重組人膠原蛋白微生物限度檢查方法的建設及驗證

李曉穎+侯增淼+史瑾+翟寧寧+楊金芳+楊小琳+趙金禮

摘 要：目的：建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢測方法及控制菌檢測方法，并進行方法學驗證，用于重組人膠原蛋白原料的質量控制。方法：依據《中國藥典》2015版四部通則1105和1106，對重組人膠原蛋白原料需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數進行檢測，并對控制菌進行檢測。結果：連續3批重組人膠原蛋白原料回收率范圍在0.8-1.2之間，符合規定；控制菌檢測方法符合規定。結論：重組人膠原蛋白需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數檢測采用直接接種法，控制菌檢測采用常規法。

關鍵詞：人膠原蛋白；微生物限度；方法建設；方法學驗證。

中圖分類號：S961.6 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）35-0098-02

前言

重組人膠原蛋白是通過生物技術手段構建的工程菌株，經發酵，分離純化制備的器械原料，其主要成分為重組人膠原蛋白。根據現行標準，應進行細菌總數、霉菌和酵母菌總數以及控制菌檢查，根據中國藥典2015版四部通則1105，1106規定[1]，建立重組人膠原蛋白原料的微生物限度檢查方法，驗證培養基靈敏度，并進行方法適用性檢查，為重組人膠原蛋白原料建立符合質量控制要求的檢測方法。

1 設備材料

1.1 材料

胰酪大豆胨瓊脂培養基，沙氏葡萄糖瓊脂培養基，胰酪大豆胨液體培養基，沙氏葡萄糖液體培養基，麥康凱液體培養基，麥康凱瓊脂培養基，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基，溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基均購自陜西標普，氯化鈉，聚山梨酯80。

高壓滅菌鍋（上海申安），超凈工作臺（蘇凈凈化），分析天平（萬分之一，奧豪斯），生化培養箱（上海博泰），水浴鍋。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]，大腸埃希菌[CMCC（B）44102]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉[CMCC（F）98003]均購自陜西標普，各菌種的工作菌種均傳至第3代。

1.2 供試品

本公司按規定工藝生產的連續3批重組人膠原蛋白凍干海綿，批號分別為：201704010，201704011，201704012。

2 實驗方法

2.1 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，大腸埃希菌，枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至胰酪大豆胨液體培養基中，30～35℃培養18～24小時，培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中，20～25℃培養48小時，培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，25℃培養5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的菌孢子懸液。

2.2 供試品制備

稱取供試品1g，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至10ml，配制成1：10供試品溶液。

2.3 直接接種法方法適用性檢查

2.3.1 供試品組制備

取90mm無菌平皿6塊，每塊加入1ml供試品溶液，3塊平皿注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，待凝固，33℃倒置培養3天，逐日觀察；3塊平皿注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，待凝固，25℃倒置培養5天，逐日觀察。

2.3.2 實驗組制備

取90mm無菌平皿15塊，每塊加入1ml供試品溶液，再各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿，注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，待凝固，33℃倒置培養3天，逐日觀察；取90mm無菌平皿6塊，每塊平皿加入1ml供試品溶液，再各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿，注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，待凝固，25℃倒置培養5天，逐日觀察。

2.3.3 陽性組制備

取90mm無菌平皿15塊，各吸取1ml小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉至3塊平皿，均注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，待凝固后，33℃倒置培養3天，逐日觀察；取90mm無菌平皿6塊，各吸取1ml小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉至3塊平皿，均注入15-20ml的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，待凝固后，25℃倒置培養3天，逐日觀察。

2.3.4 陰性組制備

各吸取1ml稀釋劑至6塊平皿，3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養基，3塊注入15-20ml的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，待凝固，于對應溫度倒置培養，作為陰性對照，逐日觀察。

2.4 控制菌檢查方法適用性驗證

2.4.1 實驗組制備

取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養基中，加入小于100cfu/ml大腸埃希菌菌懸液，35℃培養18-24小時，取1ml接種于100ml麥康凱液體培養基，44℃培養18-24h，后劃線接種于麥康凱瓊脂培養基上，35℃倒置培養18-24小時[2]；取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養基中，加入小于100cfu/ml金黃色葡萄球菌菌懸液，35℃培養18-24小時，后劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上，35℃倒置培養18-24小時；取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養基中，加入小于100cfu/ml銅綠假單胞菌菌懸液，33℃培養18-24小時，后劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基上，35℃倒置培養18-24小時。endprint

2.4.2 供試品組制備

取1：10供試品溶液10ml，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養基中，于35℃培養18-24小時，后劃線接種于相應瓊脂培養基上，35℃倒置培養，觀察生長狀況。

2.4.3 陽性組制備

各吸取小于100cfu/ml的大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌接種于100ml胰酪大豆胨液體培養基中，于35℃培養18-24小時，后劃線接種于相應瓊脂培養基上，35℃倒置培養，觀察生長狀況。

2.4.4 陰性組制備

吸取10ml的0.9%無菌氯化鈉，分別接種至100ml胰酪大豆胨液體培養基中，于35℃培養18-24小時，后劃線接種于相應瓊脂培養基上，35℃倒置培養，觀察生長狀況。

3 實驗結果

3.1 菌液稀釋級確定

通過對不同菌懸液進行稀釋培養，最終確定各菌懸液稀釋級，結果如表1：

3.2 直接接種法方法適用性檢查

根據《中國藥典》2015版四部通則1105規定，回收率等于試驗組菌落數減去供試品組菌落數的值與菌液陽性組菌落數的比值，回收率在0.5-2.0范圍內時，可照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數，結果如表2。

金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉回收率在0.8-1.2之間。符合規定。表明重組人膠原蛋白原料的檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，可以照此檢查方法和檢查條件進行供試品的微生物限度檢查。

連續3批重組人膠原蛋白凍干海綿需氧菌總數分別為120cfu/g，110cfu/g，90cfu/g，霉菌和酵母菌總數分別為<10cfu/g，<10cfu/g，<10cfu/g，符合《中國藥典》2015版四部通則1105規定的需氧菌總數不得超過200cfu/g，霉菌和酵母菌總數不得超過20cfu/g。

3.3 控制菌檢查

根據《中國藥典》2015版四部通則1106規定試驗組和陽性組應檢出試驗菌，供試品組，陰性對照組應不得檢出，即該試驗方法成立。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌控制菌檢查結果如表3。

實驗組和陽性組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌在相應的瓊脂培養基上均生長良好；陰性組無菌生長；符合《中國藥典》2015版四部控制菌檢查驗證要求。

連續3批重組人膠原蛋白凍干海綿控制菌未檢出，符合規定。

4 結束語

從上述結果來看，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉回收率在0.8-1.2之間，說明樣品對金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉均沒有抑菌作用，可采用直接接種法進行需氧菌、霉菌和酵母菌的檢查。控制菌檢查方法學驗證符合規定，可用于進行樣品的控制菌檢查。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：140-149.

[2]李敏，申國慶，龔春燕.復方土茯苓膠囊微生物限度檢查方法驗證[J].藥學與臨床研究，2017，25（1）：33-35.endprint