同型半胱氨酸對C17.2小鼠神經干細胞的影響及作用機制

王丹 阮妙華 周愛華 錢燕 陳亦明

●論著

同型半胱氨酸對C17.2小鼠神經干細胞的影響及作用機制

王丹 阮妙華 周愛華 錢燕 陳亦明

目的探討同型半胱氨酸（Hcy）對C17.2小鼠神經干細胞（NSCs）的影響及可能的分子機制。方法培養C17.2小鼠NSCs，分為對照組、0.25mM Hcy組、0.25mM Hcy+5mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）組；加入相應藥物培養24h后，采用CCK-8法檢測各組NSCs生長活力，流式細胞術和Caspase-3法檢測Hcy對NSCs凋亡的影響，彗星實驗檢測Hcy對NSCs DNA的損傷程度，H2DCF-DA染色檢測NSCs的氧自由基（ROS）水平。結果Hcy能誘導細胞ROS產生和DNA損傷，從而導致NSCs凋亡增加。相反，NAC可降低Hcy誘發的ROS產生，明顯改善DNA損傷，提高細胞存活率。結論Hcy能誘導NSCs ROS產生和DNA損傷，并導致NSCs凋亡；而減少Hcy引發的ROS產生可以明顯改善DNA損傷并提高細胞存活率。

同型半胱氨酸DNA損傷氧化應激神經干細胞

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種蛋氨酸代謝過程中產生的非蛋白氨基酸，在兒童和成人神經系統疾病的發生、發展中起著重要作用[1-2]。有研究表明母體血漿中的高Hcy水平與胎兒神經管畸形有關[1]。相關流行病學調查發現血漿Hcy水平與神經退行性疾病（如認知障礙、阿爾茨海默病和中風等）相關[2]。體外實驗和小鼠實驗發現Hcy對人和鼠神經元細胞有毒害作用[3]。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）能夠分化成神經元細胞、少突神經膠質細胞和星形膠質細胞，在胚胎神經發生和成人大腦的損傷修復中起著至關重要的作用。相關研究表明NSCs對細胞外Hcy非常敏感，Hcy能抑制NSCs的增殖和分化能力[4-5]，但其具體作用機制尚不清楚。本研究檢測并觀察經Hcy處理后C17.2小鼠NSCs的氧自由基（ROS）水平和DNA損傷程度，以探討Hcy對NSCs的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑C17.2小鼠NSCs購自英國歐洲動物細胞培養物保藏中心；Dullbecco改良的Eagle培養基購自美國Gibco公司；D，L-Hcy、N-乙酰半胱氨酸（NAC）購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本株式會社同仁化學研究所；Annexin V/PI細胞凋亡試劑盒購自美國B.D.Biosciences Pharmingen公司；Caspase-3試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司；彗星測定試劑盒購自美國Trevigen公司；H2DCF-DA試劑盒購自美國Fluka公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組將C17.2小鼠NSCs置于含10%FBS、5%馬血清、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Dullbecco改良的Eagle培養基中，在37°C、5%CO2、相對濕度95%的培養箱中培養24h。然后將C17.2小鼠NSCs分為3組，分別為對照組、0.25mM Hcy組和0.25mM Hcy＋5mM NAC組（后兩組稱為實驗組），上述藥物用雙蒸水稀釋至工作濃度后加入培養基中作用24h。

1.2.2 NSCs生長活力的檢測采用CCK-8法。將C17.2小鼠NSCs以4 000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加Eagle培養基，平行6孔為復孔，培養24h后分成以上3組，置于培養箱中。接種1、2、3d后，每孔依次加入CCK-8試劑10μl，置37°C、5%CO2培養箱中孵育2h，并設不加NSCs的空白組；在450nm波長處檢測吸光度（OD值）。取每天6孔平均值繪制細胞生長曲線。細胞生長活力用細胞存活率進行評估，細胞存活率=（OD值實驗組-OD值空白組）/（OD值對照組-OD值空白組）×100%。

1.2.3 Hcy對NSCs凋亡影響的檢測采用流式細胞術和Caspase-3法。（1）流式細胞術：C17.2小鼠NSCs經Hcy或Hcy＋NAC處理24h后，用胰酶消化并收集各組細胞，再以1×106個/ml的濃度將細胞重懸于1×緩沖液（0.01M 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0.14M NaCl，2.5mM CaCl2，pH7.4）中，5μl Annexin-V和5μl propidium iodide（PI）室溫避光孵育15min后，再加入400μl緩沖液，使用Accurri C6流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，Annexin-V和/或PI染色陽性細胞均為凋亡細胞，Annexin-V和PI染色陰性細胞為正常細胞，檢測結果應用FlowJo 7.6.2軟件進行分析。凋亡細胞百分比=[凋亡細胞/（凋亡細胞＋正常細胞）]×100%。（2）Caspase-3法：使用冷PBS洗滌并收集各組C17.2小鼠NSCs；隨后加入細胞裂解液，將細胞裂解物稀釋至約3mg/ml；再按照Caspase-3試劑盒說明書進行處理。使用VeritasTM發光檢測儀在380、460nm波長下檢測每個樣品的熒光值。將對照組的熒光值設定為1，其他組的熒光值均為對照組的相對值，即相對Caspase-3活性。

