長鏈非編碼RNAPVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

趙東孫 虎龔杰 石曉勇 陳鐘樑 陳亮 劉偉 賢湯 朱驍麻 江春 聶德康

長鏈非編碼RNAPVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義

趙東孫 虎龔杰 石曉勇 陳鐘樑 陳亮 劉偉 賢湯 朱驍麻 江春 聶德康

目的探討長鏈非編碼RNA（LncRNA）漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1）在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義。方法采用qRT-PCR方法檢測并比較53例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織（觀察組）及6例正常腦組織（對照組）中LncRNA PVT1的表達(dá)量。根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA PVT1的中位表達(dá)量分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，分析LncRNA PVT1表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法繪制不同LncRNA PVT1表達(dá)量的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存曲線，并分析LncRNA PVT1表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果觀察組LncRNA PVT1的表達(dá)量明顯高于對照組（P＜0.01)。其中高級別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ～Ⅳ級）的LncRNA PVT1表達(dá)量明顯高于低級別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ～Ⅱ級）（P＜0.01）。LncRNA PVT1表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級密切相關(guān)（P＜0.01），與患者年齡、性別、Karnofsky功能狀態(tài)評分（KPS）評分、腫瘤大小等均無關(guān)（均P＞0.05）。經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，高表達(dá)組患者預(yù)后較低表達(dá)組差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論LncRNA PVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級及患者預(yù)后密切相關(guān)；LncRNA PVT1可能成為判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的新型分子標(biāo)記物。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤長鏈非編碼RNA漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1預(yù)后

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的40%～60%[1]。盡管外科手術(shù)、放療、化療等治療技術(shù)不斷提高，但神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的中位生存期仍然只有9～12個月[2]。因此，尋找一種新的膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)標(biāo)記物，對于確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、設(shè)計(jì)合理的個體化治療藥物、判斷預(yù)后等均有重要意義。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種長度超過200nt的核苷酸分子。Han等[3]2012年首次用基因芯片證實(shí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的LncRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨后關(guān)于LncRNA與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)系開始引起學(xué)者們的注意。Zhang等[4]研究表明，LncRNA與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及分化有著密切聯(lián)系。Maher等[5]研究認(rèn)為LncRNA表達(dá)異常是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。漿細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)化遷移基因1（PVT1）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物屬于基因間的LncRNA，這個基因位點(diǎn)由Webb等[6]1984年首次在小鼠中發(fā)現(xiàn)。已有研究相繼證實(shí)LncRNA PVT1與肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌關(guān)系密切；但其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關(guān)性未見報(bào)道。因此，筆者擬通過檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中IncRNA PVT1的表達(dá)量，分析其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級、臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來源選擇2012年2月至2015年10月在鹽城市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科治療的53例不同級別膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織標(biāo)本為觀察組，所有患者術(shù)前均未接受過放化療，且病例資料完整。其中男29例，女24例；年齡27～68（52.7±6.4）歲。根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級）18例，高級別膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）35例。另選擇2015年1至10月在浙江醫(yī)院神經(jīng)外科行外傷手術(shù)的6例腦外傷患者顱內(nèi)減壓組織標(biāo)本為對照組，其中男4例，女2例；年齡25～49（38.3±7.1）歲。兩組患者均采取手術(shù)治療，均經(jīng)病理檢查明確診斷。組織標(biāo)本在手術(shù)切除離體后立即置入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)入-80℃條件下低溫保存。所有患者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成提供，TRIZOL試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime ScriptTMRT-PCR kit）購自大連Takara公司，Roche熒光定量試劑盒Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）購自上海浩然生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄使用Trizol試劑提取53例神經(jīng)膠質(zhì)瘤、6例正常腦組織中的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明步驟，將1μg總RNA放在20μl反應(yīng)溶液中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將cDNA凍存于-80℃冰箱備用。

1.3.2 LncRNA PVT1表達(dá)的檢測采用qRT-PCR檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤、正常腦組織中LncRNA PVT1的表達(dá)量。PVT1上游引物：5′-TGAGAACTGTCCTTACGTGACC-3；下游引物5′-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3′。GAPDH上游引物：5′-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′；下游引物：5′-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3′。按照qRT-PCR試劑盒說明書，以20μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，陰性對照用1ml DEPC超純水代替cDNA模板。反應(yīng)條件及步驟：預(yù)變性95℃30s；熱循環(huán)95℃5s，60℃30s；40個循環(huán)。溶解曲線：95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個樣本重復(fù)3次。qRT-PCR結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取每個實(shí)驗(yàn)Ct值的均值，以此均值計(jì)算ΔCt、-ΔΔCt、2-ΔΔCt。ΔCt=C（t待測基因）-Ct（內(nèi)參基因）；ΔΔCt=ΔCt（待測樣本）-ΔCt（校準(zhǔn)樣本）；2-ΔΔCt代表待測樣本基因表達(dá)量相對于校準(zhǔn)樣本基因表達(dá)量的倍數(shù)。使用2-ΔΔCt值來表示PVT1在腫瘤組織、正常腦組織中的表達(dá)倍數(shù)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中LncRNA PVT1的表達(dá)量以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA PVT1表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系分析采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制不同LncRNA PVT1表達(dá)量的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)分析LncRNA PVT1表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者LncRNA PVT1的表達(dá)量比較qRT-PCR結(jié)果顯示，觀察組LncRNA PVT1的表達(dá)量為15.180±0.6336，明顯高于對照組的4.776±0.8189（P＜0.01）。其中高級別膠質(zhì)瘤的LncRNA PVT1表達(dá)量為17.430±0.6368，明顯高于低級別膠質(zhì)瘤的10.790±0.5724（P＜0.01），見圖1。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中LncRNA PVT1的相對表達(dá)量

