淺論葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的制備及其靶向性

胡丹丹，李 磊，孟艷秋，寧偎鋒

（沈陽化工大學，遼寧 沈陽 110142）

淺論葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的制備及其靶向性

胡丹丹，李 磊，孟艷秋，寧偎鋒

（沈陽化工大學，遼寧 沈陽 110142）

目的：探討葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒（Folate-BSANP）的制備及其靶向性。方法：利用去溶劑化法制備白蛋白納米粒（BSANP），再于堿性的環(huán)境下利用葉酸活性脂與BSANP表面的氨基反應，制得Folate-BSANP。以熒光定量法測定納米粒的濃度、粒徑、培育的時間、游離葉酸對腫瘤細胞攝取Folate-BSANP的影響程度。結果：隨著納米粒濃度的增加、粒徑的增大，培養(yǎng)時間的延長及腫瘤細胞外游離葉酸含量的減少，腫瘤細胞攝取Folate-BSANP的速率逐漸加快。結論：Folate-BSANP可通過腫瘤細胞表面的葉酸受體介導進入腫瘤細胞，明顯靶向于葉酸受體豐富的腫瘤細胞。

葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒；制備；靶向性

惡性腫瘤是目前全球致死率最高的疾病，是導致人類死亡的三大疾病之首（其余兩種疾病為心臟病和腦卒中）。傳統(tǒng)治療惡性腫瘤的方法如放療和化療，靶向性較低，在殺死腫瘤細胞的同時也會殺傷健康細胞，治療的有效率和安全性均較低。近年來，隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，臨床上逐漸采用生化調(diào)節(jié)劑聯(lián)合化療并以介入治療的新型療法治療惡性腫瘤，以達到殺滅腫瘤細胞和減少副作用的目的[1]。研究發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細胞（如肺癌細胞、結腸癌細胞、骨癌細胞等）的細胞膜上均存在較多的葉酸受體。這為利用葉酸受體對腫瘤細胞進行靶向給藥提供了基礎[2]。在本次研究中，筆者主要探討Folate-BSANP的制備及其靶向性。

1 材料與方法

1）儀器：FA1204B電子分析天平，UV752N紫外可見分光光度計[3]，馬爾文激光粒度測試儀，透射電子顯微鏡，熒光分光光度計，CO2恒溫培養(yǎng)箱，細胞粉碎超聲機，恒溫磁力攪拌器，臺式水浴恒溫振蕩器，熒光顯微鏡。2）試劑：牛血清蛋白（BSA），葉酸( Sigma)，胰蛋白酶，二環(huán)己基碳二亞胺( Acros)，N-羥基琥珀酰亞胺( Sigma)，異硫氰酸熒光素( Sigma)，人腎癌786-0細胞，無葉酸細胞培養(yǎng)液(Gibco)等。

2 方法

2.1 BSANP的制備

首先稱量白蛋白100mg，加入1ml的水進行溶解，放入25℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌2 h，將溶液的pH值調(diào)至8～9。使用恒流泵將4ml濃度為95%的乙醇溶液在8min內(nèi)緩慢地加入到上述溶液中，并在其中加入濃度為8%的戊二醛溶液20 μl，在室溫下進行交聯(lián)固化反應。固化完畢后繼續(xù)攪拌溶液。攪拌完成后，靜置12 h。12 h后，在轉速為15000 r/min的離心機中進行10min的離心處理，傾去上清液，加水恢復至其原來的體積，再進行10min的超聲處理，即得到BSANP膠體溶液。

2.2 葉酸活性脂的制備

將0.5ml的三乙胺緩慢地加入到20ml的二甲亞砜溶液中，靜置10min左右使其冷卻。在冷卻好的二甲亞砜溶液中加入1mg的葉酸粉末，用玻璃棒緩慢攪拌使其充分溶解。在溶液 中加入適量的二環(huán)己基碳二亞胺和 N-羥基琥珀酰亞胺，在室溫的條件下充分反應12 h。對上述溶液進行過濾，經(jīng)減壓和濃縮處理后，使其成為干燥的粉末狀物質(zhì)。用乙醚將溶液中的剩余雜質(zhì)析出，得到淡黃色的粉末。該淡黃色粉末即為葉酸活性脂[4]。

