胡根海,董 娜,晁毛妮,張志勇,王清連
(河南科技學(xué)院,現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003)
PEG模擬干旱脅迫對不同抗逆性棉花的生理特性的影響
胡根海,董 娜,晁毛妮,張志勇,王清連
(河南科技學(xué)院,現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003)
為了篩選培育棉花抗旱性的有用指標(biāo),利用聚乙二醇(PEG6000)模擬干旱,對不同類型棉花苗期干旱處理響應(yīng)進行了評價?;|(zhì)育苗后,采用5種不同濃度聚乙二醇脅迫棉花幼苗,7 d后測定葉片的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸和丙二醛(MDA)含量的變化,比較過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的差異,結(jié)果表明:棉花苗期在不同濃度PEG脅迫下,葉綠素含量在5%的PEG脅迫下,表現(xiàn)含量略升高,高于10%PEG濃度脅迫,葉綠素含量呈現(xiàn)下降的趨勢;可溶性糖在10%~25%的PEG脅迫下表現(xiàn)高的含量;可溶性蛋白在5%PEG脅迫時,其含量開始增加并高于對照;游離脯氨酸含量表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的加大而升高,抗旱、抗鹽品種增加的量高于敏感材料;丙二醛含量亦表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的加大而升高,在5%~15%的范圍內(nèi),抗旱抗鹽品種升高幅度低于敏感材料,在20%,25%的高濃度脅迫下,三種材料的差別很??;三種抗氧保護酶活性在不同材料不同脅迫濃度中表現(xiàn)出差異,POD酶活性在5%PEG干旱脅迫時即表現(xiàn)出上升趨勢,在10%、15%脅迫濃度時達到最高值;SOD酶活性在5%的脅迫下高于對照,隨著10%、15%、20%PEG濃度逐漸增高,SOD酶活性均表現(xiàn)穩(wěn)定的高活性;CAT酶活性在5%、10%PEG脅迫時呈現(xiàn)增高趨勢,在15%以上的PEG脅迫時活性迅速下降。由此認為,葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸和丙二醛含量可能是干旱脅迫下的植株被動響應(yīng)的指標(biāo),可溶性糖合成可能是一種重要滲透調(diào)節(jié)方式;在不同干旱級別中不同抗氧保護酶在起主導(dǎo)作用,SOD酶可能是較好的抗旱性選擇指標(biāo)。
棉花;干旱處理;苗期;生理指標(biāo)
近年來隨著全球氣候變暖,干旱對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響更加嚴(yán)重,我國人多地少糧棉爭地的矛盾也更加突出。隨著中原糧食核心區(qū)建設(shè)步伐的加快,棉花種植面積逐年萎縮,為了穩(wěn)定棉花種植面積,業(yè)內(nèi)人士開始在新疆和內(nèi)蒙開荒植棉。黃河流域?qū)儆诖箨懶约撅L(fēng)氣候,氣候干燥,降雨量嚴(yán)重不足,不論是內(nèi)蒙新開棉區(qū),還是新疆、黃河流域棉區(qū),在棉花苗期經(jīng)常遇到干旱危害,干旱問題已成為嚴(yán)重制約棉花種植的關(guān)鍵問題。棉花苗期的核心任務(wù)是一播全苗,在干旱少雨的情況下,種植抗旱品種也是一條出路。前人對棉花干旱脅迫的生理響應(yīng)方面已做過一些研究,費克偉等[1]研究表明抗旱性強的棉花品種的超氧化物歧化酶活性隨著干旱處理時間延長而增加;在干旱脅迫下,耐旱型棉花品種可以通過增加根系滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)游離脯氨酸含量來提高其耐旱性[2],不同鈴重的棉花品種各部位果枝葉片中丙二醛含量與干旱相關(guān)[3]。已有試驗只是對某類或單一品種做了研究[4-6],比較在不同程度的干旱條件下,不同抗逆型品種的生理差異的研究尚未見報道,本試驗以抗旱、抗鹽、敏鹽和敏旱的不同類型棉花品種為材料,設(shè)置PEG梯度干旱脅迫處理,探討了在不同程度干旱條件下,棉花葉片葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、丙二醛含量和抗氧保護酶活性等生理指標(biāo)的變化特征,以期為抗旱棉花品種選育和抗旱栽培提供理論依據(jù)。
1.1 試驗材料
