體外沉默二牛龍牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ對(duì)舌癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

陳正崗 王樹(shù)人? 李敬華 韓金宏 王奇民 童磊 劉文君楊芳 郭慶圓 郭大偉 王瑩

1.青島市市立醫(yī)院口腔科，青島?266071；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科，上海?200011；3.膠州市人民醫(yī)院口腔科，膠州?266300；4.青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，青島?266071；5.煙臺(tái)市口腔醫(yī)院，煙臺(tái)?264008；6.青島市市立醫(yī)院耳鼻喉科，青島?266071；7.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院口腔科，濟(jì)南?250031；8.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊?261021

體外沉默二牛龍牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ對(duì)舌癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

陳正崗1,2王樹(shù)人3李敬華4韓金宏5王奇民1童磊1劉文君6楊芳1郭慶圓1郭大偉1王瑩7,8

1.青島市市立醫(yī)院口腔科，青島?266071；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面外科，上海?200011；3.膠州市人民醫(yī)院口腔科，膠州?266300；4.青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，青島?266071；5.煙臺(tái)市口腔醫(yī)院，煙臺(tái)?264008；6.青島市市立醫(yī)院耳鼻喉科，青島?266071；7.濟(jì)南市第四人民醫(yī)院口腔科，濟(jì)南?250031；8.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，濰坊?261021

目的 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，體外沉默二牛龍牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（GGTase-Ⅰ），研究其在舌癌遷移、侵襲中的作用。方法 登錄Genebank確定人GGTase-Ⅰ基因序列，針對(duì)GGTase-Ⅰ的基因序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建3條siRNA，分別將RNA干擾組（GGTase-Ⅰ?siRNA1、GGTase-Ⅰ?siRNA2、GGTase-Ⅰ?siRNA3）、陰性對(duì)照組（NC-siRNA）和空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染至舌癌細(xì)胞Cal-27，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western?blot）檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后GGTase-Ⅰ、RhoA基因的mRNA、蛋白表達(dá)；選取沉默效率最高的一組siRNA作為實(shí)驗(yàn)組，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達(dá)，GST-pull?down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GTP-RhoA蛋白的表達(dá)，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力變化，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力變化。結(jié)果 干擾后細(xì)胞的GGTase-Ⅰ?mRNA、蛋白表達(dá)明顯下降（Plt;0.05），RhoA?mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯改變，MMP-2、MMP-9、GTP-RhoA的表達(dá)下降，遷移、侵襲能力明顯下降（Plt;0.05）。結(jié)論 抑制GGTase-Ⅰ表達(dá)，可降低舌癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力，對(duì)GGTase-Ⅰ的深入研究可能為舌癌的治療提供新的有效分子靶點(diǎn)。

二牛龍牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ； RhoA； 舌癌； 遷移； 侵襲； 基質(zhì)金屬蛋白酶-2； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

舌鱗狀細(xì)胞癌（squamous?cell?carcinoma?of?tongue，TSCC）（簡(jiǎn)稱(chēng)舌癌）是最為常見(jiàn)的口腔惡性腫瘤[1]。舌癌發(fā)病率高、發(fā)展快、轉(zhuǎn)移早、致死率高，其5年生存率僅50%~60%[2-3]。腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移尤其是肺部轉(zhuǎn)移是舌癌患者的主要死亡原因，因此了解舌癌細(xì)胞侵襲能力和轉(zhuǎn)移機(jī)制，抑制癌細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散是目前舌癌的研究熱點(diǎn)。

二牛龍牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（geranylgeranyltransferase?Ⅰ，GGTase-Ⅰ）是由Fnta編碼的α亞單位和Pggtlb編碼的β亞單位組成的，對(duì)包括Rho族蛋白在內(nèi)的多種腫瘤遷移、侵襲相關(guān)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾[4]。Rho家族蛋白是小G蛋白R(shí)as超家族成員，調(diào)節(jié)細(xì)胞二磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine?diphosphate，GDP）/三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine?triphosphate，GTP）的轉(zhuǎn)換，Rho家族蛋白中的RhoA、Rac1、Cdc42被證實(shí)在多種腫瘤中高表達(dá)，參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和細(xì)胞極性改變，與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲密切相關(guān)[5]。由此推測(cè)，GGTase-Ⅰ與舌癌的遷移、侵襲密切相關(guān)，通過(guò)抑制GGTase-Ⅰ的表達(dá)，可阻斷相關(guān)蛋白活性，從而延緩腫瘤的進(jìn)展。

