辛伐他汀對缺氧黑素瘤細胞A375增殖凋亡及遷移的影響

李娟 李立

450012鄭州市婦幼保健院皮膚科（李娟）；鄭州市第二人民醫院皮膚科（李立）

辛伐他汀對缺氧黑素瘤細胞A375增殖凋亡及遷移的影響

李娟 李立

450012鄭州市婦幼保健院皮膚科（李娟）；鄭州市第二人民醫院皮膚科（李立）

目的 探討辛伐他汀對缺氧黑素瘤細胞A375增殖、凋亡、遷移調控的分子機制。方法在常氧或缺氧環境下體外培養A375細胞，細胞分為辛伐他汀處理的辛伐他汀組與二甲基亞砜處理的對照組，通過CCK-8細胞計數試劑盒檢測細胞活力，Annexin V/PI凋亡實驗檢測細胞凋亡，插入式細胞培養皿transwell遷移實驗檢測細胞遷移。RT-PCR法、Western印跡法檢測辛伐他汀組與對照組細胞低氧誘導因子（HIF）-1α、生存素、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27），以及沉默缺氧A375細胞的HIF-1α后的生存素、p27 mRNA與蛋白表達水平。結果 常氧或缺氧環境下，辛伐他汀組與對照組A375細胞增殖活力、凋亡細胞比例、細胞遷移數組間差異均有統計學意義（F值95.84、37.22、177.5，均P ＜0.001），缺氧對照組A375細胞的增殖活力（1.391±0.129）、細胞遷移數（322.550±26.226）均高于常氧對照組（0.807±0.049、125.583±17.256）、缺氧辛伐他汀組（0.685±0.417、115.167±12.050）（P＜0.001）；缺氧對照組細胞凋亡比例（6.167%±2.714%）均低于常氧對照組（11.833%±2.483%）、缺氧辛伐他汀組（17.833%±2.714%）（P＜0.01）。缺氧辛伐他汀組HIF-1α mRNA與蛋白水平、生存素mRNA與蛋白水平均低于對照組（P＜0.05）；P27 mRNA與蛋白水平均高于對照組（P＜0.05）。沉默缺氧A375細胞中HIF-1α后，生存素mRNA與蛋白水平均低于對照組（t值為5.346、8.281，P ＜ 0.05），P27 mRNA與蛋白水平高于對照組（t值為31.37、9.954，P ＜ 0.01）。結論辛伐他汀可抑制缺氧A375細胞的增殖及遷移，促進凋亡，其機制可能與HIF通路有關。

黑素瘤；細胞系，腫瘤；缺氧；細胞增殖；細胞凋亡；細胞遷移分析；生存素；低氧誘導因子；辛伐他汀

黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，發病率低，但死亡率高［1］。黑素瘤細胞過度增殖導致氧供需失衡，局部組織存在缺氧。研究顯示，缺氧可誘導黑素瘤細胞（A375）增殖，增強遷移能力［2-3］，是患者預后不良的獨立危險因素［4］。低氧誘導因子（HIF）信號通路在腫瘤血管生成、腫瘤細胞增殖及遷移中發揮了重要作用［2，5］。研究發現，他汀類藥物可以通過調控線粒體功能、氧化應激反應、誘導血紅素合酶1［6］、黑素濃集激素Ⅰ類相關蛋白A［7］等參與腫瘤細胞增殖、遷移的調控。本研究旨在明確缺氧環境下黑素瘤的生長和遷移能力的變化，探討他汀類藥物對缺氧黑素瘤的增殖、凋亡、遷移的調控作用。

材料和方法

一、試劑和儀器

辛伐他汀（美國Sigma-Aldrich公司）儲存濃度為10 g/L，采用二甲基亞砜（DMSO）配制。轉染試劑盒（Lipofectanmol/Line 2000）（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；HIF-1α抗體（美國Novus公司）；生存素（survivin）及細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）抗體（美國Proteintech公司）；ECL化學發光試劑盒（美國Advansta公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁公司）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。

