Ballinger M, et al. Atezolizumab versus docetaxel for patients with previously treated non-small-cell lung cancer (POPLAR): a multicentre, open-label, phase 2 randomised controlled trial[J]. Lancet, 2016, 387(10030):1837-1846.

[27] J?ger M, Schubert S, Ochrimenko S, et al. Branched and linear poly(ethylene imine)-based conjugates: synthetic modification, characterization, and application[J]. Chem Soc Rev, 2012, 41(13):4755-4767.

[28] Kichler A, Leborgne C, Coeytaux E, et al. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study[J]. J Gene Med, 2001, 3(2):135-144.

[29] Bakhtiary Z, Saei AA, Hajipour MJ, et al. Targeted superparamagnetic iron oxide nanoparticles for early detection of cancer: Possibilities and challenges[J]. Nanomedicine, 2016, 12(2):287-307.

[30] Kandasamy G, Maity D. Recent advances in superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) forinvitroandinvivocancer nanotheranostics[J]. Int J Pharm, 2015, 496(2):191-218.

[31] Butte MJ, Keir ME, Phamduy TB, et al. Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses[J]. Immunity, 2007, 27(1):111-122.

[32] Spranger S, Spaapen RM, Zha Y, et al. Up-regulation of PD-L1, IDO, and Tregsin the melanoma tumor microenvironment is driven by CD8+T cells[J]. Sci Transl Med, 2013, 5(200):200ra116.

[33] Dennis KL, Blatner NR, Gounari F, et al. Current status of interleukin-10 and regulatory T-cells in cancer[J]. Curr Opin Oncol, 2013, 25(6):637-645.

[34] Dong H, Zhu G, Tamada K, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion[J]. Nat Med, 1999, 5(12):1365-1369.

Using folic acid-modified polyethylenimine-SPIO nanoparticles for PD-L1 siRNA delivery to target gastric cancer

LUO Xin1, PENG Xia1, CHEN Guang-cheng1, HOU Jing-ying2, WU Shu-yun3, WANG Ling-yun1

(1DepartmentofGastroenterology，2DepartmentofEmergencyMedicine,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity，Guangzhou510120，China；3DepartmentofThoracicSurgery,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.E-mail:xzr020@aliyun.com)

AIM: To synthesis and characterize a multi-functional siRNA delivery agent with effective therapeutic effects and MR-tracing ability for programmed death ligand-1 (PD-L1) positive gastric cancer SGC-7901 cell line.METHODSThe characterization, binding ability, cytotoxicity, transfection efficiency and cellular internalization of the polyplex were determined. The PD-L1 knockdown effect was analyzed， and cytokines secreted by cocultured T cells were measured.RESULTSWe developed folic acid (FA)-PEG-SS-PEI-SPION as siRNA delivery agent for PD-L1 knockdown. AtN/Pratio of 10, the FA-PEG-SS-PEI-SPION bound PD-L1 siRNA to form polyplex in a diameter of (116.7±2.5) nm with zeta potential of (9.14±0.80) mV. Transfection efficiency of the targeted polyplex was (95.06±0.44)%, compared with (93.87±1.05)% of the untargeted polyplex. Mean fluorescence intensity of the targeted polyplex was 1 892.67±81.51, significantly higher than 1 324.33±186.58 of the untargeted. The cellular magnetic resonance (MR) imaging showed the polyplex also acted as T2weighted contrast agent for cancer MR imaging. The relative mRNA level of PD-L1 in polymer/siRNA-2 treatment group was (9.07±0.79)%. Decreased protein expression of PD-L1 was showed by Western blot. The secretion levels of IFN-γ and TNF-α in cocultured T cells increased， while that of IL-10 decreased.CONCLUSIONOur findings highlighted the potential of the multifunctional theranostic nanoparticles for effective targeting PD-L1 knockdown therapy and MR imaging diagnosis in gastric cancers.

Programmed death ligand-1; Gastric cancer; Folic acid; Magnetic resonance imaging; siRNA

1000- 4718(2017)12- 2179- 09

2017- 03- 03

2017- 04- 17

廣州市科技計劃項目(No. 201704020121)

△通訊作者 Tel: 020-81332489; E-mail: xzr020@aliyun.com

R730.23； R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.011

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)