為明確GGTase-Ⅰ在舌癌中的表達(dá)和功能，本研究應(yīng)用RNA干擾（RNA?interference，RNAi）技術(shù)，體外設(shè)計(jì)合成人舌癌細(xì)胞Cal-27GGTase-Ⅰ基因的干擾RNA（small?interfering?RNA，siRNA）并轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，觀察其對(duì)GGTase-Ⅰ及其相關(guān)蛋白的抑制作用，探討其對(duì)舌癌細(xì)胞遷移、侵襲調(diào)控的可能機(jī)制，為今后GGTase-Ⅰ在舌癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）；1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國(guó)）；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperRealPreMix?Plus（SYBR?Green）FP?205（北京天根生化科技）；GGTase-Ⅰ、RhoA實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative?real-time?polymerase?chain?reaction，qRT-PCR）引物設(shè)計(jì)合成（TAKARA公司，日本）；內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?phosphate?dehydrogenase，GAPDH）（上海生工生物工程股份有限公司）；siRNA片段設(shè)計(jì)合成、轉(zhuǎn)染試劑、熒光標(biāo)記檢測(cè)試劑（廣州銳博生物科技有限公司）；鼠抗人GGTase-Ⅰ、RhoA（Santa公司，美國(guó)）；兔抗人GAPDH、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix?metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人舌癌細(xì)胞株Cal-27（中南大學(xué)高等研究中心）置于6?mL?1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100?mg·mL-1和鏈霉素100?mg·mL-1）中，37?℃、5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞鋪滿瓶底約80%，進(jìn)行消化，計(jì)數(shù)，按1∶2比例傳代接種在新的培養(yǎng)瓶中。

1.3 方法

1.3.1 GGTase-Ⅰ?siRNA的合成 登錄Genebank確定人GGTase-Ⅰ的基因序列，序列號(hào)為NM_005023.3，針對(duì)序列設(shè)計(jì)3條siRNA載體（表1）。

1.3.2 siRNA轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1?d，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期舌癌細(xì)胞Cal-27按照每孔5×105個(gè)接種于6孔板內(nèi)，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為30%~50%。按照操作說(shuō)明，120 μL riboFECT??CP?Buffer稀釋5 μL 20 μmol·L-1siRNA儲(chǔ)存液，混勻后加入12 μL riboFECT? CP Reagent，吹打混勻并室溫孵育0~15?min。棄6孔板內(nèi)原有培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，每孔加入1 863 μL含血清培養(yǎng)基（不含抗生素），將孵育好的混合液加入6孔板內(nèi)，使siRNA終濃度為50?nmol·L-1，混勻后將6孔板置于孵育箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)RNA干擾組（GGTase-Ⅰ?siRNA1、GGTase-Ⅰ?siRNA2、GGTase-Ⅰ?siRNA?3簡(jiǎn)寫(xiě)為siRNA1、siRNA2、siRNA3組）、熒光對(duì)照組（熒光基團(tuán)Cy3標(biāo)記siRNA）、陰性對(duì)照組（NC-siRNA）和空白對(duì)照組（只加入轉(zhuǎn)染試劑，不加入siRNA），分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24?h后，熒光對(duì)照組置于熒光顯微鏡下明確轉(zhuǎn)染效率。

表 ?1 ??針對(duì)GGTase-Ⅰ基因序列設(shè)計(jì)3條GGTase-ⅠsiRNATab1 Three GGTase-ⅠsiRNA sequences designed for GGTase-Ⅰgene