以3個不同抗逆類型的陸地棉品種作供試材料:中 S9612(敏旱、敏鹽)、中 H117(抗旱)、中 9835(抗鹽)(中國農(nóng)科院棉花研究所葉武威課題組提供)。
1.2 設(shè)計與處理
材料于2015年4月20日播種于裝有無土育苗基質(zhì)的培養(yǎng)箱中,定期噴水使基質(zhì)保持濕潤,待棉花長出3片真葉時開始起苗并輕輕用自來水沖掉基質(zhì),置于MS+PEG營養(yǎng)液中進行脅迫處理,每個處理10株,3次重復(fù),PEG的濃度分別為 5%、10%、15%、20%、25%,以蒸餾水為對照,脅迫處理后7 d對棉花苗取樣,每次每個處理取樣3~5片葉,用蒸餾水沖洗干凈后,吸水紙吸干,剪碎,稱取棉花葉片,每份0.3 g左右,編號包裝,用液氮速凍后,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 測定指標(biāo)與方法
取處理樣品測定各生理指標(biāo)(鮮重),用丙酮浸提法測定葉片的葉綠素含量(mg·g-1),考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量(μg·g-1),蒽酮法測定可溶性糖含量(mg·g-1),用茚三酮比色法測定脯氨酸含量;用硫代巴比妥比色法測定丙二醛含量;愈創(chuàng)木酚氧化法測定過氧化物酶(POD)酶活性(1個酶活力單位U定義為每克鮮重組織每分鐘所引起的0.01OD470nm的變化),鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶(SOD)酶活性(1個酶活力單位U定義為:在25℃恒溫條件下,每毫升反應(yīng)液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化率達50%的酶量),過氧化氫酶測定采用紫外吸收法(以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活力單位)[7]。
1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
所測數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值,在Excel 2003軟件中進行整理分析。
2.1 梯度干旱脅迫對葉片葉綠素含量的影響
干旱脅迫下葉綠素含量的變化,在一定程度上可以反映植物抵抗干旱脅迫能力的強弱。從圖1可看出,干旱脅迫對棉花葉片葉綠素含量產(chǎn)生了顯著影響,在5%的PEG濃度脅迫處理下,三個材料的葉綠素含量均升高;在10%以上 PEG濃度時,隨著PEG濃度的加大,各處理葉綠素總量均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,且下降幅度隨脅迫濃度增加而增大。各處理內(nèi)均表現(xiàn)為抗旱品種中H177和抗鹽品種中9835比敏旱鹽品種中S9612的葉綠素含量略高。

圖1 PEG梯度濃度處理7 d葉片內(nèi)葉綠素含量Fig.1 The variation of leaf chlorophyll content under PEG concentration gradient processing within 7 days
2.2 梯度干旱脅迫對葉片可溶性糖含量的影響
滲透調(diào)節(jié)是植物在干旱環(huán)境脅迫發(fā)生時的重要生理調(diào)節(jié)適應(yīng)機制之一,在干旱條件下,植物細胞可以通過增加可溶性糖的含量來保持滲透勢的平衡。如圖2所示,不同強度的干旱脅迫條件下3個不同抗逆性棉花品種葉片中可溶性糖的變化表現(xiàn)出差異,隨著干旱脅迫的加重,在相同處理時間內(nèi)可溶性糖含量均呈上升趨勢。與對照相比,5%的濃度脅迫處理后可溶性糖含量沒有顯著性增加。在10%、15%PEG脅迫下,處理后可溶性糖含量中H177和中9835與對照比分別增加 41.4%、40.8%和 40.8%、39.4%,但敏旱鹽品種中S9612只增加了0.08%,表明可溶性糖具有重要的生理調(diào)節(jié)功能,可緩解、抵抗干旱對植物造成的傷害,不同抗逆性品種增加可溶性糖的滲透調(diào)節(jié)能力有差別,抗旱、抗鹽品種在10%PEG干旱脅迫下可溶性糖有較高數(shù)量的增加。
2.3 梯度干旱脅迫對葉片可溶性蛋白含量的影響
