雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表達及抑菌研究

許冬梅，武晉孝，田文霞，閆 芳，高文偉，馬海利，鄭明學，程志學，趙宇軍

雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的原核表達及抑菌研究

許冬梅1，武晉孝2，田文霞3，閆 芳3，高文偉3，馬海利3，鄭明學3，程志學3，趙宇軍3

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西省飼料獸藥檢查所，山西太原030027；3.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

為了研究雞Ⅱ型抗菌肽LEAP-2的體外表達產物的活性，試驗進行了肝臟樣品無菌采集，基因的克隆及密碼子優化和表達，以表達產物對致病菌做紙片法藥敏試驗，判斷其抑菌作用。結果表明，試驗經低溫處理獲得了較好的肝臟總RNA，克隆并優化了雞LEAP-2基因；經誘導得到了表達產物，形式為包涵體；抑菌試驗表明，表達產物對16株分離致病菌具有抑制作用。

雞；LEAP-2；抗菌肽；原核表達；抑菌試驗

雞LEAP-2，是肝臟表達Ⅱ型抗菌肽，為肝臟中產生并微量存在的一種抗菌肽[1-8]。在肉雞和蛋雞養殖中，細菌感染和繼發感染的治療是一類比較棘手的問題。現代生活中，人們膳食結構的改變和對飲食質量的要求使得肉雞和蛋雞的生產逐年增加，其幅度之大可以用指數增長來形容。而動物的大量集中和高密度飼養使得病原菌有了很好的滋生條件，同時藥物的殘留及有效的抗生素在獸醫領域的禁用，導致了養雞生產中針對細菌感染的藥物選擇越來越少，雞LEAP-2抗菌肽的發現為解決這種困境提供了一種新的思路[9-16]。

本研究針對從雞肝臟中克隆并優化了密碼子的LEAP-2進行了原核表達，旨在能夠提供一種可供選擇的抗菌產品來緩解生產中病原菌的困擾。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 5只2周齡健康紅布羅雞，購自太谷縣肉雞養殖場。4株致病性大腸桿菌來源于山西農業大學動物科技學院預防系獸醫微生物實驗室分離菌株。

1.1.2 主要試劑 DEPC溶液及DNA凝膠回收試劑盒、反轉錄試劑盒Code#AT301-02、質粒小提試劑盒、DNA限制性內切酶Eco RI和Not I、反轉錄試劑盒E.coli DH5α，均購自天根生化科技（北京）有限公司；ITrizol試劑（貨號15596026），購自北京索萊寶科技有限公司；Trans5K DNAmarker，購自北京全式金生物技術有限公司；低分子蛋白Marker，購自上海酶聯生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據NCBI基因庫中相關的序列設計引物，上游、下游引物序列分別為：LEAP-2 F （sense）：5′-GAA TTC ATG CAC TGC CT-3′，LEAP-2 R （anti-sense）：5′-GCG GCC GCT CAC TCGGACG-3′，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 肉雞肝臟總RNA的提取 口腔內剪斷雞眼兩側動脈，放血處死肉雞，將整只雞浸泡于70%的乙醇中5 min，取出，在超凈臺上打開腹腔，剪取肝臟，于DEPC處理過的平皿中剪成碎片，每份稱取50～100 mg，保存于液氮中；另取一份放于-20℃冰箱內提前降溫的研缽內進行研磨，磨到溶液變得透明；將液體轉移到1.5 mL的EP管中，取200μL氯仿加入，振蕩30 s后靜置10 min[5-7]，RNA的提取處理參照《分子克隆手冊》（2004-1）進行。

1.2.3 LEAP-2基因擴增 基因擴增的體系：上游引物 1 pmol，2×TSReaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNA 5 μL，RNase Free ddH2O至20μL。PCR反應條件為：42℃30 min，85℃5 s，放置在-20℃備用。LEAP-2基因PCR擴增的反應體系：10×PCR Buffer 2μL，dNTPMixture 1.6μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.2μL，cDNA 1μL，ddH2O 13.2μL。PCR條件：94℃預變性3 min；95 ℃變性 1 min，52 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環；擴增產物連接到T載體送交上海生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 LEAP-2原核表達 鑒于雞LEAP-2基因為260 bp左右，交上海生物工程技術服務有限公司合成，使用載體為PGEX-6P-1，合成之前進行密碼子優化，LEAP-2基因與載體鏈接使用HindⅢ與BamhⅠ定向連接，命名為PGEX-6P-LEAP-2，IPTG 0.8 moL/L，37℃2 h，誘導菌離心后經超聲波裂解，再經變性復性之后經GST標簽柱層析進行鑒定[3，6-7，15]。