1.3.3 qRT-PCR反應(yīng) 明確轉(zhuǎn)染效率后，按上述分組，提取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和RNA干擾組轉(zhuǎn)染48?h的細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)判斷樣品的質(zhì)量和濃度。將適量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，GAPDH為內(nèi)參。GGTase-Ⅰ的上游序列：5’-CTCCTGCTGATTTCACTTTGG-3’，下游序列：5’-CCACGACAAAGTTGTGGTTCA-3’，產(chǎn)物大小為102?bp；RhoA的上游引物序列：5’-GCTGGACTCGGATTCGTTG-3’，下游引物序列：5’-TGGGAACTGGTCCTTGCTG-3’，產(chǎn)物大小為120?bp。反應(yīng)條件：95?℃預(yù)變性15?min，95?℃變性10?s，60?℃退火/延伸31?s，共40個(gè)循環(huán)。使用Stratagene熒光定量PCR儀對(duì)熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果采用相對(duì)定量法，采用2-ΔΔCt公式，計(jì)算空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和RNA干擾組的GGTase-Ⅰ、RhoA?mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，其中Ct值為循環(huán)閾值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western?blot） 提取各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)，二喹啉甲酸（bicinchoninic?acid，BCA）法定量蛋白濃度，等量上樣，電泳分離后電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2?h后，加入一抗（GAPDH，1∶1?000；GGTase-Ⅰ，1∶200；Rho?A，1∶500），4?℃孵育過(guò)夜后用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine?buffered?saline，TBST）沖洗3次，加二抗（1∶50?000），37?℃搖床孵育2?h。TBST沖洗，電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，顯色曝光，檢測(cè)條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)GGTase-Ⅰ蛋白和mRNA表達(dá)結(jié)果選取沉默效率最強(qiáng)的一組作為實(shí)驗(yàn)組，方法同前，一抗?jié)舛龋℅APDH，1∶1?000；MMP-2，1∶500；MMP-9，1∶500）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 GST-pull?down法 分別將已轉(zhuǎn)染好的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用0.5?mL預(yù)冷的裂解液冰上裂解細(xì)胞后離心10?min，取上清，BCA定量蛋白濃度，使各組蛋白等量。每組取約1?mg總蛋白加入20 μL Rho Assay Reagent 4 ℃孵育45?min，離心棄上清，500 μL Wash Buffer反復(fù)沖洗后，分別加入40 μL 2×上樣緩沖液，2 μL二硫蘇糖醇煮沸10?min，Western?blot分別檢測(cè)各組GTP-RhoA蛋白并與等量總RhoA（Total-RhoA）蛋白比較。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 6孔板底部等間距劃5條橫線，取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染48?h細(xì)胞接種于6孔板，使細(xì)胞密度隔天達(dá)到90%。將無(wú)菌直尺與孔板底部橫線垂直，200 μL槍頭保持直立沿直尺在6孔板細(xì)胞上劃痕。PBS反復(fù)沖洗3次后，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，于0、6、12、24?h觀察劃痕彌合情況并拍照測(cè)定劃痕兩側(cè)細(xì)胞的遷移距離，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將500?mg·L-1的人工基質(zhì)膠20 μL鋪于Transwell侵襲小室聚碳酯微孔膜的上表面，置37?℃?30?min使其聚成凝膠。將轉(zhuǎn)染48?h細(xì)胞消化、混勻后加入適量無(wú)血清培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為每毫升2×105個(gè)，Transwell上室加入200 μL含細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37?℃、5%CO2孵育48?h后取出，PBS清洗，棉簽去除基質(zhì)膠及孔膜上層細(xì)胞，將小室浸入甲醛室溫固定30?min，吸干上室固定液，在0.1%的結(jié)晶紫中室溫染色20?min，PBS沖洗浸泡，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過(guò)微孔的細(xì)胞數(shù)并取平均值，每組重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS?19.0軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果：紅色熒光標(biāo)記Cy3的熒光標(biāo)記組細(xì)胞siRNA轉(zhuǎn)染24?h后，細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，80%以上細(xì)胞都顯示紅色熒光，證明多數(shù)細(xì)胞都已經(jīng)轉(zhuǎn)染了siRNA（圖1）。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fig ?1 Cell?transfecfion

2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞mRNA表達(dá)量變化

轉(zhuǎn)染48?h后各組細(xì)胞的GGTase-Ⅰ、RhoA的qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示：RNA干擾組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，GGTase-Ⅰ的mRNA表達(dá)量明顯下降（Plt;0.05），RhoA的mRNA變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05）（圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染GGTase-Ⅰ?siRNA后GGTase-Ⅰ、RhoA?mRNA的表達(dá)Fig ?2 Expression?of?GGTase-Ⅰ,?RhoA?mRNA?after?GGTase-Ⅰ?siRNA?transfection

