蒙藥藍刺頭對骨折愈合影響的實驗研究△

巴音額古樂 金鴻賓

(1.內蒙古國際蒙醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010065；2.天津醫院，天津 300211)

蒙藥藍刺頭對骨折愈合影響的實驗研究△

巴音額古樂1金鴻賓2

(1.內蒙古國際蒙醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010065；2.天津醫院，天津 300211)

目的：觀察蒙藥藍刺頭對骨折愈合的影響作用。方法選用健康成年日本大耳白兔75只，制作雙側橈骨中段骨折模型。實驗隨機分為模型組，陽性對照骨碎補組(0.3g·kg-1)，蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組(3g·kg-1、1.5 g·kg-1、0.3g·kg-1)，藥物摻入飼料，于造模后d1連續給藥8wk。分別于骨折后第 2、4、8wk時處死，并處死前取股動脈血，觀察蒙藥藍刺頭對骨折區域骨組織形態和血清相關骨代謝指標的影響。結果血清I型前膠原N末端前肽(PINP)、I型膠原C末端肽(CTX-1)檢測顯示，相同時間點內除PINP各組中的蒙藥藍刺頭中劑量組和骨碎補組無差異外，其余各組均有顯著差異(P<0.001)；不同時間點的PIPN和CTX-1在各組間均存在顯著性差異(P<0.001)。X線片半定量評定，各組間比較顯示，蒙藥藍刺頭高劑量組在第2、4、8wk時與模型組、蒙藥藍刺頭低劑量組比較具有統計學意義 (P<0.05)；骨碎補組和蒙藥藍刺頭中劑量組在第2、4wk時與模型組比較具有統計學意義 (P<0.05)。進行骨折愈合組織學評價，各組間比較顯示，各期蒙藥藍刺頭高劑量組與模型組、蒙藥藍刺頭低劑量組比較均有顯著性差異(P<0.01)；蒙藥藍刺頭中劑量組、骨碎補組在第2、4、8wk時與模型組比較也具有顯著性差異(P<0.01)。結論蒙藥藍刺頭通過增高血清PINP濃度和降低CTX-1濃度，提高成骨細胞活性和成骨能力，促進骨折局部膜內成骨和軟骨內成骨速度，促進骨痂早期改建和塑形，加快骨折愈合，其作用存在量-效依賴性、給藥持續時間-效應關系。

蒙藥藍刺頭；骨折愈合；I型前膠原N末端前肽；I型膠原C末端肽；成骨細胞

蒙藥藍刺頭為常用接骨蒙藥，具有接骨愈傷、清熱止痛作用[1]；其味苦，性涼、稀、輕、柔、鈍。系菊科植物藍刺頭(Echinops lotifolis Tausch)的干燥頭狀花序，多年本草[2]。始載于《智慧之劍》中, 屬于蒙醫自采自用藥之一，近代蒙醫藥學文獻《認藥白晶鑒》中均以阿扎格-刺日敖恩作為烏日格蘇圖-呼和(藍刺頭)收載[3]。蒙醫在治療前臂骨折、骨不愈合、骨折較輕而筋傷較寬等情況時，慣用內服藍刺頭水煎劑，均有很好的治療效果。研究發現[4]，藍刺頭全草含黃酮類成分，花序中含量最高。劉巖等[5]研究了藍刺頭對去卵巢模型鼠骨鈣素(BGP)的影響，結果認為，蒙藥藍刺頭可能通過類雌激素樣作用抑制骨吸收，促進骨形成，調節骨吸收與骨形成。為了深入探討該藥促進骨折愈合的作用及機制，本實驗擬制作兔橈骨骨折模型，觀察蒙藥藍刺頭花序對骨折區域組織形態和血清骨代謝指標的影響，以其為蒙藥藍刺頭更廣泛的應用于臨床提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物：健康日本大耳白兔共75只，體重 2.0kg～2.5 kg，12wk齡，其中雌性38只，雄性37只，由天津市中西醫結合骨科研究所動物實驗室提供。動物模型建立、飼養和取材均在天津市中西醫結合骨科研究所動物實驗進行。

1.2 藥品和試劑：藍刺頭(花序)，河北保定安國藥材市場購買；骨碎補，天津中醫藥大學第一附屬醫院藥房購買；鹽酸賽拉嗪注射液(速眠新Ⅱ號)，吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司，批號070031582；兔I型膠原C末端肽(CTX)ELISA檢測試劑盒，上海西唐生物科技有限公司，批號1410151；兔I型前膠原N末端前肽(PINP)ELISA檢測試劑盒，上海西唐生物科技有限公司，批號1410153；蘇木素、伊紅，天津市永大化學試劑開發中心。