1.2.4 Hcy對NSCs DNA損傷程度的檢測采用彗星實驗。將各組C17.2小鼠NSCs包埋在鋪于載玻片上1%的低熔點瓊脂糖凝膠中，再在4°C下用裂解液裂解過夜。DNA在室溫、堿性條件下解鏈20min，然后在300mA、堿性條件下電泳30min。將載玻片用雙蒸水漂洗5min×2次，75%乙醇中脫水5min，再用SYBR Green溶液染色30min，最后在Leica DMI 4 000B熒光顯微鏡下觀察（激發波長425～500nm）。在400倍鏡下隨機選取50個細胞并拍攝照片用于評估DNA損傷程度。鏡下表現：（1）未損傷DNA保持球形；（2）受損DNA則產生拖尾，類似“彗星”；損傷愈重，拖尾愈長。采用彗星陽性細胞百分比和Olive尾矩（OTM）評估DNA損傷程度。使用CPAP1.2.3軟件進行圖像分析并得出OTM值。OTM值=尾部DNA%×頭部中心到尾部中心的距離。

1.2.5 NSCs ROS水平的檢測采用H2DCF-DA染色法。C17.2小鼠NSCs經Hcy或Hcy＋NAC分別處理1、2、3d后，加入10μmol/L的H2DCF-DA溶液，于37°C孵育30min，PBS漂洗2次后收集細胞。在熒光顯微鏡下觀察并測定熒光強度，激發波長480nm，發射波長525nm。將對照組的熒光值設定為1，其他組的熒光值均為對照組的相對值，即ROS水平。

1.3 統計學處理應用SPSS 19.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hcy對C17.2小鼠NSCs生長活力的影響CCK8法檢測結果顯示，經Hcy處理1、2、3d后，C17.2小鼠NSCs活力較對照組分別降低28.34%、38.28%和43.85%（均P＜0.05），呈時間依賴性；經Hcy＋NAC處理1、2、3d后，C17.2小鼠NSCs活力較Hcy組均明顯增加（均P＜0.05），見圖1。

圖1 3組C17.2小鼠NSCs經處理1、2、3d后的OD值（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05）

2.2 Hcy對C17.2小鼠NSCs凋亡的影響經流式細胞儀檢測發現，Hcy組凋亡細胞百分比為（43.90±8.00）%，明顯高于對照組的（16.43±2.68）%（P＜0.01）；Hcy+NAC組凋亡細胞百分比為（25.11±3.02）%，較Hcy組明顯減少（P＜0.05），見圖2a-b。經Caspase-3法測定，Hcy組Caspase-3活性較對照組增加2.12倍（P＜0.01）；Hcy+NAC組較Hcy組降低34.92%（P＜0.01），見圖2c。

圖2 3組C17.2小鼠NSCs的凋亡情況比較（a-b：流式細胞儀檢測結果；c：Caspase-3活性；與對照組比較，*P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

2.3 Hcy對C17.2小鼠NSCs DNA損傷的影響彗星實驗結果顯示，對照組中僅檢測到少量彗星陽性細胞，為10.05%；與對照組比較，Hcy組彗星陽性細胞和OTM值均明顯上升（均P＜0.01）；與Hcy組比較，Hcy+NAC組彗星陽性細胞和OTM值分別降低43.14%、46.33%（均P＜0.05），見圖3。說明Hcy誘導C17.2細胞DNA損傷，而NAC能緩解Hcy造成的DNA損傷。

2.4 Hcy對C17.2小鼠NSCs ROS的影響與對照組比較，經Hcy處理1、2、3d后C17.2小鼠NSCs內ROS產生分別增加了1.1、1.7、2.9倍（均P＜0.05），呈時間依賴性；與Hcy組比較，經Hcy+NAC處理1、2、3d后C17.2小鼠NSCs內ROS產生均明顯減少（均P＜0.05），見圖4。

