一株三價砷氧化菌的分離鑒定及生長情況分析

潘靈鋒，李明蘭，潘繼承

(湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

一株三價砷氧化菌的分離鑒定及生長情況分析

潘靈鋒，李明蘭，潘繼承

(湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002)

砷及其化合物是常見的環(huán)境污染物，地殼中的砷豐度約為1.8 ppm，巖石和土壤中砷的含量從小于1 ppm至幾百ppm，砷在自然界廣泛的存在性導(dǎo)致了砷污染的不可避免。微生物砷氧化有兩點重要意義：一是As (Ⅲ) 的毒性大大強于As(Ⅴ)，因此通過氧化反應(yīng)可以降低環(huán)境中的砷污染毒性，同時三價砷氧化菌通過砷氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的能量能夠完成自身的代謝和生長。從黃石某冶煉廠取得的土樣及水樣中分離出耐受砷菌株，對單菌落進(jìn)行三價砷氧化能力鑒定，獲得一株菌株，其能在培養(yǎng)基環(huán)境中將As (Ⅲ) 氧化為As (Ⅴ)，且其氧化率接近100%，將其命名為11號菌株。根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果分析表明，11號菌株屬于假單胞菌屬。分析11號菌株對As(Ⅲ)和Cu2+濃度的耐受性結(jié)果表明，As (Ⅲ) 和Cu2+對11號菌株生長的抑制作用呈濃度正相關(guān)。

三價砷；三價砷氧化菌；生長曲線

0 前言

砷又稱砒，屬于類金屬，即一種兩性元素，同時具有金屬性和非金屬性。砷的毒性和某些性質(zhì)與重金屬相似，且在自然環(huán)境中常與各種重金屬離子共存，形成復(fù)合污染，即其來源和危害與重金屬相似，因此，砷常常又被列為重金屬來研究。是一種分布廣泛，有毒并且危害人類健康的化學(xué)元素，皮膚接觸低劑量的砷即可能致癌或致命。過量的砷對環(huán)境和人體都有嚴(yán)重的危害作用，我國已經(jīng)將砷及其化合物列為“水中優(yōu)先控制污染物黑名單”。

在2011年國務(wù)院批文的《重金屬污染防治十二五規(guī)劃》中將砷(As)污染列為工作重點之一，是重點污染物?！吨亟饘傥廴痉乐问逡?guī)劃》指出由于重金屬污染持續(xù)時間長，治理技術(shù)落后，監(jiān)督管理薄弱，重金屬的不可降解性使部分地區(qū)的水體底泥，場地和土壤污染物不斷積累，潛在事故風(fēng)險高，對群眾健康造成嚴(yán)重威脅。 由于砷不能被降解的性質(zhì),將砷轉(zhuǎn)移到安全的地方或者把高毒性的砷轉(zhuǎn)化為低毒性的砷，甚至轉(zhuǎn)化為低水溶性或不溶于水的礦化物質(zhì)成為砷污染治理的方向。目前的處理方法有離子交換法、共沉淀、反滲透、吸附法和生物法五類處理方法。但是離子交換法費用高、共沉淀會產(chǎn)生砷廢渣、反滲透在實際應(yīng)用中并不廣泛、而生物法個體微小，多為單個個體或個體結(jié)構(gòu)簡單的多細(xì)胞體作為土壤中重要的活性膠體組分，微生物比表面積大，易于繁殖，分布范圍廣，具有積累作用另外，微生物可作為電子傳遞體或受體氧化，還能分泌相關(guān)生物酶來氧化或甲基化As(Ⅲ)，因此，微生物技術(shù)在砷污染治理過程中，也占據(jù)很重要的地位，是最具發(fā)展?jié)摿Φ姆椒╗2，3]。

1 材料與方法

1.1 砷耐受菌株的篩選

本研究從黃石某冶煉廠取得的土樣及水樣篩選砷耐受菌株。 配制土壤懸液： 稱取5g 土樣或10 mL水樣，溶于200mL蒸餾水中，于37 ℃，180rpm恒溫?fù)u床振蕩30min。取滅完菌含15%瓊脂的TSB(胰蛋白胨大豆)培養(yǎng)基加入經(jīng)細(xì)菌過濾器處理砷酸鈉或亞砷酸鈉(終濃度分別為35mM和55mM)，倒平板，待平板凝固后在每個平板中均勻涂布100uL樣品稀釋液(將樣品稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6)放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑單菌落稀釋劃線純化菌種。