植物在逆境條件下通過提高可溶性蛋白的合成速率,增加其含量來直接參與適應(yīng)逆境脅迫,高含量的可溶性蛋白可使細胞維持較低的滲透勢,抵抗水分脅迫帶來的傷害。從圖3可以推知,3個不同抗逆類型棉花品種在同等的干旱脅迫下表現(xiàn)出類似的響應(yīng),但響應(yīng)存在差異。在低濃度5%脅迫下,各品種可溶性蛋白質(zhì)的合成均迅速增加,中 H177、中9835和中 S9612增加的倍數(shù)分別為 1.76、2.00和1.65;在 10%脅迫下增加倍數(shù)為 2.71、3.00、2.20,這顯示在低濃度的PEG脅迫下,棉花可溶性蛋白會迅速增加,但抗旱、抗鹽品種增加倍數(shù)僅略高于敏感材料。在15%PEG濃度脅迫下,中H177和中9835仍然有較高的可溶性蛋白含量,但敏感品種已經(jīng)低于對照,在20%、25%高濃度的PEG脅迫下,3個品種的可溶性蛋白含量均低于對照。

圖2 PEG梯度濃度處理7 d葉片內(nèi)可溶性糖含量Fig.2 The variation of leaf soluble sugar content under PEG concentration gradient processing within 7 days

圖3 PEG梯度濃度處理7 d葉片內(nèi)可溶性蛋白含量Fig.3 The variation of leaf soluble protein content under PEG concentration gradient processing within 7 days
2.4 梯度干旱脅迫對葉片內(nèi)游離脯氨酸的影響
在植物遇到干旱時,植物體內(nèi)會積累大量的游離脯氨酸,細胞內(nèi)脯氨酸含量的增加降低了水勢,從而使細胞在干旱環(huán)境下繼續(xù)吸水。圖4結(jié)果表明,隨著PEG脅迫濃度的增加,三個品種的棉花葉片中游離脯氨酸的含量也逐漸增加,但不同品種與對照比較增加的幅度不同,在 5%、10%、15%、20%和25%PEG脅迫下,抗旱品種中 H177分別增加53.3%、70.2%、86.7%、160.0%和 162.0%;抗鹽品種中 9835分別增加 45.3%、51.6%、75.4%、132.0%和147.3%;敏旱敏鹽品種中 S9612分別增加 12.4%、50.3%、73.6%、122.0%和 122.4%。在同一脅迫濃度下,一般是抗旱品種中H177增加最高,敏旱敏鹽的材料中S9612增加最少。

圖4 PEG梯度濃度處理7 d葉片內(nèi)游離脯氨酸含量Fig.4 The variation of leaf proline content under PEG concentration gradient processingwithin 7 days
2.5 梯度干旱脅迫對葉片內(nèi)MDA含量的影響
丙二醛(MDA)是反映植物干旱脅迫下細胞膜脂過氧化作用的重要指標(biāo),其積累是活性氧毒害作用的直接表現(xiàn)。從圖5可以推知,在沒有PEG脅迫的對照中,三個材料的丙二醛含量沒有顯著的差異。在5%PEG脅迫下丙二醛濃度有所上升,在PEG脅迫濃度為10%、15%的處理中丙二醛含量繼續(xù)上升,在5%、10%和15%的脅迫處理中抗旱、抗鹽材料和敏旱敏鹽材料之間含量差異達到顯著性差異水平(P≤0.05),在5%~15%范圍內(nèi),三個材料比較,抗旱中H177,抗鹽中9835的丙二醛含量均低于敏旱敏鹽材料。但在20%、25%的高濃度 PEG脅迫下,三個材料差別很小。
2.6 梯度干旱脅迫對葉片內(nèi)POD活性的影響
POD能清除植物體內(nèi)過多的H2O2等過氧化物,防止H2O2對細胞膜造成傷害,是細胞內(nèi)防御酶系統(tǒng)中重要的清除酶之一,從圖6中可以看出在模擬干旱處理后,3個不同抗逆類型品種表現(xiàn)出了不同的響應(yīng)。在5%、10%的輕度干旱脅迫下,三個品種的POD活性均升高,脅迫越強升高越多;在15%中度脅迫時,中H177和中9835繼續(xù)表現(xiàn)出POD活性升高,而敏感品種中S9612則表現(xiàn)為酶活性下降。在20%PEG濃度脅迫下所有材料均表現(xiàn)POD活性下降,但下降幅度不同,中H177和中9835仍然高于對照,敏感品種中S9612則低于對照。

圖5 PEG梯度濃度處理7 d葉片內(nèi)丙二醛含量Fig.5 The variation of leafMDA contentunder PEG concentration gradient processing within 7 days

圖6 PEG梯度濃度處理7 d葉片過氧化物酶活性的變化Fig.6 The variation of leaf POD under PEG concentration gradient processing within 7 days