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA PVT1表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA PVT1的中位表達(dá)量分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，結(jié)果提示LncRNA PVT1表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級密切相關(guān)（P＜0.01），與患者年齡、性別、Karnofsky功能狀態(tài)評分（KPS）評分、腫瘤大小等均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中PVT1 RNA表達(dá)量與臨床病理因素的關(guān)系[例（%）]

2.3 LncRNA PVT1表達(dá)量對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間的影響不同LncRNA PVT1表達(dá)量的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者Kaplan-Meier生存曲線，見圖2。經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，高表達(dá)組患者預(yù)后較低表達(dá)組差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 不同LncRNA PVT1表達(dá)量神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。有研究證實(shí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤存在腫瘤相關(guān)基因異質(zhì)性、腫瘤易感性[7-8]。Wapinski等[9]研究證實(shí)神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由1個多基因介導(dǎo)的相關(guān)疾病，是保持正常細(xì)胞穩(wěn)定、分化和增殖的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)異常引起的結(jié)果。Wrensch等[10]認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。LncRNA曾被認(rèn)為是沒有功能的轉(zhuǎn)錄“噪音”[11-12]，但近年來研究表明LncRNA在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮著重要作用，包括DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄干擾等[13]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)研究中，關(guān)于LncRNA的相關(guān)作用目前取得了一定的進(jìn)展，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者LncRNA hox轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）表達(dá)增高提示預(yù)后較差，且與神經(jīng)膠質(zhì)瘤級別的高低呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性[14]。Gupta等[15]進(jìn)一步研究證實(shí)，LncRNA HOTAIR-因作用于其靶基因PCR2，最終促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織的生長。Qin等[16]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LncRNA TSLCA-AS1表達(dá)明顯降低，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長受到抑制，機(jī)制可能與位點(diǎn)基因的甲基化有關(guān)。

隨著高通量技術(shù)在基因表達(dá)中的應(yīng)用，Gerstein等[17]發(fā)現(xiàn)PVT1基因位于染色體8q24區(qū)正義鏈上。在腫瘤細(xì)胞中，染色體8q24區(qū)也是DNA復(fù)制拷貝擴(kuò)增的最高靶點(diǎn)，其異常擴(kuò)增往往預(yù)示著腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。如在乳腺癌、轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，因染色體8q24區(qū)含有的多個不同核苷酸的短序列位點(diǎn)，其拷貝數(shù)的變異往往與前列腺癌、結(jié)腸癌等相關(guān)[18-20]。此外，在染色體8q24區(qū)還包含有多種與眾多疾病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，如非綜合性唇腭裂、終末期的2型糖尿病性腎病等[21-22]。LncRNA PVT1因其結(jié)構(gòu)及位置的特殊性，其異常表達(dá)往往與腫瘤的形成密切相關(guān)。近年來研究表明在多種腫瘤組織（如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等）或細(xì)胞系中LncRNA PVT1呈高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受性。但LncRNA PVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過qRT-PCR檢測LncRNA PVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA PVT1的表達(dá)量明顯高于正常腦組織。結(jié)合臨床病理因素分析，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中LncRNA PVT1的表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級密切相關(guān)，與患者年齡、性別、KPS評分、腫瘤大小等無關(guān)。因此，筆者推測LncRNA PVT1可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后存在一定的相關(guān)性。為了證實(shí)以上推測，本研究采用Kaplan-Merier法繪制不同LncRNA PVT1表達(dá)量神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的生存曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)分析LncRNA PVT1表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1高表達(dá)組神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后較低表達(dá)組差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究證實(shí)LncRNA PVT1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，表達(dá)量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤WHO分級及患者預(yù)后密切相關(guān)；推測LncRNA PVT1可能成為判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)后的新型分子標(biāo)記物。

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Expression of long non-coding RNA PVT1 in brain glioma and its clinical significance

ZHAO Dong,SUN Hu,GONG Jie,et al.
Department of Neurology,Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

Objective To investigate the expression of long-coding RNA(lncRNA)of plasmacytoma variant translocation gene 1(PVT1)in glioma and its clinical significance.MethodsqRT-PCR was applied to detect the expression of lncRNA PVT1 in 53 specimens of glioma(glioma group)and 6 specimens of normal brain tissues(control group).The survival curves were generated with Kaplan-Meier method.The correlation between the expression of lncRNA PVT1 and clinicopathological features,prognosis of patients was analyzed.Results The expression of lncRNA PVT1 was significantly up-regulated in glioma group compared with that the control group(P＜0.01).The expression of lncRNA PVT1 in high-grade neuroglioma(WHO III-IVgrade)was significantly higher than that in low-grade neuroglioma(WHO I-II grade)(P＜0.01).The expression of lncRNA PVT1 was significantly associated with the WHO grading of glioma(P＜0.01),but not with age,gender,Karnofsky Performance Status(KPS)score and tumor size(All P＞0.05).Log-rank test revealed that patients with high expression of lnc RNA PVT1 was significantly associated with worse prognosis compared with those with low expression(P＜0.01).ConclusionLnc RNA PVT1 is up-regulated in neuroglioma tissues.The expression of lncRNA PVT1 is closely associated with WHO grading system and prognosis of patients,indicating that lnc RNA PVT1 may serve as a novel molecular biomarker for determination of the malignant degree and prognosis of neuroglioma.

GliomaLong non-coding RNAPVT1 Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-1489

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016ZQ004）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃科研基金項(xiàng)目（2017KY179）

310013杭州，浙江醫(yī)院神經(jīng)外科（趙東、孫虎、龔杰、石曉勇、陳鐘樑、陳亮、劉偉賢、湯朱驍、麻江春）；鹽城市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（聶德康）

聶德康，E-mail：famndk@163.com

2017-06-24）

（本文編輯：陳丹）