1.3 儀器：南韓牙科臺式鉆N3/E102N3，佛山市多易美醫療器材有限公司；高速萬能粉碎機YJ-1000A，濟南億健醫療設備有限公司；切片機RM2255 ，德國 LEICA 公司；自動雙重純水蒸餾器SZ-93，上海徐新生化儀器廠；制冰機AF200-PSC50R，日本 SANYO 公司；多功能顯微鏡CX41，日本 Olympus 公司； X 線機(CR)，意大利IAE 公司。

2 實驗方法

2.1 蒙藥藍刺頭制備：蒙藥藍刺頭原材料由內蒙古國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中提供，原材料為藍刺頭花序，共10kg。將其原材料在內蒙古醫科大學蒙醫藥學院蒙藥炮制中心用小型萬能粉碎機打磨成粉末狀(過80目篩為標準)，并封裝成袋，作為實驗藥品備用。

2.2 骨折模型建立：模型建立參照文獻[6]，將動物分籠適應性飼養2wk，手術當日將每只兔稱重后可用速眠新Ⅱ號(鹽酸塞拉嗪注射液)肌肉注射麻醉(肌注部位：臀肌處，肌注劑量：0.15mL·kg-1體重)，待麻醉后雙上肢常規脫毛，實施無菌手術，于雙側橈骨中1/3處縱行切開皮膚及皮下組織，暴露雙側橈骨中1/3部位，用口腔專用磨鉆造成3mm完全橫斷骨折，不作任何固定，生理鹽水沖洗切口，逐層縫合切口。術后分籠飼養，常規飼料及飲水。術后連續3d肌肉注射硫酸慶大霉素預防感染， 4萬U/次， 1次/d，每日觀察動物活動及創口愈合情況。

2.3 動物分組和給藥：將75 只日本大耳白兔，隨機數字表法分為5組：模型組，蒙藥高、中、低劑量組和陽性對照骨碎補組，每組 15只。每組再隨機分成3個小組，分別為2 wk組、4 wk組、8 wk組，每組 5只，編號，分籠飼養。各組兔術后均常規飼養，給藥劑量按《人兔體表面積折算的等效劑量比值表》計算，術后d1開始給予飼料混合喂養不同劑量的蒙藥藍刺頭粉劑(高、中、低劑量組，依次為3g·kg-1、1.5g·kg-1、0.3g·kg-1，其低劑量組為臨床等效劑量，高、中、低劑量比例為10:5:1), 1次/d，骨碎補組以臨床等效劑量0.3g·kg-1灌胃, 1次/d，模型組灌胃等量蒸餾水日1次。

2.4 標本留取：分別于術后 2、4、8 wk時采用耳緣空氣栓塞法處死動物，在無菌條件下取出雙側尺橈骨，觀察骨折區域愈合情況拍攝 X 線片，沿骨折斷端為中心，缺損區邊緣7.5 mm處截骨(長約15～16mm)，投入中性甲醛溶液固定，HE染色。處死前分別留取股動脈血，進行高速低溫離心后吸取上清放入1.5mL離心管內，編號，-70℃保存，待血全部留取完畢后進行檢測。

2.5 觀察指標

2.5.1 血清骨代謝指標測定：取出-70℃血清樣本，待血清樣本完全溶解后放入低溫離心機以3000r/nin離心10min，抽取上層血清樣本，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，測定血清中PINP、CTX-1水平。

2.5.2 X線檢查：完整取下雙側尺橈骨，在放射科統一條件下(45kV、80mA、0.08s)拍攝 CR片，觀察各個時間段(2wk、4wk、8wk)橈骨骨折斷端愈合情況。根據骨痂形成情況及骨折線變化情況，參照Beck LS and Deguzman L評分系統[7]進行骨折愈合狀況半定量評定，如有異議，通過影像學專家會診最終達成一致意見為準。

2.5.3 組織形態學觀察:標本進行固定、切片、HE染色后，在光鏡(×40、×100)下觀察不同時間段(2wk、4wk、8wk)橈骨缺損修復的組織學改變。參照文獻[8]骨折愈合組織學評價標準，加以修改，并增加骨髓腔情況進行骨折愈合組織學評分，分為0～4分。