1.2 菌株砷氧化能力的鑒定

砷離子與銀離子發(fā)生反應(yīng)，As(Ⅲ)產(chǎn)生亞砷酸銀呈淡黃色，As(Ⅴ)產(chǎn)生砷酸銀呈紅棕色，且溶液中兩種價態(tài)砷含量的不同與銀離子反應(yīng)亦有不同顏色產(chǎn)物。且顏色變化呈梯度變化。因此根據(jù)菌株在含As(Ⅲ)培養(yǎng)基中生長過后與AgNO3反應(yīng)的顏色與As (Ⅴ)/ As (Ⅲ)梯度混合溶液與AgNO3反應(yīng)后產(chǎn)物顏色相對比即可獲得該菌株大致氧化As(Ⅲ)能力[4]。取砷耐受菌株，置于終濃度0.1 M的含As (Ⅲ)TSB培養(yǎng)基中，于28℃，180rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。配置As(Ⅴ)/ As (Ⅲ)梯度混合TSB培養(yǎng)基溶液分別為As (Ⅴ)/ As (Ⅲ) 100/0；90/10；80/20；70/30；60/40；50/50；40/60；30/70；20/80；10/90；0/100置于28 ℃，180rpm恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。培養(yǎng)12h及24h后分別取1mL培養(yǎng)液10000rpm離心5min，取100μL培養(yǎng)液上清加入等體積0.1M AgNO3溶液，觀察并對比實驗組與As(Ⅴ)/ As(Ⅲ)梯度組產(chǎn)物顏色。

1.3 16S rRNA基因測序鑒定砷氧化菌株

1.3.1 制備擴(kuò)增模板 將細(xì)菌液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取1mL菌液離心，棄上清；向離心管中加入50L無菌水重懸菌體；將離心管至于沸水中煮沸5～10min，10000rpm離心2min;取2L上清液作為PCR模板。

1.3.2 PCR擴(kuò)增： 以砷氧化菌DNA為模板，根據(jù)16SrRNA通用擴(kuò)增引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

擴(kuò)增體系(50 L)：

10×PCR buffer(+MgCl2) 5.0L

細(xì)菌總DNA 2.0L

27F(10M) 1.0L

1492R(10M) 1.0L

dNTP(10mM each) 1.0L

Taq酶(10U/L) 0.25L

ddH2O 補至50L

按以下條件擴(kuò)增：94℃預(yù)變性6min，94℃ 60s，53℃ 50s，72℃ 60s共35個循環(huán)，最后72℃延伸6min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的回收 拿出擴(kuò)增結(jié)束Ep管，從中取出5L反應(yīng)產(chǎn)物，加入1L上樣緩沖液，再加入4L的ddH2O混勻。點入預(yù)先制備好的1%的瓊脂糖凝膠中，120V電泳。在紫外燈下檢測擴(kuò)增結(jié)果。切膠到1.5mL的EP管中，稱重(不超過200mg)，加入600L QG，50 ℃水浴10min，(如果未完全溶解，要繼續(xù)水浴，直至完全溶解)，每2～3min鐘漩渦混勻一次。將溶液轉(zhuǎn)到吸附柱上，12000rmp 1min。倒廢液，向吸附柱中加入300 LQG，12000 rmp 1min。倒廢液，加入700LPE，室溫放置2～5min,12000rmp 1min。倒廢液，加入500LPE，室溫放置2-5min,12000rmp 1min。倒廢液，空柱子12000rmp 2min。將吸附柱轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，靜置5min揮發(fā)殘留的PE。向膜中央加入10L的EB，靜置3min，12000rmp 2min，扔掉吸附柱，EP管中即為凝膠回收產(chǎn)物。

