玉米干種子基因組DNA提取方法的改進(jìn)

董永軍 ，王陸軍 ，郝建平 ，王艷梅 ，李培良 ，王創(chuàng)云 ，鄧艷芳 ，周 瓊 ，李志敏，龐 冰，張婷婷

玉米干種子基因組DNA提取方法的改進(jìn)

董永軍1，王陸軍2，3，郝建平1，王艷梅2，3，李培良2，3，王創(chuàng)云2，3，鄧艷芳3，周 瓊3，李志敏3，龐 冰1，張婷婷1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031；3.山西省玉米工程技術(shù)研究中心，山西太原030031）

為了實(shí)現(xiàn)玉米干種子基因組DNA快速提取，針對(duì)玉米干種子淀粉含量高的特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)核酸CTAB提取方法進(jìn)行了優(yōu)化與改良，將提取的DNA進(jìn)行分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，DNA的OD260/OD280值為1.79～1.95，OD260/OD230值為1.90～2.15；瓊脂糖凝膠電泳圖譜清晰，條帶無(wú)拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明采用改良方法提取的DNA質(zhì)量高、無(wú)降解。以改良方法提取的DNA樣品作為模板進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)試驗(yàn)，結(jié)果清晰穩(wěn)定，進(jìn)一步證明采用改良CTAB法直接從玉米干種子中提取的DNA可以滿足SSR和SNP等分子試驗(yàn)的要求。

玉米；干種子；DNA；CTAB

近年來(lái)，隨著分子育種技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，玉米育種進(jìn)程顯著加快，分子育種越來(lái)越受到廣大研究者的青睞。提取高質(zhì)量的核酸是進(jìn)行玉米分子育種研究的基礎(chǔ)，核酸的質(zhì)量對(duì)下游分子試驗(yàn)的影響至關(guān)重要。

目前，常用來(lái)提取植物基因組DNA的方法有CTAB 法[1-3]、SDS 法[4-5]、酶法[6]和高鹽提取法[7]等。其中，CTAB法仍被許多實(shí)驗(yàn)室用來(lái)提取玉米基因組DNA，提取材料一部分是玉米嫩葉，提取DNA時(shí)需要進(jìn)行發(fā)芽、液氮研磨，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；另一部分是玉米干種子，提取周期長(zhǎng)，質(zhì)量欠佳。分子育種研究的樣品材料多數(shù)為干種子，而其中含有大量的多糖、淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)[8]，如何快速有效地去除這些物質(zhì)，從玉米干種子中提取到高質(zhì)量的基因組DNA，是分子育種研究的關(guān)鍵技術(shù)。

本研究在傳統(tǒng)的CTAB法的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)提取試劑、步驟等進(jìn)行優(yōu)化，旨在集成一種簡(jiǎn)單、快速而且可以直接從玉米干種子中提取高質(zhì)量基因組DNA的新方法，以滿足玉米種子純度快速檢測(cè)的需要。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 玉米選自市場(chǎng)上主要的10個(gè)雜交品種，其來(lái)源列于表1。

表1 玉米品種及來(lái)源

1.1.2 試驗(yàn)試劑 2%CTAB緩沖液，氯仿∶異戊醇（24∶1），蛋白酶K，70%乙醇，異丙醇等。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 高速冷凍離心機(jī)（eppendorf中國(guó)有限公司），PCR儀（eppendorf中國(guó)有限公司），全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），微量紫外分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展有限公司），垂直電泳儀（北京東方君意電泳設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)CTAB核酸提取方法 其參照SAGHAIMAROOF等[9]的方法進(jìn)行。