2.6 統計學方法：采用SPSS 13.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，各組的血清PINP、CTX-1檢測，X線評分及組織學評分結果采用均數±標準差(±s)表示，各組間比較采用F檢驗。檢驗水準為a=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 血清PINP、CTX-1水平測定：本次試驗中無兔死亡，均進行采樣和數據統計。術后第2wk至8wk時蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組和骨碎補組PINP均有上升趨勢，而CTX-1均有下降趨勢，唯有模型組的PINP第4wk后濃度逐漸下降趨勢。不同時間點的PIPN 、CTX-1在各自組間均存在顯著差異，均具有統計學意義(P<0.001)。相同時間點內除PINP、CTX-1各組中骨碎補組和中劑量組無差異外，其余各組均有顯著差異，具有統計學意義(P<0.001)。 PIPN、CTX-1在不同時間變化趨勢不同，其中：高劑量組，中劑量組和骨碎補組較為穩定，而蒙藥低劑量組，模型組PIPN、CTX-1隨時間變化幅度較大，觀察所有蒙藥劑量(低、中、高劑量)與PINP、CTX-1的濃度變化發現，PINP濃度與用藥劑量呈正比關系，CTX-1濃度與用藥劑量呈反比關系，結果見表1。

表1 血清PINP、CTX-I水平比較

注：與模型組比較，*P<0.001 ，與第2wk比較，#P<0.001，與第2、4wk比較，△P<0.001.

3.2 X線檢查：骨折后2 wk時模型組和蒙藥低劑量組骨痂顯影不明顯，骨折線較清晰，而蒙藥高、中劑量組和骨碎補組可見少量骨痂顯影，主要位于折線遠近端骨外膜下，骨折線略變模糊；第 4 wk時模型組和蒙藥低劑量組見骨痂少量顯影，骨折斷端開始變模糊，而蒙藥高、中劑量組和骨碎補組大部分標本均已完全形成骨性骨痂，有連續性骨痂通過骨折線，骨折線明顯模糊，且蒙藥高劑量組和骨碎補組顯著；第8 wk時各組均達臨床愈合標準，骨折線消失或顯著模糊。而蒙藥高劑量組骨折愈合塑形良好，髓腔已貫通，蒙藥中劑量組和骨碎補組欠佳。通過參照X線片Beck LS and Deguzman L評分系統進行骨折愈合狀況半定量評定，各組間比較顯示：2wk時蒙藥高劑量組與模型組和蒙藥低劑量組比較有顯著性差異(P<0.01)；蒙藥低劑量組與模型組差別有統計學意義(P<0.05)；骨碎補組與模型組、蒙藥低劑量組差別有統計學意義(P<0.05)。4wk時蒙藥高劑量組與模型組和蒙藥中、低劑量組差別有統計學意義(P<0.05)；骨碎補組與模型組和蒙藥中、低劑量組比較具有統計學意義(P<0.05)。8wk時蒙藥高劑量組與模型組和蒙藥低劑量組比較具有統計學意義(P<0.05)；骨碎補組與模型組比較具有統計學意義(P<0.05)，結果見表2、圖1。

表2 各組各期X線片Beck LS and Deguzman L評分系統半定量比較

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.05，☆P<0.01；與中劑量比較，P<0.05.

3.3 組織學觀察：蒙藥藍刺頭高、中劑量組和骨碎補組骨折愈合情況明顯好于模型組和蒙藥藍刺頭低劑量組，而蒙藥高劑量組骨折愈合情況最為顯著。參照文獻進行骨折愈合組織學評價，各組間比較顯示，各期蒙藥藍刺頭高劑量組與模型組和蒙藥藍刺頭低劑量組比較均有顯著性差異(P<0.01)；蒙藥藍刺頭中劑量組和骨碎補組在第2、4、8wk時與模型組比較也具有顯著性差異(P<0.01)，結果見表3 、圖2。

表3 各組各期骨折愈合組織學評分

注：與模型組比較*P<0.01，與低劑量組比較#P<0.01；△P<0.05；與中劑量比較，☆P<0.05；與骨碎補組比較，P<0.05.