1.3.4 DNA片段測序 將回收的片段送至生物公司測序，測序引物為16S rDNA 通用引物。

2.4 砷氧化菌株的生長情況監(jiān)測：

1.4.1 菌株在砷脅迫和無砷脅迫中生長曲線的測定 分別以1%接種量至TSB培養(yǎng)基和1m mol/L As(III)的TSB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(37℃，200r/min)，每隔2h取樣，用紫外分光光度計在OD600測其吸光值。以時間t(h) 為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線圖。

1.4.2 菌株對砷的耐受性 在斜面上用接種針取一環(huán)菌種至5mL TSB培養(yǎng)基中,搖瓶培養(yǎng) 12h (200r/min，30℃)。取下將菌液搖勻，以1% 接種量分別接種于含 As(III)的TSB試管培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)。砷濃度分別是0、1、10、30、35、40、45、50、55、60、65 m mol/L，培養(yǎng)20h，菌株的菌密度值用分光光度計OD600測定。

1.4.3 菌株對重金屬銅的耐受性 在斜面上用接種針取一環(huán)菌種至 5mL TSB培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng) 12h (200r/min，30 ℃)。取下將菌液搖勻，以1%接種量分別接種于含 Cu2+的TSB試管培養(yǎng)基，置于搖床培養(yǎng)。砷濃度分別是0、0.2、0.4、0.7、1.0m mol/L，培養(yǎng)20h，菌株的菌密度值用分光光度計OD600測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選砷耐受菌及其砷氧化能力的鑒定：

分離得到并命名為11號菌株對砷氧化能力明顯。在含1mM As(Ⅲ)的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)11號菌，12h后取培養(yǎng)液上清與AgNO3溶液反應(yīng)，并與As(Ⅴ)/ As (Ⅲ)梯度溶液于AgNO3溶液反應(yīng)對比，發(fā)現(xiàn)11號菌株在培養(yǎng)12h后其上清液與AgNO3溶液發(fā)生反應(yīng)后顏色同As(Ⅴ)/ As(Ⅲ)梯度溶液100/0接近，可推斷出該菌株氧化能力接近100%.

2.2 砷氧化菌株16S rRNA基因測序鑒定菌種：

2.2.1 PCR擴(kuò)增電泳分析

圖1 泳道1～4為PCR產(chǎn)物，M道為標(biāo)準(zhǔn)核酸分子量MARKER

由圖2可以看出，16S rRNA大小為1.5KB左右，圖中1～4道電泳條帶單一，分子量符合，可以進(jìn)行下一步測序。

2.2.2 菌株16S rRNA基因測序結(jié)果：

2.2.3 構(gòu)建進(jìn)化樹：

圖2 根據(jù)11號菌16srRNA測序結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹

根據(jù)上述結(jié)果初步確定11號菌屬于假單胞菌屬(pseudomonas)，而已有假單胞菌屬被發(fā)現(xiàn)有對砷的氧化還原代謝能力。

2.3 在砷脅迫下菌株生長曲線的測定：

圖4可以看出，菌株8 h 達(dá)到生長的對數(shù)期，12 ～ 28h達(dá)到生長的穩(wěn)定期。砷的加入并不改變菌體的生長規(guī)律，而在砷脅迫下砷對菌體的生長有一定的抑制作用。

2.4 菌株對砷的耐受性分析：

由圖5可見，含砷量越高， 砷對菌的生長抑制越大。當(dāng)水中As(Ⅲ)達(dá) 65mM/L 時， 菌的生長出現(xiàn)了停止，說明菌株對As(Ⅲ)的耐受量為65mM/L.

2.5 菌株對銅的耐受性分析：

由圖6可見，含銅離子濃度越高，其對菌的生長抑制越大。當(dāng)水中Cu2+達(dá)1mM/L 時， 菌的生長出現(xiàn)了停止，說明菌株對 Cu2+的耐受量1mM/L.

