NDV和A PMV-4的F和HN蛋白糖基化位點的差異分析比較*

袁小遠，楊金興，張玉霞，孟凱，李莉，王友令，艾武

（山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250023）

NDV和A PMV-4的F和HN蛋白糖基化位點的差異分析比較*

袁小遠，楊金興，張玉霞，孟凱，李莉，王友令**，艾武**

（山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250023）

本文就禽副黏病毒的兩種不同血清型APMV-1（以NDV為代表）和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位點進行分析比較。分析顯示：F蛋白糖基化位點NDV強弱毒株毒株均有6處糖基化位點，而APMV-4毒株則只有4處潛在的糖基化位點，而且位置與APMV-1略有不同。同時，NDV強毒株GM的HN蛋白有5個潛在的糖基化位點，而La Sota弱毒株有6個潛在的糖基化位點，即538～540位為NKT；APMV-4毒株有7處潛在的糖基化位點，且位置與APMV-1完全不一致。

新城疫病毒；禽副黏病毒；F/HN蛋白；糖基化位點

禽副黏病毒病 (Avain Paramyxoviridae virus，APMV)是當今危害全球養禽業的重要疫病之一，其病原共有九個血清型(APMV 1～9)[1]。禽副粘病毒1型最常見的是新城疫病毒（NDV），ND是引起家禽等的一種急性、烈性傳染性疾病，發病率和死亡率均很高，并且多種禽類等都可以感染。NDV是禽副黏病毒1型的代表，也是各型禽副黏病毒型中研究最為透徹的，而對禽副黏病毒APMV 2～9的分子特性和致病性知之甚少[2-4]。GenBank數據庫關于APMV-4型的分離毒株信息只有數株，相關研究非常有限。對于APMV-4的研究現在已獲悉：APMV-4可以從水禽中分離到，可導致病禽的肺炎、支氣管炎等呼吸道癥狀，而且可以在雞胚和 部分 細 胞上 增 殖[5，6]。

糖基化作為一種主要的翻譯后修飾作用對蛋白質的功能有著重要影響；糖基化位點能夠參與影響病毒蛋白的合成，進而影響其活性和功能。因此，通過分析比較APMV-1和APMV-4的F和HN蛋白糖基化位點的不同，為兩者作用機理的研究提供科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及背景資料 NDV的GM強毒株、疫苗株La Sota和APMV-4 QY毒株均由山東省SPF雞研究中心分離鑒定保存。GM強毒株為雞源基因VII型強毒株，La Sota為基因II型弱毒疫苗株，APMV-4的QY毒株為鴨源弱毒株。

1.1.2 試劑 PCR試劑盒、膠回收試劑盒、載體等均購自寶生物工程（大連）有限公司，Simple RNA kit購自博日生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank中NDV和APMV4的全基因組序列 （No：KU342001和 KC439346）設計4對引物，分別用于擴增F和HN全長基因。引物由華大基因公司合成，PAGE plus級別純化。

表1 F/HN基因擴增引物

1.2.2 RNA的提取和反轉錄 GM、La Sota、QY毒株的病毒RNA的提取按照Simple RNA試劑盒使用操作說明進行，最后用20μl DEPC水溶解RNA，立即進行RT操作。反轉錄RT按照文獻[7]的操作進行，cDNA產物-20℃保存。

1.2.3 PCR擴增、連接和驗證 APMV-1和APMV-4 的 cDNA 產物 5μl、2×pfu PCR Buffer（含Mg2+、dNTP plus）25μl、pfu DNA Polymerase(5U/μl)1μl、不同的 F 和 R primer(20pmol/μl)各 1μl，加水補至 50μl。PCR反應經摸索確定為：95℃預變性4min；第一步 94℃變性 60s、第二步 48～52℃退火60s、第三步 72℃延伸 90s，共進行 33個循環；72℃后延伸 4min；4℃保存。將擴增得到的 GM、La Sota、QY的F和HN產物純化后與PMD-19T進行連接、轉化、PCR反應驗證后，陽性質粒送至華大基因測序。

1.2.4 糖基化位點的比較分析 各毒株F和HN序列進行拼接后利用DNAStar v6.13和Mega6.0進行分析，比較各個片段的糖基化位點的不同。

2 結果

2.1 F和HN基因序列測定和同源性分析 經序列測定，APMV-1的GM分離毒F和HN的ORF長度分別為 1662、1716bp；La Sota 為 1662bp 和1734bp，而APMV-4 F和HN的ORF長度分別為1701、1698bp。就 F基因而言，APMV-4的 QY與GM、La Sota的氨基酸同源性為 30%、31.6%；就HN基因而言，QY與GM、La Sota的氨基酸同源性為 33.2%、32.6%。綜上，APMV-1和APMV-4的F和HN基因的同源性較低。

2.2 F蛋白糖基化位點分析 分析各毒株F蛋白的糖基化位點（即N-X-S/T）的不同之處，結果見表2。F蛋白糖基化位點La Sota和GM毒株均有6處糖基化位點，而APMV-4毒株則缺少2處位點，只有4處潛在的糖基化位點，而且位置與APMV-1略有不同。

表2 F蛋白糖基化位點的位置

2.3 HN蛋白糖基化位點分析 分析各毒株HN蛋白的糖基化位點不同之處，結果見表3。NDV強毒株GM HN蛋白有5個潛在的糖基化位點，而La Sota弱毒株有6個潛在的糖基化位點，即538～540位為NKT。APMV-4毒株完全與APMV-1不同，共有7處潛在的糖基化位點。從表3可以看出APMV-4與APMV-1的HN蛋白糖基化位點的數量與位置完全不一致。