1.2.5 紙片法檢測表達產物的抑菌作用 制備直徑為3mm的定量濾紙紙片，浸入質量濃度為0.1mg/L的表達產物純化液中，30 s后取出備用；將山西農業大學動物科技學院預防系獸醫微生物實驗室分離的雞4株致病性大腸桿菌接種至營養肉湯，37℃培養8 h，將肉湯以三角玻璃棒均勻涂布于營養瓊脂表面，共4個平皿，將紙片輕輕貼附于瓊脂表面，37℃培養過夜觀察結果，測量抑菌環直徑，并記錄。

2 結果與分析

2.1 肉雞肝臟mRNA提取

肝臟經低溫處理研磨后進行電泳，結果顯示，肝臟總RNA提取效果良好。

2.2 LEAP-2基因擴增結果

經PCR擴增后獲得了目標基因，大小為263 bp，經測序并于NCBI基因庫中進行BLAST同源性序列檢索，確定為LEAP-2基因（圖1）。

2.3 LEAP-2表達

密碼子優化后的合成基因經誘導及經過層析柱純化，主要存在于沉淀中，大小為33 ku（圖2）。

2.4 紙片法抑菌

經37℃培養后，對4個平皿進行抑菌圈直徑測量，表達蛋白的復性產物對4株山西農業大學動物科技學院預防系獸醫微生物實驗室保存菌株的抑菌圈均在6 mm左右，結果表明，該表達產物具有一定的抑菌作用，其結果列于表1。

表1 表達產物對4株致病性大腸桿菌的抑制作用 mm

3 討論

雞LEAP-2是一類體內表達量很小的多肽，在實際應用中直接從動物體提取，成本較高，較難在實際生產中得到應用，利用生物技術進行制備是一種新的選擇[17-18]。

肝臟總RNA的提取相對來說比較困難，因為在肝臟內有較其他組織中多的RNA酶，在提取過程中注意對低溫和操作的嚴謹性有較高的要求。筆者在綜合了其他組織RNA提取的文獻資料后，經過對幾種不同方法的比較，得到了比較有效的肝臟總RNA。

很多組織可以產生抗菌肽，肝臟表達的抗菌肽具有一定的使用前景[19-20]，從產生部位來看，可以直接對經由消化道進入血液系統的微生物進行第一時間處理，但其表達量的限制，使得直接提取成本較高，本研究的表達雖然嘗試了體外表達的生物學技術，然而表達的效果依然不能有效降低生產成本。因此，對該抗菌肽的生產應用技術措施仍有待繼續探索。

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Study on Prokaryotic Expression and Bacteriostasis Activity of Chicken Type II Antimicrobial Peptide LEAP-2

XUDongmei1，WUJinxiao2，TIANWenxia3，YANFang3，GAOWenwei3，MA Haili3，ZHENGMingxue3，CHENGZhixue3，ZHAOYujun3
（1.Collegeof Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Feed and Veterinary Drug Inspection Department of Shanxi Province，Taiyuan 030027，China；3.Collegeof Animal Science and Veterinary，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Todeterminetheantibiotic activity of chicken LEAP-2 expressed in vitro,the geneof LEAP-2 was applied by RT-PCR instructed by the sequence NM_001001606,and then wasdone with codon optimization and cloned into pGEX-6P-1.After expressed in E.coli DE3,the expressed product was managed to do antibiotic experiment by bacteriostasis circle test.Theresults showed that chicken LEAP-2 gene had a satisfied gain under liquid nitrogen processing,LEAP-2 was cloned and after optimized then expressed by incusion bodiestype,antimicrobial susceptibility test result showed that 16 E.coli strain owned in laboratory was sensitived tothe protein.

chicken;LEAP-2;antimicrobial peptide;prokaryotic expression;bacteriostatic test

S831.5

A

1002-2481（2017）12-1998-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.24

2017-08-29

山西省科技攻關項目（20140311021-3）

許冬梅（1974-），女，山西太谷人，講師，碩士，主要從事動物遺傳及機制研究工作。趙宇軍為通信作者。