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞蛋白表達(dá)變化

轉(zhuǎn)染48?h后各組細(xì)胞蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：RNA干擾組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，GGTase-Ⅰ蛋白表達(dá)明顯下降（Plt;0.05），RhoA蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3），實(shí)驗(yàn)組的MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)明顯下降（Plt;0.05）（圖4）。

圖3 ?轉(zhuǎn)染GGTase-Ⅰ?siRNA后GGTase-Ⅰ、RhoA蛋白的表達(dá)Fig??3 ?Expression?of?GGTase-Ⅰ,?RhoA?protein?after?GGTase-Ⅰ?siRNA?transfection

圖4 轉(zhuǎn)染GGTase-Ⅰ?siRNA后MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)Fig ?4 Expression?of?MMP-2,?MMP-9?protein?after?GGTase-Ⅰ?siRNA?transfection

2.4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞RhoA蛋白的活性變化

轉(zhuǎn)染48?h后各組GST-pull?down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，GTP-RhoA（RhoA的活性形式）表達(dá)明顯下降，表明實(shí)驗(yàn)組的RhoA蛋白活性下降（Plt;0.05）（圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)染GGTase-Ⅰ?siRNA后GTP-RhoA蛋白的表達(dá)? ?Fig ?5 Expression?of?GTP-RhoA?protein?after?GGTase-Ⅰ?siRNA ??transfection

2.5 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力變化

觀察各組不同時(shí)間段劃痕愈合情況，測(cè)量劃痕寬度，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示：12、24?h實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，劃痕寬度明顯較寬（Plt;0.05）（圖6）。

2.6 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力變化

細(xì)胞接種48?h后，計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為117.35±28.64、406.22±49.17、427.56±39.28，t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯下降減少，細(xì)胞侵襲能力顯著降低（Plt;0.05）（圖7）。

圖6 轉(zhuǎn)染GGTase-Ⅰ?siRNA后細(xì)胞劃痕寬度比較? ?Fig ?6 Comparison?of?cell?scratch?width?after?GGTase-Ⅰ?siRNA transfection

圖7 轉(zhuǎn)染GGTase-Ⅰ?siRNA后細(xì)胞侵襲能力的檢測(cè) 倒置相差顯微鏡 ×?100Fig ?7 Evaluation?of?cell?invasion?after?GGTase-Ⅰ?siRNA?transfection inverted?phase?contrast?microscope ×?100

3 討論

舌癌引起死亡的主要原因是細(xì)胞內(nèi)的癌基因發(fā)生突變，腫瘤細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞黏附、基質(zhì)分解、遠(yuǎn)處侵襲過(guò)程向周?chē)M織浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Ras是人類(lèi)最易發(fā)生突變的癌基因，已被證實(shí)與多種腫瘤的形成、發(fā)展密切相關(guān)[6]。1991年Seabra等[7]證實(shí)GGTase-Ⅰ參與某些Ras蛋白的翻譯后修飾，對(duì)Rho族蛋白R(shí)hoA、RhoC、Rac1、Cdc42等蛋白進(jìn)行異戊烯化修飾，是Ras蛋白發(fā)揮活性的必需酶[8]。RhoA屬于原癌基因，在胰腺癌、大腸癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤及肝癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高，參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變和肌動(dòng)蛋白重組，與腫瘤的浸潤(rùn)、侵襲作用密切相關(guān)[9-12]。

本實(shí)驗(yàn)以舌癌細(xì)胞Cal-27為研究對(duì)象，將GGTase-ⅠsiRNA轉(zhuǎn)染入Cal-27中，采用RNA干擾技術(shù)沉默GGTase-Ⅰ的表達(dá)。結(jié)果顯示，干擾后的GGTase-Ⅰ蛋白表達(dá)明顯下降，RhoA蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯改變，GTP-RhoA蛋白表達(dá)下降，舌癌細(xì)胞劃痕寬度愈合速度明顯緩慢，Transwell侵襲小室穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，推測(cè)GGTase-Ⅰ與舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲密切有關(guān)。