4 討論

骨折愈合是極其復雜修復的過程，是骨組織再生和重建的過程，從組織形態學和細胞學的變化，將骨折愈合過程大體可分為3個階段[9]，即血腫機化期(早期)、骨痂形成期(中期)、骨板形成-塑型期(后期)。但三者之間不可截然分開的，而是相互交織逐漸演進的過程。

本實驗中觀察到，在骨折愈合早期(2wk時)蒙藥藍刺頭高、中劑量組和骨碎補組骨折斷端已被纖維組織包裹，骨折線兩端的內、外骨膜下均可見明顯的骨小梁形成，并呈逐漸向骨折斷端中心延伸的趨勢，外圍可見大量軟骨細胞形成，呈軟骨島狀改變。骨折愈合中期(4 wk時)各組軟骨內成骨和膜內成骨較活躍，骨小梁大量形成，并穿插排列進一步增多增粗，連接于骨折斷端，其間可見大量的纖維骨痂、軟骨細胞、炎性細胞及毛細血管明顯減少；模型組、蒙藥低劑量組大部分標本骨折斷端間仍為纖維性組織連接，骨折wk圍骨小梁纖細、稀疏，骨痂體積較小，而蒙藥藍刺頭高、中劑量組和骨碎補組大部分標本骨折斷端為骨小梁相連接，骨折wk圍骨小梁密度相對較高，骨痂體積較大。骨折愈合后期(8wk時)，蒙藥藍刺頭高、中劑量組和骨碎補組骨折斷端間骨小梁轉變為板層骨，外圍骨小梁出現較多吸收腔隙，髓腔再通，而蒙藥藍刺頭高劑量組大部分標本髓腔再通，模型組、蒙藥低劑量組骨折斷端間仍可見大量骨小梁有序排列，逐漸向板層狀骨過渡，標本髓腔未全再通。提示蒙藥藍刺頭能夠促進骨折局部膜內成骨和軟骨內成骨速度，促進骨痂早期改建和塑形，具有促進骨折愈合作用。

Ⅰ型前膠原氨基端前肽(PINP)和Ⅰ型前膠原羧基端前肽(PICP)是成骨細胞合成并釋放出前膠原纖維的細胞外分解產物，二者在血清中的含量反映了成骨細胞合成骨膠原的能力，可以被認為是監測成骨細胞活性和成骨能力的特異性生化指標。PINP的解離和Ⅰ型膠原的合成比例為 1:1，故 PINP 可反映成骨細胞的活性和骨形成速率，升高提示Ⅰ型膠原的合成速率加快，骨轉換活躍[10]。血液中的 PINP、PICP 等由腎臟和肝臟分解去除，Ⅰ型膠原不溶于水，可通過檢測Ⅰ型膠原代謝產物來檢測Ⅰ型膠原的代謝狀況。目前PINP的檢測廣泛的應用到藥物干預治療骨折及骨代謝疾病的療效的評估和惡性腫瘤骨轉移疾病的檢測中，尤其在藥物干預治療過程中動態觀察與監測具有較高的臨床價值。Ⅰ型膠原 C 端肽(CTX-1)也是Ⅰ型膠原諸多降價產物中的一種，于 1994 年Bonde等[11]建立 CTX-1 的檢測法，在骨基質的不斷重建中，Ⅰ型膠原被不斷的分解為 CTX-1，并被釋放入血，通過測定血中 CTX 的含量就能夠反映出骨基質的吸收狀態，既能夠對某些代謝性骨病進行早期診斷，又能夠對抗骨吸收藥物進行藥效評價。CTX-1作為骨吸收的特異性指標，已經廣泛的應用到小兒佝僂病、骨質疏松癥、惡性腫瘤骨轉移、骨折愈合的檢測中。本次實驗通過測定促進骨形成和骨吸收指標PINP、CTX-1結果表明，蒙藥藍刺頭能夠增高血清PINP含量、降低CTX-1含量，其作用存在量-效依賴性、給藥持續時間-效應關系，提示其可能提高成骨細胞活性和成骨能力，并促進骨生長的同時也抑制骨吸收發揮重要作用。

綜上所述，蒙藥藍刺頭可能通過提高血清PINP濃度和降低CTX-1濃度，提高成骨細胞活性和成骨能力，促進骨折局部膜內成骨和軟骨內成骨速度，促進骨痂早期改建和塑形而加快骨折愈合。但蒙藥藍刺頭促進骨折愈合相關物質基礎還需要進一步深入研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準·蒙藥分冊[S].1998.

[2]內蒙古衛生廳.內蒙古蒙藥材標準[S].1987.

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[5]劉巖,鞠亞波,常虹.蒙藥藍刺頭對去卵巢模鼠骨鈣素影響的實驗研究[J].內蒙古醫科大學學報,2014,S1:7-11.

[6]廖保強,鄧墨淵,傅亞,等. 力生長因子對兔橈骨骨折愈合的作用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2010,02:245-248.

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內蒙古自然科學基金( 2015MS08131)

R291.2

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1006-6810(2017)05-0064-04

2017年1月9日收稿