表3 HN蛋白糖基化位點的位置

3 討論

APMV-1的HN、F蛋白是兩大糖基化蛋白，也是宿主保護性抗原。F蛋白是病毒感染細胞的必需蛋白，以非活性前體F0的形式存在；經宿主細胞特異性的蛋白酶水解后F蛋白才能表現出融合活性，通過促進病毒穿入宿主細胞膜而發揮融合作用[8]。HN蛋白是NDV中較大的糖蛋白，在識別唾液酸受體、促進細胞融合等方面有重要作用[9,10]。HN蛋白在融合的過程能夠識別并結合細胞受體。APMV-4毒株基因組全長是15054bp，與副黏病毒的“六規則”一致；基因組包含6個非重疊的基因，也是按NP/VMF-HN-L的順序排列。每個基因的兩側是高度保守的轉錄起始和停止信號，并且有長度為9～42nt的間隔序列。

蛋白質的糖基化是指在糖基轉移酶作用下將糖轉移至蛋白質，隨即和蛋白質上的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程。糖基化作為一種主要的翻譯后修飾作用對蛋白質功能有著重要修飾作用，例如它對于蛋白質的折疊、運輸、定位以及調節蛋白質功能等方面起著重要作用[11,12]。因此，對于糖基化位點的研究意義重大。

本文在對APMV-1和APMV-4的HN、F基因進行全基因測序的基礎上，對其潛在的糖基化位點進行分析。最終確定APMV-4毒株與APMV-1的強毒株和弱毒株F和HN蛋白糖基化位點存在差異，尤其是HN蛋白，糖基化位點的數量與位置完全不一致。以上研究數據為禽副黏病毒的不同血清型病毒感染和作用機制提供了科學的研究基礎。

[1] Alexander D J.Avian Paramyxoviridae recent developments[J].VeterinaryMicrobiology,1990,23(1-4):103-114.

[2] Liu X F,Wan H Q,Ni X X,et al.Pathotypical and genotypical characterization of strains of Newcastle disease virus,isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001 [J].Archives ofVirology,2003,148(7):1387-1403.

[3] Wang KC,Chen GQ,Jiang WM,et al.Complete Genome Sequence ofa Hemagglutination-Negative Avian Paramyxovirus Type 4 Isolated from China [J].Genome Announcements,2013,1(2):e0004513.

[4] Molouki A,Peeters B.Rescue of recombinant Newcastledisease virus:a shorthistoryofhow it all started[J].Archives of Virology,2017,162(7):1-10.

[5] Khattar S K,Nayak B,Kim S H,et al.Evaluation of the Replication,Pathogenicity,and Immunogenicity of Avian Paramyxovirus(APMV)Serotypes 2,3,4,5,7,and 9 in Rhesus Macaques[J].Plos One,2013,8(10):e75456.

[6] Choi K S,Kim J Y,Kye S J,et al.Genetic diversity of avian paramyxovirus type 4 isolatesfrom wild ducks in Korea from 2006 to 2011[J].Virus Genes,2013,46(2):302-308.

[7] 袁小遠,楊金興,王友令,等.一株野禽新城疫強毒分離株的分子特性及其對不同宿主的致病性[J].農業生物技術學報,2014,22(3):273-279.

[8] Cardenas-Garcia S,Afonso C L.Reverse Genetics of NewcastleDiseaseVirus[J].Methodsin Molecular Biology,2017,1602:141.

[9] Liu J,Zhu J,Xu H,et al.Effects of the HN Antigenic Difference between the Vaccine Strain and the Challenge Strain ofNewcastle Disease Virus on VirusSheddingand Transmission[J].Viruses,2017,9(8):225-229.

[10] Chu F,Wen H,Zhang W,et al.'a'-Position Mutated and G4-Mutated Hemagglutinin Neuraminidase Proteins of Newcastle Disease Virus Impair Fusion and Hemagglutinin -Neuraminidase -Fusion Interaction by Different Mechanisms [J].Intervirology,2013,56:27-36.

[11] Panda A,Elankumaran S,Krishnamurthy S,et al.Loss of N ～Linked Glycosylation from the Hemagglutinin ～Neuraminidase Protein Alters Virulence ofNewcastle Disease Virus[J].J.Virol,2004,76:4965-4975.

[12] Pegg C L,Hoogland C,Gorman J J.Site-specific glycosylation of the Newcastle disease virus haemagglutinin -neuraminidase [J].Glycoconjugate Journal,2016:1-17.

S858.312.65+9.5

B

1673-1085（2017）12-0008-03

2017-11-17

山東省農業科學院青年基金項目（2014QNM15）、 山東省自然科學基金面上項目（ZR2015CM009）；山東省農業科學院科技創新工程項目（CXGC2016A10）。

袁小遠（1980.01-），女，漢，山東榮成人，博士，研究方向：禽病分子生物學與免疫學。E-mail：xyyuan1980@163.com。

**通訊作者：王友令（1974-），男，副研究員，研究方向：家禽疫病防控研究。E-mail：wangyouling71@163.com。

艾武（1964-），女，研究員，研究方向：家禽疫病診斷與防治。 E-mail：767068849@qq.com.cn。