2.7 梯度干旱脅迫對葉片內(nèi)SOD活性的影響
SOD是植物組織防御系統(tǒng)中的重要保護酶,在逆境條件下能清除過氧化氫、活性氧等物質(zhì),從而保護細胞。從圖7可推知,在不同PEG濃度處理下,SOD的反應(yīng)存在差別,5%~20%的脅迫可以誘導(dǎo)組織SOD活性升高,中H177和中9835隨著干旱梯度增加SOD活性升高的幅度也在增加,在15%PEG梯度水平最高,中S9612表現(xiàn)在5%PEG濃度處理開始升高,在10%PEG濃度處理下達到酶活性最高值,但在高于15%PEG濃度時表現(xiàn)下降,在25%重度干旱脅迫下,其SOD活性已降至對照以下。

圖7 PEG梯度濃度處理7 d葉片超氧化物歧化酶活性的變化Fig.7 The variation of leaf SOD under PEG concentration gradient processing within 7 days
2.8 梯度干旱脅迫對葉片內(nèi)CAT活性的影響
CAT作為過氧化物的重要清除劑,在植物的抗逆性上起著重要的作用,從圖8可推知,在不同PEG濃度處理下,CAT的反應(yīng)存在不同,在5%、10%的脅迫下,可以誘導(dǎo)組織使CAT活性升高,并顯著高于對照,三個材料的CAT活性均隨著干旱梯度增加而升高,中S9612在5%低干旱梯度水平即達到最高,中9835和中H177在10%PEG脅迫濃度時達到最高,但中H177酶活性略低于中9835,在15%PEG濃度處理時酶活性均開始下降,在20%、25%更高PEG濃度中,CAT活性已降至對照以下。

圖8 PEG梯度濃度處理7 d葉片過氧化氫酶活性的變化Fig.8 The variation of leaf CAT under PEG concentration gradient processing within 7 days
作物在受到干旱脅迫以后,植物體會啟動相應(yīng)的防御機制,以降低環(huán)境變化對植物體的損害。與作物干旱脅迫有關(guān)的指標(biāo)有多個,這些指標(biāo)在不同等級干旱脅迫下是否都發(fā)揮作用,或所起作用的大小是否有別還未見探討。
本文首次對不同等級干旱脅迫下,棉花的幾個生理指標(biāo)的干旱響應(yīng)做了探討。已有觀點認為不同PEG脅迫時間會導(dǎo)致不同干旱脅迫響應(yīng)指標(biāo)達到峰值的時間不同[8],試驗選取處理7 d后葉片對各指標(biāo)進行測定評價,結(jié)果顯示葉綠素含量在5%的PEG脅迫下,表現(xiàn)含量略升高,高于10%PEG濃度脅迫下,表現(xiàn)為葉綠素含量的下降;該結(jié)論與玉米干旱處理下葉綠素含量變化一致[9],進一步分析顯示抗旱抗鹽材料葉綠素含量下降的幅度低于敏感材料??扇苄蕴堑姆治鲲@示,可溶性糖含量在10%~25%的PEG脅迫下表現(xiàn)高的含量,在10%以上PEG脅迫下抗旱、抗鹽的材料均有可溶性糖含量的滲透調(diào)節(jié),抗性材料有較高幅度的可溶性糖增加,而敏旱敏鹽材料僅有較少的增加。就可溶性蛋白而言,在5%~10%濃度的PEG脅迫下,棉花可溶性蛋白均會迅速增加,但抗旱、抗鹽品種增加倍數(shù)高于敏感材料,在15%濃度下敏旱敏鹽和抗旱和抗鹽品種有顯著差異;這說明或許在15%中度干旱脅迫下,抗旱、抗鹽的可溶性蛋白穩(wěn)定性更強,而敏鹽敏旱品種此時可溶性蛋白可能已經(jīng)因干旱脅迫而分解。葉片中游離脯氨酸含量表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的加大而升高,但抗旱抗鹽品種升高數(shù)量高于敏感材料;葉片中丙二醛含量表現(xiàn)為隨著脅迫濃度的加大而升高,在5%~15%的范圍內(nèi),抗旱抗鹽品種升高幅度低于敏感材料,在20%、25%的高濃度脅迫下,三種材料的差別很??;干旱可以使棉花幼苗葉片脯氨酸和丙二醛含量升高的結(jié)論與干旱脅迫下馬鈴薯幼苗的生理反應(yīng)特性相一致[10],但本試驗進一步揭示了抗旱抗鹽材料的增加幅度小于敏感材料的新觀點。