研究[13]報(bào)道GGTase-Ⅰ抑制劑GGTI298可以刺激神經(jīng)干細(xì)胞再生，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。本實(shí)驗(yàn)沉默GGTase-Ⅰ后，舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。兩種結(jié)論相反，分析考慮GGTase-Ⅰ對(duì)細(xì)胞的遷移作用可能因細(xì)胞的種類(lèi)、分化不同而不同。推測(cè)GGTase-Ⅰ可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展，并同時(shí)抑制正常細(xì)胞的增殖遷移。沉默GGTase-Ⅰ的表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲，但并不抑制正常細(xì)胞的生物學(xué)行為，對(duì)某些正常細(xì)胞特別是神經(jīng)干細(xì)胞反而可以促進(jìn)其增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)中，體外沉默GGTase-Ⅰ后細(xì)胞的GGTase-I?mRNA和蛋白均顯著下降，但RhoA表達(dá)無(wú)明顯改變，表明GGTase-Ⅰ的改變?cè)谝欢〞r(shí)間內(nèi)不影響細(xì)胞RhoA基因的表達(dá)和蛋白合成。細(xì)胞RhoA表達(dá)無(wú)明顯改變，但GTP-RhoA蛋白表達(dá)下降，RhoA蛋白活性下降，分析認(rèn)為RhoA蛋白在舌癌細(xì)胞中的作用機(jī)制與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞相同[14]，在細(xì)胞核合成后需通過(guò)GGTase-Ⅰ引導(dǎo)的異戊烯化翻譯后修飾過(guò)程才能正確定位于細(xì)胞膜上，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。抑制GGTase-Ⅰ的表達(dá)，不影響舌癌細(xì)胞RhoA基因的表達(dá)和蛋白合成，但能影響RhoA在舌癌細(xì)胞內(nèi)的活性。

MMP是一組高度同源的鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，已知在腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞都可表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular?matrix，ECM），維持ECM的動(dòng)態(tài)平衡[15]。MMP-2和MMP-9同屬于明膠酶類(lèi)MMP，可以降解包括Ⅳ型膠原、明膠、纖維連接蛋白在內(nèi)的多種ECM，釋放激活相應(yīng)生長(zhǎng)因子，水解ECM和細(xì)胞基底膜，促使癌細(xì)胞遷移。MMP-2和MMP-9還通過(guò)影響血管基底膜的蛋白降解，打開(kāi)內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通路從而控制血管新生，使腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處侵襲、轉(zhuǎn)移[16-18]。MMP-2在機(jī)體各處都可表達(dá)，而MMP-9僅特定出現(xiàn)在中性粒細(xì)胞中[19]，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)MMP-2和MMP-9在結(jié)腸癌[20]、乳腺癌[21]、肺癌[22]和頭頸部鱗癌均異常活化，與腫瘤遷移、侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究[23]證實(shí)與正常組織相比，口腔鱗癌中MMP-2和MMP-9過(guò)表達(dá)，表明其與舌癌的侵襲性高度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)組前期證實(shí)[24]通過(guò)沉默RhoA基因，舌癌細(xì)胞的侵襲相關(guān)蛋白Galectin-3和MMP-9表達(dá)下降，舌癌細(xì)胞侵襲力明顯降低，推測(cè)RhoA通過(guò)MMP-9與舌癌細(xì)胞的侵襲正相關(guān)。本研究中，抑制GGTase-Ⅰ后，舌癌細(xì)胞遷移速度降低、侵襲能力下降，MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，與實(shí)驗(yàn)組前期結(jié)果符合。且抑制GGTase-Ⅰ后，RhoA的mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化，GTP-RhoA蛋白表達(dá)下降，證實(shí)GGTase-Ⅰ通過(guò)改變RhoA等促癌基因的蛋白活性，抑制其下游蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞形態(tài)和骨架調(diào)節(jié)，影響舌癌細(xì)胞的遷移和侵襲；也證實(shí)了GGTase-Ⅰ是在RhoA蛋白后期的翻譯后修飾過(guò)程中發(fā)揮作用，不改變細(xì)胞內(nèi)RhoA蛋白的細(xì)胞總量。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)抑制舌癌細(xì)胞的GGTase-Ⅰ表達(dá)，RhoA的mRNA和蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化，GTP-RhoA蛋白表達(dá)下降，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，舌癌細(xì)胞遷移、侵襲能力下降。推測(cè)GGTase-Ⅰ通過(guò)參與對(duì)RhoA等促癌轉(zhuǎn)移基因的翻譯后修飾，間接影響舌癌的侵襲，證實(shí)對(duì)GGTase-Ⅰ沉默可在一定程度上阻止舌癌的黏附、侵襲，干擾舌癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。但是，其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究探討。