圖5 菌株對銅的耐受性

3 展望

對微生物砷代謝機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，微生物的砷甲基化和微生物對砷的氧化作用都可以將 As (Ⅲ)轉(zhuǎn)化為毒性較低的有機(jī)砷或 As (Ⅴ)。 如何利用微生物對砷污染環(huán)境進(jìn)行修復(fù)已成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點，因此生物修復(fù)被認(rèn)為是修復(fù)砷污染環(huán)境的重要手段。本研究發(fā)現(xiàn)的這株砷氧化菌，能在As(Ⅲ)環(huán)境下氧化As(Ⅲ)為As(Ⅴ)，降低環(huán)境中的毒性，同時完成自身的生長。對As(Ⅲ)的耐受量為65mM/L，相較已報道的CLL-B7[10]，其耐受性達(dá)到CLL-B7的1.5倍，有很高的研究價值。后續(xù)將針對其砷環(huán)境脅迫中的相關(guān)基因表達(dá)及重要代謝循環(huán)的過程變化研究其對砷的氧化代謝機(jī)制。

[1]Rodríguez-Lado L, Sun G, Berg M, et al. Groundwater arsenic contamination throughout China[J]. Science, 2013, 341(6148):866.

[2]紀(jì)冬麗, 孟凡生, 薛 浩,等. 國內(nèi)外土壤砷污染及其修復(fù)技術(shù)現(xiàn)狀與展望[J]. 環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報，2016, 6(1): 90～99．

[3]陳雪梅,胡鋒平.含砷飲用水處理技術(shù)綜述[J].江西化工, 2009, (4):42～45.

[4]Simeonova D D, Lièvremont D, Lagarde F, et al. Microplate screening assay for the detection of arsenite-oxidizing and arsenate-reducing bacteria[J]. Fems Microbiology Letters, 2004, 237(2):249～253.

[5]Jahan K, Mosto P, Mattson C, et al. Microbial Removal of Arsenic[J]. Water, Air, & Soil Pollution: Focus, 2006, 6(1):71～82.

[6]Mishra D, Rhee Y H. Microbial leaching of metals from solid industrial wastes[J]. Journal of Microbiology, 2014, 52(1):1～7.

[7]Oremland R S, Stolz J F. The ecology of arsenic[J]. Cheminform, 2003, 300(5621):939～44.

[8]Hamamura N, Fukushima K, Itai T. Identification of antimony-and arsenic-oxidizing bacteria associated with antimony mine tailing[J]. Microbes & Environments, 2013, 28(2):257～263.

[9]Amend J P, Saltikov C, Lu G S, et al. Microbial Arsenic Metabolism and Reaction Energetics[J]. Reviews in Mineralogy & Geochemistry, 2014, 79(1):391～433.

[10]Chen L L. Isolation and Identification of a Microbacterium Strain with Arsenite-Oxidizing and Arsenate-Reducing Abilities[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2011,21(2):216～218.

Isolationandidentificationofatrivalentarsenicoxidizingbacteriumandanalysisofitsgrowth

PAN Ling-feng, LI Ming-lan, PAN Ji-cheng

(College of Life Science,Hubei Normal University Huangshi 435002,China)

Arsenic and its compounds are environmental pollution, arsenic abundance in the crust is about 1.8ppm, the rock and the arsenic content in soil from less than 1ppm to several hundred ppm, arsenic in nature widely existence leads to the inevitable arsenic pollution. There are two important influence of microbial oxidate arsenic: one is As (III) toxicity is much stronger than that of As (V), so the oxidation reaction can reduce the toxicity of arsenic pollution in the environment,at the same time produce trivalent arsenic oxidizing bacteria by arsenic oxidation process to complete its energy metabolism and growth. In this study the separation of arsenic tolerance strains out soil samples and water samples obtained from the Huangshi smelter in the identification of arsenic oxidation ability of single colony, a strain found in the culture medium in the environment of As(III) can be oxidized to As(V), and the oxidation rate is close to 100% and named strain No. 11.The results showed that strain No.11 belonged to pseudomonas according to the phylogenetic tree constructed by 16S rRNA gene.Analyzing strain No.11 tolerance to As (III) and Cu2+,the results shows that the inhibitory effects of As (III) and Cu2+on the growth of strain No.11 are positively correlated.

Trivalent arsenic; arsenic oxidizing bacteria; growth curve

Q93

A

2096-3149(2017)04- 0067-06

10.3969/j.issn.2096-3149.2017.04.014

2017—09—28

潘靈鋒(1991— )，湖北黃石人，碩士生.