3 討論

Hcy是必需氨基酸甲硫氨酸的代謝產物，具有神經毒性。流行病學研究結果顯示，在阿爾茨海默病、血管性癡呆、中風和認知障礙等成年神經疾病的患者中，Hcy水平明顯升高[2]。母體血漿Hcy水平的升高與胎兒神經管畸形有關，雞胚模型證實了過量Hcy能誘導神經管畸形[1，6]。相關實驗表明Hcy能誘導NSCs凋亡[4-5]。但目前關于Hcy影響NSCs的分子機制尚未完全清楚。本研究經體外實驗證實Hcy能增加C17.2小鼠NSCs ROS的產生，從而誘導細胞DNA損傷，導致NSCs凋亡增加。NAC是一種常用的抗氧化劑，可以減少由Hcy誘導的ROS產生，改善DNA損傷并提高NSCs存活率。以上結果表明Hcy通過氧化應激引起DNA損傷，從而誘導NSCs凋亡。

本研究結果發現Hcy誘導C17.2小鼠NSCs DNA損傷，而NAC能緩解Hcy造成的細胞DNA損傷。在皮層和海馬神經元細胞研究中亦發現Hcy升高誘導DNA損傷和細胞凋亡[3，7]。Picerno等[8]發現人外周血淋巴細胞中加入Hcy培養后會導致DNA損傷和微核比例增加；Vanzin等[9]發現Hcy以濃度依賴性誘導白細胞DNA損傷，而使用吡哆醇、葉酸、甜菜堿或維生素B12降低Hcy水平后，白細胞DNA損傷明顯改善。

圖3 3組C17.2小鼠NSCs的DNA損傷情況比較（a：彗星實驗結果；b：彗星陽性細胞百分比；C：OTM值；與對照組比較，*P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

圖4 各組C17.2小鼠NSCs的ROS水平比較（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與Hcy組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01）

本研究還發現Hcy誘導C17.2小鼠NSCs ROS生成；而NAC可以通過減少ROS生成，改善DNA損傷和促進NSCs存活。既往研究也發現，Hcy通過產生ROS誘導人神經母細胞瘤細胞DNA損傷和細胞凋亡，而抗氧化劑NAC能抑制上述作用[10]。此外，在高同型半胱氨酸血癥患者的血漿中也發現脂質和蛋白質氧化損傷[11]。Zhao等[12]研究發現高Hcy水平損害神經元細胞的分子機制可能是氧化應激反應介導DNA損傷，從而導致細胞凋亡。另有研究發現，Hcy通過增加HL-60細胞內H2O2的生成，介導DNA損傷，誘發細胞凋亡[13]。羅丹紅等[14]研究發現高同型半胱氨酸血癥患者通過氧化應激途徑增加腦梗死發生率。而本研究結果表明Hcy可能通過氧化應激誘導NSCs的DNA損傷。

綜上所述，Hcy能誘導NSCs ROS產生和DNA損傷，并導致NSCs凋亡；而減少Hcy引發的ROS產生可以明顯改善DNA損傷并提高細胞存活率。因此，筆者認為Hcy可能通過氧化應激導致DNA損傷，從而促進NSCs凋亡；而抗氧化劑可以挽救部分由Hcy導致的NSCs損傷及凋亡，為與Hcy相關的神經系統疾病的治療提供了理論基礎。

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Effects of homocysteine on neural stem cells and its underlying mechanism

WANG Dan,RUAN Miaohua,ZHOU Aihua,et al.
Department of Neonatology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 32500,China

ObjectiveTo investigate the effects of homocysteine(Hcy)on C17.2 mouse neural stem cells(NSCs),and to explore its possible mechanism.MethodsC17.2 mouse NSCs were cultured and divided into blank control group,Hcy group and Hcy+N-acetylcysteine(NAC)group.The growth activity of NSCs was detected by CCK-8 method.The apoptosis of NSCs was assessed by flow cytometry analysis and caspase-3 method.Comet assay was used to evaluate the DNA damage of NSCs.The intracellular reactive oxidative species(ROS)level was detected by H2DCF-DA staining method.Results Hcyevoked ROS production and induced cell DNA damage,leading to an increase in NSCs apoptosis.On contrary,NAC decreased Hcy-evoked ROS production and significantly ameliorated DNA damage and improved NSCs survival.ConclusionHcy may play a negative role in NSCs survival via inducing DNA damage by oxidative stress.

Homocysteine DNA damage Oxidative stress Neural stemcell

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-1547

國家自然科學基金項目（81701485）；浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2017KY452）；溫州市科技局項目（2017Y0578）

325000溫州醫科大學附屬第一醫院新生兒科（王丹、阮妙華、周愛華、錢燕）；溫州醫科大學附屬第二醫院肝膽外科（陳亦明）

陳亦明，E-mail：chenyiming209@126.com

2017-07-02）

（本文編輯：陳丹）