耐寒月季染色體制片技術(shù)與核型分析

于新海++李濛++周紅昕++才源

摘 要：通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由吉林省生物研究所提供的耐寒月季其核型組成為K（2n）=2x=14m，通過閱讀文獻(xiàn)確定薔薇屬植物的染色體基數(shù)為7，即該材料為具有14條染色體的2倍體植株。目前普遍的現(xiàn)代栽培觀賞月季均為四倍體植株，無法與該耐寒月季進(jìn)行雜交育種。而該耐寒月季具有耐寒性直立性好、抗病性強(qiáng)、花期長、花型優(yōu)美等寶貴特點(diǎn)，所以通過生物技術(shù)手段進(jìn)行染色體倍數(shù)確定，為后續(xù)獲得四倍體植株和與現(xiàn)代四倍體觀賞月季雜交育種奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：耐寒月季；染色體；核型分析

中圖分類號：K915 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20171132013

月季花屬于薔薇屬（Rosa L.）植物，由于其花期長、花色豐富，品種多樣，深得人們的喜愛[1]。在很久之前就已成為世界著名的觀賞植物，同時(shí)在園林綠化方面也得到廣泛的應(yīng)用。但由于東北很多地區(qū)的氣候條件的特殊性，冬季寒冷干燥、春季經(jīng)常出現(xiàn)倒春寒等氣候，所以具有優(yōu)良的抗旱性、抗寒性同時(shí)兼具觀賞性的月季品種少之又少[2]。本實(shí)驗(yàn)中的薔薇屬植物耐寒月季，由吉林省生物研究所提供，此品種月季耐寒性極好，具有與野生薔薇資源共同的有點(diǎn)：抗病性和直立性生長強(qiáng)，并且其花期可以從5月份延續(xù)到10月中旬左右，花色為粉色，多瓣，在冬季可完全裸露過冬，在第2年春季又可從地上部分繼續(xù)生長[3]。但品種過于單一，像這種花量大、花期長、耐寒性好、抗病性強(qiáng)的優(yōu)良月季，其花色只有粉色花一種。為了豐富這種優(yōu)良性狀月季的品種，特此做了雜交試驗(yàn)的基礎(chǔ)研究：染色體倍數(shù)分析[5]。

由于月季花的須根木質(zhì)化程度高，根尖部分很難找到處于分生期的嫩芽，所以本次實(shí)驗(yàn)采用的實(shí)驗(yàn)材料為未形成花蕾的嫩莖部分[6]。

1 材料與方法

1.1 取材時(shí)間、地點(diǎn)

本次所取材料均為生長年齡長達(dá)5a以上的樹狀粉花耐寒月季的未形成花蕾的嫩莖[3]，分別與上午09：00、10：00、11：00點(diǎn)進(jìn)行取材[7]，取材地點(diǎn)為吉林省生物研究所實(shí)驗(yàn)園區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品

8-羥基喹啉25g，無水乙醇分析純 500mL，冰醋酸 分析純500ml，鹽酸分析純 500ml，堿性品紅，石碳酸分析純500g，甲醛分析純 500ml，山梨醇 25g，奧林巴斯顯微鏡cx31，METTLER TOLEDO 電子天平，海爾4℃恒溫冰箱。

2mmol/L的8-羥基喹啉水溶液：準(zhǔn)確稱取0.29g8-羥基喹啉，用5ml5mol/L的鹽酸進(jìn)行溶解，然后在1L的容量瓶中用蒸餾水進(jìn)行定容。

卡諾固定液：量取無水乙醇750mL、冰乙酸250mL溶于一起。

卡寶品紅溶液：先分別配成3種原液，再配成染色液[8]。

A液：準(zhǔn)確稱取堿性品紅3g，溶解于100mL的70%乙醇溶液中。可放于4℃恒溫冰箱內(nèi)長期保存，以備以后使用。

B液：量取A液10mL，加入 90mL的5%苯酚水溶液中。B液在2周內(nèi)使用。

C液：量取B液55mL，分別加入6mL的乙酸和甲醛溶液。

染色液：量取C液25mL，加入到75mL，45%的乙酸溶液中。稱取1.8g山梨醇溶解于染色液中（此染色液可長期保存，以備后續(xù)使用）[9]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)材料處理