2.3 Folate-BSANP的制備

取適量BSANP膠體混懸液，用緩沖溶液將混懸液的pH值調(diào)至9。將之前制備好的淡黃色粉末（葉酸活性脂）溶解，加入到混懸液中，攪拌均勻。用葡萄糖凝膠柱對上述混懸液進行上柱分離，收集先留下來的有白色光亮部分的液體，即可得到Folate-BSANP膠體混懸液。

2.4 BSANP和Folate-BSANP的粒徑大小與分布測定

在25℃的室溫條件下，取兩種膠體溶液（BSANP膠體溶液和Folate-BSANP膠體溶液）適量，分別于其中加入1 l的蒸餾水，然后運用馬爾文激光粒度測試儀分別測試BSANP與Folate-BSANP的粒徑大小及其分布。

2.5 Folate-BSANP偶聯(lián)葉酸程度的測試

測定5批Folate-BSANP 胰蛋白酶水解液在358 nm處的吸光度，在相應的標準曲線上即可得到單位質(zhì)量BSA上偶聯(lián)葉酸的量，并采用2-三硝基苯磺酸顯色法、4-三硝基苯磺酸顯色法以及6-三硝基苯磺酸顯色法[5]測定BSANP表面活性氨基的含量。

2.6 腫瘤細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的實驗

采用人腎癌786-0細胞作為模型細胞，用熒光素對模型細胞進行熒光標記，以熒光定量的方法考察人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的情況。細胞培養(yǎng)的方法：取人腎癌786-0細胞適量，接種到24孔板上，每孔約有5×103個細胞。接種24 h后，更換培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，用由200ml/L的小牛血清配置的培養(yǎng)基對人腎癌786-0細胞進行貼壁培養(yǎng)。

2.6.1 測試納米粒濃度對腫瘤細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響 在預培養(yǎng)的人腎癌786-0細胞中分別加入不同濃度的Folate-BSANP膠體混懸液與BSANP膠體混懸液1.5ml，培養(yǎng)2.5 h。

2.6.2 測試培育時間對腫瘤細胞攝取 Folate-BSANP與BSANP的影響 在預培養(yǎng)的人腎癌786-0細胞培養(yǎng)孔中分別加入濃度為0.5mg/ml的Folate-BSANP膠體混懸液與BSANP膠體混懸液各1ml，分別培養(yǎng)0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h和 4 h。

2.6.3 測試游離葉酸對腫瘤細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響 在預培養(yǎng)的人腎癌786-0細胞培養(yǎng)孔中分別加入含有游離葉酸的濃度為0.5mg/ml的Folate-BSANP膠體混懸液與BSANP膠體混懸液各1ml，培養(yǎng)4 h。4 h后，用冷磷酸緩沖液對用上述方法培養(yǎng)的人腎癌786-0細胞進行洗滌1min，再將細胞破碎，運用熒光粉光度計測定細胞溶解液的熒光（λex= 480 nm λem=530 nm）。

2.6.4 對腫瘤細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的定性觀察 取人腎癌786-0細胞懸液適量，分別將其鋪在載玻片上。在其中分別加入濃度相同的Folate-BSANP混懸液與BSANP混懸液，培養(yǎng)4 h。用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉緩沖液對人腎癌786-0細胞進行洗滌，然后固定人腎癌786-0細胞。運用熒光顯微鏡觀察并記錄腫瘤細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的情況。

3 結果

3.1 Folate-BSANP與BSANP的形態(tài)、粒徑大小及分布情況

用透射電子顯微鏡觀察Folate-BSANP與BSANP，結果顯示兩種納米粒均呈圓形，形態(tài)均十分完整，且大小均勻。運用激光散射法測定BSANP的平均粒徑為62 nm，其中超過90%的BSANP 其粒徑小于121 nm。Folate-BSANP的平均粒徑為 68 nm，其中超過90%的Folate-BSANP其粒徑小于129 nm，其粒徑比BSANP的粒徑略大。

3.2 Folate-BSANP偶聯(lián)葉酸程度的測定

在5批Folate-BSANP樣品中，表面葉酸偶聯(lián)量的測定值分別為 171 μmol/g、175 μmol/g、163 μmol/g、164 μmol/g、172 μmol/g BSA,其平均葉酸偶聯(lián)量為169 μmol/gBSA。采用2-三硝基苯磺酸顯色法、4-三硝基苯磺酸顯色法及6-三硝基苯磺酸顯色法測定BSANP表面活性氨基的含量為598 μmol/g BSA，則偶聯(lián)于Folate-BSANP表面的葉酸密度為28.4%。