1.2.2 改良CTAB玉米干種子基因組DNA提取方法 破壁，取一粒玉米干種子放入2 mL離心管中，加直徑6 mm鋼珠1粒，在70 Hz全自動(dòng)樣品快速研磨儀中研磨3 min；裂解，加入800μL預(yù)熱CTAB緩沖液和 20μL蛋白酶 K，65℃水浴 10 min，13 000 r/min離心1 min，取上清；提純，加入氯仿∶異戊醇（24∶1）800 μL，振蕩 3 min，13 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液置于離心管中，重復(fù)提純1次；沉淀，加入0.8倍體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃靜置 10 min，13 000 r/min 4 ℃離心 5 min，棄上清液；洗滌，用70%的乙醇洗滌2次；保存，將DNA樣品風(fēng)干，加100μL TE Buffer（含RNA酶），37℃保溫箱溫育2 h，置于-20℃保存。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè) 用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量玉米基因組DNA的OD260/OD280和OD260/OD230值；將DNA樣品質(zhì)量濃度統(tǒng)一稀釋到500 ng/μL，取5μL DNA樣品進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 分子標(biāo)記檢測(cè) 選用SSR分子標(biāo)記對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，PCR體系為20μL，DNA模板質(zhì)量濃度為20 ng/μL，檢測(cè)方法參考郭景倫等[10]的方法進(jìn)行。SSR引物為 Bnlg1401，序列為 F:5′-CACTCGGTTTTTGCTTAGCC-3′，R:5′-GTGTCGTC GAGTGCATGC-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米基因組DNA的純度和濃度

利用微量紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量改良CTAB法和傳統(tǒng)CTAB法提取的玉米干種子DNA的OD值，其測(cè)量結(jié)果列于表2。

表2 采用改良CTAB法和傳統(tǒng)CTAB法所得DNA分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，改良CTAB法提取的玉米干種子DNA，其OD260/OD280值介于1.79～1.95，OD260/OD230值介于1.90～2.15，DNA質(zhì)量濃度介于619.92～986.79 ng/μL；傳統(tǒng)CTAB法提取的玉米干種子DNA，其OD260/OD280值介于1.83～2.05，OD260/OD230值介1.89～2.11，DNA質(zhì)量濃度介于 964.41～1 382.64 ng/μL。當(dāng) DNA的 OD260/OD280值為 1.80～1.90，OD260/OD230值在2.00以上時(shí)，其質(zhì)量是最理想的[11]。

從圖1可以看出，改良CTAB法提取DNA樣品的OD260/OD280平均值為1.88，方差為0.001 9；OD260/OD230平均值為2.04，方差為0.004 9。傳統(tǒng)CTAB法提取DNA的OD260/OD280平均值為1.94，方差為0.004 8；OD260/OD230平均值為1.97，方差為0.006 2。傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA樣品OD260/OD280值和OD260/OD230值的偏離度較大，說(shuō)明利用改良CTAB法提取的DNA樣品分子結(jié)構(gòu)完整，純度高，質(zhì)量穩(wěn)定，能夠滿足玉米分子檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)DNA質(zhì)量的要求。改良CTAB法提取的干種子DNA質(zhì)量濃度整體比傳統(tǒng)CTAB法低約300 ng/μL，但其質(zhì)量較高，對(duì)后期實(shí)驗(yàn)影響較小。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

玉米干種子基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，1～10號(hào)樣品，電泳條帶無(wú)拖尾，DNA無(wú)明顯降解現(xiàn)象，帶型整齊一致；11～20樣品，電泳條帶彌散，有輕度拖尾現(xiàn)象，存在RNA污染。表明改良CTAB法比傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA純度更高，結(jié)構(gòu)更完整，質(zhì)量更穩(wěn)定。

2.3 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

以改良CTAB法提取的玉米基因組DNA作模板進(jìn)行SSR分子標(biāo)記檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，電泳條帶穩(wěn)定、清晰、無(wú)雜帶，根據(jù)條帶的遷移位置可以清楚區(qū)分不同品種之間的差異。結(jié)果表明，利用改良CTAB法提取的玉米干種子DNA完全可以滿足SSR分子標(biāo)記對(duì)玉米的真實(shí)性、一致性、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等研究的要求[12-13]。