在正常生長條件下,植物體內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生與保護酶系統(tǒng)SOD、POD及CAT等有效的清除共同維持氧化還原的動態(tài)平衡,從而不會引起氧化傷害;鄧茳明等[11]研究認為棉花花藥保護酶活性隨生育進程推進而逐漸改變酶活性,耐高溫棉花花藥SOD和POD活性在花粉粒成熟期顯著高于敏感類型,而CAT活性在整個發(fā)育時期均分別顯著高于敏感類型材料。李伶俐等[12]在研究不同熟性的棉花葉片的抗氧保護酶活性時也發(fā)現(xiàn)擴展期葉片的SOD活性高,而POD活性較平穩(wěn);中期葉片的SOD、POD活性均不斷提高;后期葉片SOD表現(xiàn)分2類:一類持續(xù)升高,該類表現(xiàn)強抗旱性,另一類開始下降,該類表現(xiàn)不抗旱。本試驗發(fā)現(xiàn)三葉期的棉花在不同PEG脅迫下,三種抗氧保護酶活性在不同材料之間也表現(xiàn)了活性差異。三種抗氧保護酶響應(yīng)與PEG脅迫的強度存在某些關(guān)聯(lián),POD活性在5%輕度PEG干旱脅迫即表現(xiàn)了酶活性上升,在10%、15%時達到 POD的最高酶活性,在20%、25%高強度PEG干旱脅迫下表現(xiàn)酶活性下降。SOD酶活性在5%的輕度脅迫下升高超越對照,在10%、15%、20%逐漸增加PEG干旱脅迫下均表現(xiàn)穩(wěn)定的高活性,在25%的干旱脅迫下,抗旱抗鹽材料的SOD酶活性仍高于對照。CAT酶活性表現(xiàn)低濃度PEG脅迫時導(dǎo)致活性增高,15%以上的PEG脅迫呈現(xiàn)活性迅速下降,在20%、25%脅迫下其酶活性均低于對照水平。酶活性的可誘導(dǎo)性與王燕芳的結(jié)果一致[13]。實驗結(jié)果認為在不同PEG干旱模擬脅迫下,三種酶活性可能存在差異,在5%~10%的輕度PEG脅迫下棉花主要是CAT在起主導(dǎo)作用,在10%~15%的中度脅迫下主要是POD酶在起主導(dǎo)作用,在10%~20%的中高度脅迫下,SOD酶起主導(dǎo)作用,抗旱抗鹽與敏旱敏鹽材料比較均表現(xiàn)為抗性材料同期干旱脅迫下酶活性一般高于敏感材料,這說明依據(jù)抗氧保護酶活性之間的差異選擇抗性材料有其理論基礎(chǔ),在研究不同材料玉米幼苗的抗氧保護酶的差別時也得到了一致的結(jié)果[14],不同干旱強度脅迫下,起主導(dǎo)作用的抗氧保護酶也有差別,本試驗結(jié)果顯示中高強度的干旱脅迫下SOD起主導(dǎo)作用,這提示我們棉花苗期的葉片在受干旱脅迫時的抗性保護中SOD可能是最重要的保護酶,在抗干旱材料的選育中,可以在中高強度干旱脅迫下,依據(jù)SOD酶活性的高低進行材料的選擇。試驗結(jié)論反映了在不同干旱級別不同酶在起主導(dǎo)作用,這也為抗旱材料選擇提供理論基礎(chǔ)。
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Effects of drought stress simulated by PEG6000 on physiological characteristics of different upland cotton
HU Gen-hai,DONG Na,CHAOMao-ni,ZHANG Zhi-yong,WANG Qing-lian
(Henɑn Institute of Scienceɑnd Technology,Collɑborɑtive Innovɑtion Center of Modern Biologicɑl Breeding He’nɑn Province,Xinxiɑng,He’nɑn 453003,Chinɑ)
In order to find useful indexes of the drought resistance cotton,treatment response of different cotton types seedlingswas evaluated by using PEG6000 simulated drought.First,usingmatrix seedlings,and then the cotton seedlings were stressed by five different concentration of PEG.After the stress lasted for seven days,the content changes of chlorophyll,soluble sugar,soluble protein,proline and malondialdehyde of seedling leaves weremeasured,and the differences of peroxidase,superoxide dismutase and catalase activity were compared.The results showed that the cotton seedling presented different physiological characteristics under