3.3 納米粒的濃度和培養(yǎng)的時間對人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響

隨著培養(yǎng)液中Folate-BSANP質(zhì)量濃度的增加，人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP的量逐漸遞增。但當Folate-BSANP的質(zhì)量濃度達到1mg/ml后，人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP的速率會逐漸降低。人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP的量遠大于攝取BSANP的量。在極低質(zhì)量濃度時，人腎癌786-0細胞對Folate-BSANP與BSANP的攝取量幾乎為零。詳見圖1。隨著培養(yǎng)時間的延長，人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP的量逐漸增加，且在初始的2 h內(nèi)細胞的攝取量增加較為迅速，在隨后的培養(yǎng)時間內(nèi)增加較為緩慢。詳見圖2。

3.4 游離葉酸對人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP與BSANP的影響

隨著外源性葉酸的加入，人腎癌786-0細胞對Folate-BSANP的攝取量會逐漸減少，最終接近BSANP的攝取量。人腎癌786-0細胞攝取BSANP的曲線十分平緩。

3.5 比較人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP的量與攝取BSANP的量

將人腎癌786-0細胞與Folate-BSANP混合并在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)3 h后，在熒光顯微鏡下可以看到明顯的熒光。將人腎癌786-0細胞與BSANP混合并在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)3 h后，在熒光顯微鏡下基本上看不到熒光。這說明人腎癌786-0細胞攝取Folate-BSANP的量遠大于攝取BSANP的量。

4 討論

大多數(shù)受體本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)。受體多存在于靶器官的質(zhì)膜上或核內(nèi)胞液中。與受體特異性結合能夠傳遞信息的信號分子叫配體。不同的配體只能與其相應的受體結合，從而激活細胞的信息傳遞功能，使細胞的功能改變。受體和配體的結合具有特異性、飽和性、親和力強、結合速度快等多種特性。利用分子生物技術將配體作為藥物或某些小分子物質(zhì)的載體，用藥物將其包埋，通過受體和配體結合介導的作用，將藥物直接送達所在受體的靶細胞或靶器官，從而可達到殺傷腫瘤細胞的目的。這種方法具有起效快、療效確切及毒副作用小等優(yōu)點。由于葉酸受體在多種癌細胞膜上均具有較高的表達性，且葉酸受體介導的BSANP具有分子體積小和表面親水性強等特點，因此其可以逃脫巨噬細胞的吞噬而直接作用于靶器官。

[1]趙潔,夏亞丹,劉艷艷. 葉酸偶聯(lián)白蛋白納米粒的應用研究進展 [J]山東醫(yī)藥,2015,55(22):97-100.

[2]Sudimack, Lee RJ.Targeted drug delivery via the folatereceptor [J].Adv Drug Deliv Rev9,2000,41(2):147.

[3]Li Lei,Zhao Xiuli,Yang Chunrong,et al.Preparation and optimization of doxorubicin-loaded albumin nanoparticles using respon se surface methodology[J]. Drug Development & Industrial Pha rmacy,2011,37(10):1170-1180.

[4]RJ Lee,PS Low.Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis [J].J Biol Chem,1994,269(5):3198.

[5]吳偉,陸彬,熊素彬,等.熱致變性固化時間與溫度對噴霧干燥牛血清白蛋白微球表面活性氨基含量的影響 [J].中國藥學雜志,1999,34(11):752.

R739.53

B

2095-7629-（2017）12-0002-03

遼寧省科技廳博士科研啟動計劃項目，（20141083）；遼寧省教育廳一般項目，（L2016023）

胡丹丹，女，1991年10月出生，山東新泰市人，碩士，沈陽化工大學學生，研究方向：主動靶向納米粒抗癌藥；李磊，男，1981年10月出生，黑龍江大慶人，博士，沈陽化工大學教師，研究方向：藥物新劑型的研究；孟艷秋，女，1963年8月出生，遼寧省錦州人，博士，沈陽化工大學教授，研究方向：天然活性物質(zhì)的結構改造及抗腫瘤活性研究；寧偎鋒，男，1990年10月出生，安徽省宿州人，碩士，沈陽化工大學學生，研究方向：主動靶向納米粒抗癌藥