3 討論

與傳統(tǒng)CTAB法相比，改良CTAB法采用全自動(dòng)樣品研磨儀對(duì)玉米材料進(jìn)行機(jī)械粉碎，放棄了液氮研磨，縮短了裂解時(shí)間，簡(jiǎn)化了提取過(guò)程，提取周期小于2 h；提取過(guò)程不需添加β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等有毒化學(xué)試劑，減少了對(duì)環(huán)境的污染；在提取溶液的配制上，提高Tris-HCl和EDTA的濃度，強(qiáng)化了核酸與其他物質(zhì)的分離。另外，本研究改良CTAB方法在加入氯仿∶異戊醇之前加入少量蛋白酶K，可以增強(qiáng)細(xì)胞膜的破壞、加速核膜的裂解。本試驗(yàn)嘗試省略一步氯仿∶異戊醇的提取步驟，雖然可以從樣品中提取到DNA，但是所得到的DNA含有大量的雜質(zhì)，純度遠(yuǎn)低于2步氯仿∶異戊醇的提取效果。因此，保留了2步氯仿∶異戊醇的提取步驟，以確保DNA提取產(chǎn)物的純度和質(zhì)量。

經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，傳統(tǒng)CTAB法從玉米干種子中提取的DNA樣品，其OD260/OD280值和OD260/OD230值有70%的樣品偏離最佳值區(qū)間，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于傳統(tǒng)CTAB法提取DNA的過(guò)程中，RNA去除不徹底，導(dǎo)致OD260/OD280的值偏高；去除雜質(zhì)不干凈，存在糖、鹽、無(wú)機(jī)離子和其他不利因素的污染，導(dǎo)致OD260/OD230值偏低。傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA濃度比改良CTAB法的高，是由于DNA提取過(guò)程中裂解時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致提取的DNA量多。

隨著玉米育種進(jìn)入分子時(shí)代，高效且保質(zhì)保量提取玉米基因組DNA是進(jìn)行分子育種的首要條件。本試驗(yàn)研究的改良CTAB法可直接提取玉米干種子DNA，適用于SSR，SNP分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建、QTL分析等研究[14-18]，其提取的DNA質(zhì)量和濃度完全可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

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Improvement of Genome DNA Extraction Method from Maize Dry Seeds

DONGYongjun1，WANGLujun2，3，HAOJianping1，WANGYanmei2，3，LIPeiliang2，3，WANGChuangyun2，3，DENGYanfang3，ZHOUQiong3，LIZhimin3，PANGBing1，ZHANGTingting1
（1.Collegeof Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Instituteof Crop Sciences，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Shanxi Corn Engineering Technology Research Center，Taiyuan 030031，China）

To realize the rapid extraction of maize dry seed genomic DNA,according to the characteristics of high starch content in maize dry seeds,this study optimized and improved the extraction method of traditional nucleic acid CTAB,and analyzed the extracted DNA by spectrophotometer and agarose gel electrophoresis.The results showed that the OD260/OD280value of DNA was between 1.79-1.95,and the OD260/OD230value was between 1.90-2.15.The gel electrophoresis pattern was clear and the band was no tailing,which illustrated that the improved DNA was high degradation.DNA samples extracted by the new method were used as templates to detect the molecular markers,the results were clear and stable.It further proved that DNA extracted from maize dry seeds by modified CTABmethod could meet the requirements of SSRand SNP.

maize;dry seed;DNA;CTAB

S513

A

1002-2481（2017）12-1903-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.01

2017-10-12

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA630001）；山西省工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（201605D141005）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種業(yè)發(fā)展專項(xiàng)（2016ZYZX08）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201603D221002-7）；山西省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項(xiàng)（201604D131037）；山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201703D221001-2）

董永軍（1990-），男，山西岢嵐人，在讀碩士，研究方向：玉米分子輔助遺傳育種。王陸軍、郝建平為通信作者。