the stress of different concentration PEG stress,Chlorophyll content increased slightly under 5%PEG stress than the control,and chlorophyll contentwas lower than control in the 10%PEG stress;soluble sugar content showed higher levels under 10%~25%PEG stress;Soluble protein content increasedmore than control under5%PEG stress;Proline content in leaves increased with the increase of stress concentration,But proline content of drought resistant and salt resistant varietieswere higher than sensitivematerials;malondialdehyde content in leaves had similar trends as proline,but in the range of 5%~15%,the drought resistant and salt resistant varietieswere lower than the sensitivematerials,under20%,25%PEG stress,the difference of three kinds ofmaterialwas very small.Three kinds of antioxidant protection enzymes showed different change patterns of activity under differentmaterial treatments.The enzyme activity of peroxidase increased from 5%PEG stress,and the highest enzyme activity of peroxidasewere displayed in 10%,15%stress concentration.The enzyme activity of SOD in 5%PEG stress was higher than that of the control,and alongwith the increased PEG stress(10%,15%,20%),SOD enzyme activities were stable and keeping higher levels.The enzyme activity of CAT increased in low concentration PEG stress(5%,10%),and it decreased rapidly in more than 15%PEG stress.In conclusion,chlorophyll content,soluble protein,proline and malondialdehydemay be indexes of passive response of plants under drought stress.The soluble sugar is a kind of important osmotic regulation substance.In different levels of drought,different antioxidant protection enzymes play leading role,SOD enzymemay be a better drought resistance selection index.
cotton;drought treatment;seedling stage;physiological indexes
S562.034
A
1000-7601(2017)05-0223-06
10.7606/j.issn.1000-7601.2017.05.33
2016-07-04
2016-09-20
河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(16A210023)
胡根海(1966—),男,河北邢臺人,博士,副教授,主要從事棉花逆境生理方面的研究。E-mail:hgh1013@126.com。