TLR3激動劑poly(I∶C)對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及相關分子機制

耿瑞麗 金賀 趙培 路永剛

·論著·

TLR3激動劑poly(I∶C)對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及相關分子機制

耿瑞麗 金賀 趙培 路永剛

目的觀察TLR3激動劑poly(I∶C)對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成的影響及相關分子機制。方法10只SPF級雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠，隨機分為模型組和poly(I∶C)組，每組5只。分別給予高脂飼料、高脂飼料+腹腔注射poly(I∶C)喂養。另設5只C57BL/6J小鼠為對照組，給予普通飼料喂養。給藥14周后處死小鼠。比較3組體重、纖維帽厚度、血管內-中膜厚度、血清生化指標[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)]、炎性因子[白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]、黏附分子[血管細胞黏附因子-1(VCAM-1)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、P-選擇素(P-selection)]、Toll樣受體3(TLR3)及其下游依賴β-干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(p-p 38)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化細胞外信號調節(p-ERK)蛋白表達變化。結果模型組、poly(I∶C)組小鼠體重增加明顯快于對照組(Plt;0.05)，但模型組、poly(I∶C)組間體重比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)。對照組主動脈管壁無斑塊形成。模型組可見明顯的主動脈斑塊形成和血管內-中膜厚度增加(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組纖維帽厚度、血管內-中膜厚度明顯減小(Plt;0.05)。與對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表達明顯增加，HDL-C、NO、SOD明顯降低(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組TC、TG、LDL-C、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表達明顯降低，HDL-C、NO、SOD明顯增加(Plt;0.05)。結論TLR3激動劑poly(I∶C)通過抑制TLR3/TRIF信號通路的激活及炎癥因子的釋放減輕ApoE-/-小鼠AS病變。

Toll樣受體3；動脈粥樣硬化；ApoE基因缺陷

動脈粥樣硬化(AS)是以脂質代謝紊亂、主動脈管壁過量脂質沉積為特征的慢性炎癥性疾病，而斑塊破裂合并血栓形成是導致多種心腦血管疾病的病理基礎[1-3]。近年來，AS發病率和死亡率逐年增加，尋找防治AS的藥物及探索AS發生發展的分子機制至關重要[4]。Toll樣受體(TLRs)是一類模式識別受體，主要表達在巨噬細胞、血管內皮細胞、T、B淋巴細胞上，而這些細胞均與AS發生發展有關[5]。TLR3是TLRs家族的重要成員，可識別雙鏈RNA(dsRNA)及其類似物poly(I∶C)發揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡等生物學功能[5,6]。研究發現，TLR3信號途徑與泡沫細胞形成、血管內皮細胞功能受損及炎性反應密切相關，從而加速AS斑塊形成[7-9]。然而，TLR3激動劑poly(I∶C)能否通過激活TLR3信號途徑發揮抗炎、降脂、延緩AS發生發展的作用目前尚未見報道。本實驗首先建立ApoE-/-小鼠AS模型，研究poly(I∶C)對AS的作用及其分子機制，以期為臨床防治AS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 6～8周齡ApoE-/-小鼠10只[購自北京大學醫學部，合格證號：SCXK(京2011-0012)]，體重20～30 g，隨機分為2組，每組5只。模型組：給予高脂飼料喂養。poly(I∶C)組：給予高脂飼料喂養，同時腹腔注射poly(I∶C)，5 μg/g，1次/d。另設相同周齡、健康雄性C57BL/6J小鼠5只為對照組，給予普通飼料喂養，腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。給藥14周后處死小鼠。

1.2 試劑與儀器 小鼠抗VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK抗體購自美國Santa Cruz 公司；細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Gibco-BRL公司；TC、TG、LDL-c、HDL-c、NO、MDA、SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所；7170A 型全自動生化分析儀購自日本日立公司；Chemi DocTM XRS+化學發光凝膠成像系統購自美國Biorad公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 生化指標:處死小鼠前，采集小鼠尾靜脈血，3 000 r/min，離心15 min，分離血清。采用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、NO、MDA、SOD水平。