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Effects of geranylgeranyltransferase Ⅰ gene silencing by RNA interference on the migration and invasion of tongue carcinoma

Chen Zhenggang1,2, Wang Shuren3, Li Jinghua4, Han Jinhong5, Wang Qimin1, Tong Lei1, Liu Wenjun6, Yang Fang1,Guo Qingyuan1, Guo Dawei1, Wang Ying7,8.
(1. Dept. of Stomatology, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China;2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3. Dept. of Stomatology, Jiaozhou People’s Hospital, Jiaozhou 266300, China; 4. Central Laboratory, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 5. Yantai Stomatological Hospital, Yantai 264008, China;6. Dept. of Ear-nose-throat, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266071, China; 7. Dept. of Stomatology, Fourth People’s Hospital of Jinan, Jinan 250031, China; 8. College of Stomatology, Weifang Medical University, Weifang 261021, China)
Supported by: National Natural Science Foundation of China (81372908); Qingdao Municipal Commission of Health and Family Planning (2014-WJZD009, 2013-WSZD011). Correspondence: Wang Ying, E-mail: 469055264@qq.com.

Objective RNA?interference?was?used?to?silence?geranylgeranyltransferase?Ⅰ(GGTase-Ⅰ)?in vitro?and?to?study?the?effect?of?GGTase-Ⅰ?on?the?migration?and?invasion?of?tongue?squamous?cancer?cells.?Methods Three?small?interfering?RNAs?(siRNA)?were?designed?according?to?the?GGTase-Ⅰ?sequence?by?Genebank?and?were?transfected?into?tongue?squamous?cancer?cells?Cal-27?to?knock?down?GGTase-Ⅰ?expression.?The?tested?cells?were?divided?into?three?groups,?as?follows:?the?RNA-interfered?groups?(GGTase-Ⅰ?siRNA1,?GGTase-Ⅰ?siRNA?2,?GGTase-Ⅰ?siRNA?3),?a?negative?control?group?(disrupted?by?random?sequence?NC-siRNA),?and?a?blank?control?group.?GGTase-Ⅰ?and?RhoA?gene?expressions?were?examined?by?quantitative?real-time?polymerase?chain?reaction?(qRT-PCR)?and?Western?blot.?The?optimum?interference?group?was?screened?by?qRT-PCR?and?Western?blot?and?was?assigned?as?the?experimental?group.?Matrix?metalloproteinase?(MMP)-2?and?MMP-9?protein?expressions?were?examined?by?Western?blot.?GTP-RhoA?expression?of?protein?was?examined?by?GST-pull?down.?The?migration?and?invasion?abilities?were?analyzed?by?wound?healing?assay?and?Transwell?motility?assay.?Results GGTase-Ⅰ?mRNA?and?protein?expression?in?Cal-27?decreased?significantly?after?transfection?of?GGTase-I?siRNA?(Plt;0.05).?No?significant?difference?of?RhoA?gene?expression?was?detected.?MMP-2,?MMP-9,?and?GTP-RhoA?protein?expressions?decreased?significantly?(Plt;0.05).?The?migration?and?invasion?abilities?were?inhibited?(Plt;0.05).?Conclusion To?inhibit?GGTase-Ⅰ?expression,?the?migration?and?invasion?abilities?of?tongue?squamous?cancer?cells?should?also?be?inhibited.?Further?studies?on?GGTase-Ⅰ?may?provide?novel?effective?molecular?targets?for?tongue?squamous?cancer?cells.

geranylgeranyltransferase?Ⅰ; ?RhoA; ?tongue?squamous?cancer; ?migration; ?invasion; ?matrix?metalloproteinase-2; ?matrix?metalloproteinase-9

R?78

A

10.7518/hxkq.2017.06.003

2016-12-17；

2017-09-05

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81372908）；青島市衛(wèi)計(jì)委計(jì)劃項(xiàng)目（2014-WJZD009，2013-WSZD011）

陳正崗，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：chenzhg1973@163.com

王瑩，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：469055264@qq.com

（本文采編 ??石冰）