1.2.2.1 取材

本次實(shí)驗(yàn)是在7月份中選擇天氣晴朗的上午09：00、10：00和11：00不同時(shí)間段取樣。所取樣均為生長旺盛枝條未形成花蕾的莖尖部分，約0.5cm左右。將索取嫩莖去皮處理后切成薄片[10]。

1.2.2.2 預(yù)處理

將切好的嫩莖段用2mmol/L的8-羥基喹啉水溶液分別處理2～3h。

1.2.2.3 樣品固定

將經(jīng)過預(yù)處理后的嫩莖切片用蒸餾水水洗2～3次后放入卡諾固定液中進(jìn)行固定。固定條件為4℃，60min[11]。

1.2.2.4 樣品解離

本次實(shí)驗(yàn)是通過酸解法進(jìn)行樣品解離，用5mol/L的鹽酸常溫解離10min，也可用1mol/L的鹽酸在60℃水浴鍋中解離10min，經(jīng)試驗(yàn)對比效果一致[12]。

1.2.2.5 染色

將進(jìn)行解離后的嫩莖用蒸餾水反復(fù)沖洗3～5次后，放入卡寶品紅染色液中進(jìn)行染色2～3h。

1.2.2.6 制片

采用常規(guī)壓片法，用鑷子取經(jīng)過染色的嫩莖段至于載玻片上，用濾紙一段吸取多余的水分然后蓋上蓋玻片。在固定好蓋玻片后，用鑷子另一端輕輕敲打蓋玻片，使材料細(xì)胞分散均勻，以便于顯微鏡下觀看[13]。

1.2.2.7 觀察

將壓好的載玻片置于低倍鏡下進(jìn)行觀察，選擇好合適的區(qū)域后再轉(zhuǎn)入高倍鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

選擇10個(gè)分散良好且處于中期細(xì)胞的材料進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，確定上午10：00，11：00所取樣中均有處于分裂中期的細(xì)胞且本品種耐寒月季共有14條染色體。核型公式為 K（2n）=2x=14m，未發(fā)現(xiàn)有隨體。染色體形態(tài)見圖1。

由吉林省生物研究所提供的耐寒月季為2倍體植株，無法進(jìn)行與現(xiàn)代栽培的4倍體月季植株的雜交育種實(shí)驗(yàn)。所以需要通過染色體加倍技術(shù)，獲得此品種的4倍體植株后再進(jìn)行雜交育種實(shí)驗(yàn)，從而可以完成新品種的選育工作[14]。

3 總結(jié)

經(jīng)過染色體倍數(shù)分析得出該品種耐寒月季為2倍體，而現(xiàn)代月季多為4倍體，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可通過秋水仙素處理等方法使染色體加倍，得到4倍體植株。從而可以與花色豐富的現(xiàn)代月季進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，并篩選出理想的耐寒、花色豐富、抗病性與直立性好的月季花[15]。本次實(shí)驗(yàn)為克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和性和不可育性奠定基礎(chǔ)；染色體倍數(shù)及形態(tài)在一定條件下可以影響該物種的進(jìn)化過程，例如染色體加倍就是一個(gè)重要因素，這對于種群與種間雜交后代的鑒定以及親緣關(guān)系研究具有重要意義[16]。此外此種耐寒月季的種子萌發(fā)率極低，無法實(shí)現(xiàn)與觀賞性較好的4倍體優(yōu)良月季品種進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。因此，如何克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性及不育性，培育出觀賞性好且抗性強(qiáng)的品種是當(dāng)前育種工作亟待解決的關(guān)鍵問題。endprint

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