1.3.2 蘇木素-伊紅(HE)染色:采用HE染色檢測小鼠主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度。剪去心臟，分離主動脈根部，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制作5 μm厚切片，HE染色，100倍光學顯微鏡下觀察組織形態，Image-ProPlus 6.0軟件測定主動脈纖維帽厚度和血管內-中膜厚度。

1.3.3 酶聯免疫吸附實驗(ELISA):采用ELISA測定血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 Western-blot:采用Western-blot檢測主動脈VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表達。提取組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量。SDS-PAGE電轉至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，化學發光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，β-actin作為內參照，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 3組體重比較 與對照組比較，模型組、poly(I∶C)組小鼠體重明顯增加，差異有統計學意義(Plt;0.05)；模型組、poly(I∶C)組小鼠體重比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)。見表1。

表1 3組體重比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05

2.2 3組主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度比較 對照組主動脈管壁無斑塊形成。與對照組比較，模型組主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度明顯增加，差異有統計學意義(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度明顯減少，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見表2。

表2 3組主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05;與模型組比較,#Plt;0.05

2.3 3組血脂水平比較 與對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C水平明顯升高，HDL-C水平明顯下降，差異有統計學意義(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組TC、TG、LDL-C水平明顯下降，HDL-C水平明顯升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見表3。

2.4 3組血清炎性因子比較 與對照組比較，模型組IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組IL-6、IL-1β、TNF-α水平明顯降低(Plt;0.05)。見表4。

表3 3組血脂水平比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05;與模型組比較,#Plt;0.05

表4 3組血清炎性因子比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05;與模型組比較,#Plt;0.05

2.5 3組血清NO、MDA、SOD比較 與對照組比較，模型組MDA水平明顯增加，NO、SOD水平明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組MDA水平明顯降低，NO、SOD水平明顯增加，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見表5。

表5 3組血清NO、MDA、SOD比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05;與模型組比較,#Plt;0.05

2.6 3組主動脈黏附分子表達比較 與對照組比較，模型組ICAM、VCAM、E-selection蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組ICAM、VCAM、E-selection蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見表6。

表6 3組主動脈黏附分子表達比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05;與模型組比較,#Plt;0.05

2.7 3組主動脈TLR3/TRIF信號通路相關分子表達比較 與對照組比較，模型組TLR3、TRIF、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(Plt;0.05)；與模型組比較，poly(I∶C)組TLR3、TRIF、p-p38、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(Plt;0.05)。見表7。

表7 3組主動脈TLR3/TRIF信號通路相關分子表達水平比較

注：與對照組比較,*Plt;0.05;與模型組比較,#Plt;0.05

3 討論

目前，冠心病、腦缺血等心腦血管疾病的發病率逐年增加，致死率和致殘率高，嚴重影響患者身心健康，而AS是導致上述疾病的主要原因。脂代謝紊亂是引起AS發生發展的主要因素，通過誘導炎性反應、損傷血管內皮等加速AS進程[10,11]。研究發現，采用高脂飼料喂養的ApoE-/-小鼠AS模型能夠高度模擬人AS進程[12,13]。本研究結果顯示，高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠14周后小鼠血脂水平明顯升高，HE染色結果可見主動脈斑塊形成和血管內-中膜厚度增加，提示造模成功，與以往研究[14]一致。

TLR3是廣泛表達在免疫細胞、胰島β細胞、神經細胞的跨膜信號轉導受體。TLR3的配體主要為病毒來源的dsRNA及其類似物多聚肌胞苷酸poly(I∶C)，通過TRIF激活和募集下游信號分子，其中最關鍵的是與炎性反應相關的重要呈遞分子MAPK系統(p38、JNK、ERK)，從而誘導IL-6、IL-1β、TNF-α等炎性因子合成和釋放[15]。Baiersdrfer等[16]研究發現，TLR3基因敲除小鼠主動脈斑塊形成明顯加快，提示TLR3在AS小鼠模型中發揮保護作用。這與之前發現的激活TLR3促進炎性因子釋放和AS形成的觀點矛盾。因此，TLR3在AS發生發展中似乎發揮雙重作用。此外，TLR3參與AS形成的具體分子機制尚未闡明。

本研究結果發現，poly(I∶C)激活TLR3能夠明顯降低ApoE-/-小鼠TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，同時主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度明顯減小(Plt;0.05)，說明poly(I∶C)能夠有效降脂、延緩AS進程。此外，與模型組比較，poly(I∶C)組MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1、P-selection、TLR3、TRIF、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表達明顯降低，HDL-C、NO、SOD明顯升高(Plt;0.05)，說明poly(I∶C)激活TLR3/TRIF通路通過抑制MAPKs家族磷酸化程度發揮抗炎作用，這可能是poly(I∶C)抗AS的機制之一。

綜上所述，poly(I∶C)能夠降低高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠血脂水平，減小主動脈纖維帽厚度、血管內-中膜厚度，其機制可能與抑制MAPK信號通路中p38、JNK、ERK蛋白磷酸化及炎性反應有關。本研究為poly(I∶C)防治AS提供了新思路和新策略。

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EffectsofTLR3activator-poly(I∶C)onatheroscleroticplaqueformationinApoE-/-miceanditsmolecularmechanism

GENGRuili*,JINHe,ZHAOPei*,etal.

*DepartmentofClinicalLaboratory,HebeiProcincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effects of TLR3 activator-poly(I∶C)on atherosclerotic plaque formation in ApoE-/- mice and its molecular mechanism.MethodsA total of 10 specific pathogen free(SPF)male ApoE-/- mice were randomly divided into model group and poly(I∶C)group,with 5 mice in each group.The mice in model group and poly(I∶C)group were fed with high fat diet and high fat diet+poly (I∶C), respectively,and the other five C57BL/6J mice fed with normal diet C57BL/6J were served as control group.After 14-week feeding,all the mice were sacrificed,then the body weight,fiber-cap thickness,vascular intima-media thickness,TC,TG,LDL-C,HDL-C,NO,MDA,SOD,IL-6,IL-1β,TNF-α,VCAM-1,ICAM-1,P-selection and the expression levels of TLR3, TRIF,p-p38,p-JNK and p-ERK were observed and compared among the three groups.ResultsThe body weight in model group was significantly higher than that in control group(Plt;0.05),but there was no significant difference in body weight between model group and poly(I∶C)group (Pgt;0.05). No aortic plaque formation was found in control group, however, obvious aortic plaque formation and increase of vascular intima-media thickness were found in model group (Plt;0.05). As compared with those in model group,the aortic plaque formation and vascular intima-media thickness were significantly decreased in poly(I∶C)group (Plt;0.05). As compared with those in control group,the levels of TC,TG,LDL-C,MDA,IL-6,IL-1β,TNF-α,VCAM-1,ICAM-1,P-selection and the expression levels of TLR3,TRIF,p-p38,p-JNK,p-ERK proteins in model group were significantly increased,however, the levels of HDL-C,NO,SOD were significantly decreased (Plt;0.05). As compared with those in model group,the levels of TC,TG,LDL-C,MDA,IL-6,IL-1β,TNF-α and the expression levels of VCAM-1,ICAM-1,P-selection,TLR3,TRIF,p-p38,p-JNK,p-ERK proteins were significantly decreased in poly(I∶C)group,however, the levels of HDL-C, NO and SOD were significantly increased (Plt;0.05).ConclusionTLR3 activator-poly(I∶C)can inhibit atherogenesis and relieve AS lesion in ApoE-/- mice by inhibiting the activation of TLR3/TRIF signal pathway and decreasing inflammatory factors release.

Toll-like acceptor 3; atherosclerosis; ApoE genetic flaw

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.24.008

050051 石家莊市，河北省人民醫院檢驗科(耿瑞麗、趙培、路永剛)；河北中醫學院國際教育學院(金賀)

R 543

A

1002-7386(2017)24-3712-04

2017-06-19)