二、細胞培養

A375細胞系購于ATCC公司，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基（美國Gibco公司）培養。常氧組細胞于5%CO2培養箱中培養，缺氧組細胞于5%CO2、5%O2、90%N2的缺氧培養箱中培養。

三、細胞活力檢測

將A375細胞以1×104/ml的密度接種于96孔細胞培養板內，每孔加入100 μl細胞懸液，分別給予0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L辛伐他?。ㄐ练ニ〗M）及DMSO（對照組）干預，置于常氧或缺氧培養箱48 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，更換新鮮培養基，每孔加入10 μl染色液CCK-8，常氧培養箱內孵育3～4 h。酶標儀測定每孔在450 nmol/L處的吸光度（A值），記錄并分析。

四、細胞凋亡實驗

將A375細胞接種于6孔板中，采用含0.5%血清的低血清培養基培養細胞誘導細胞凋亡，分別給予辛伐他汀及DMSO干預，置于常氧或缺氧培養箱48 h后，收集細胞，PBS 洗滌，加入400 μl結合緩沖液重懸細胞，先加入5 μl Annexin-V-FITC熒光探針混勻，室溫避光5 ～ 10 min，再加入5 μl PI核酸染料，流式細胞儀檢測熒光。分析各組晚期凋亡（Annexin-V及PI陽性）細胞比例。

五、細胞遷移實驗

采用transwell小室進行細胞遷移實驗。A375細胞長至90%融合時，去血清培養24 h同步化細胞。在transwell小室下室中加入500 μl 15%血清DMEM培養基，上室加入100 μl的1×104/ml細胞懸液（無血清DMEM培養基），分別給予辛伐他汀及DMSO處理，置于常氧或缺氧培養箱8 h后，PBS漂洗，多聚甲醛固定，結晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，每個小室隨機選擇8個視野數細胞數。

六、沉默A375細胞中HIF-1α

委托廣州銳博生物有限公司合成針對HIF-1α基因的小干擾RNA（si-HIF）及陰性對照si-NC。Si-HIF的序列，正向引物：5′-UGCUCUUUGUGGUUGGAUC UA-3′，反向引物：5′-ACGAGAAACACCAACCUAGA U-3′。接種1×105個缺氧環境下的A375細胞至細胞培養板，采用無雙抗培養基，按照Lipofectamine 2000說明書將siRNA以20 nmol/L終濃度轉染至A375細胞內，轉染48～72 h后提取總蛋白，用于本研究后續實驗。

七、檢測A375細胞mRNA表達

依照Total RNA提取試劑說明書提取各組A375細胞RNA。合成cDNA，所得反轉錄產物采用ABI 7500型實時熒光定量PCR擴增，HIF-1α正向引物：5′-ATGAAGTGTACCCTAACTAGC CG-3′，反向引物：5′-GCTTGAGTTTCAACCCAGACATA-3；P27正向引物：5′-TTGCGCAATTAGGTTTTTCC-3′，反向引物：5′-AAAGGAATTCAAGCCCTTCC-3′；生存素正向引物：5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′，反向引物：5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′；內 參 照GAPDH正向引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據如下公式計算mRNA的相對表達量，△Ct=C（t）目標 -C（t）GAPDH，△△C（t）=2-△C（t）。

八、免疫印跡實驗

用蛋白裂解液提取各處理組的A375細胞總蛋白，制作聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），采用BCA蛋白測定法檢測蛋白濃度，根據濃度計算上樣量，加入5×SDS上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min。蛋白電泳，使用聚偏二氟乙烯膜轉膜，5%脫脂牛奶加入Tween的Tris-Hcl緩沖鹽溶液（TBST）混合液封閉，加入相應的一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL化學發光試劑盒顯影，Image J圖像處理軟件分析目的條帶的灰度值。

九、統計學方法

使用GraphPad Prism 5.0分析數據并繪制統計圖。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間比較采用雙因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗；半抑制濃度（IC50）采用非線性回歸擬合計算；計量資料采用±s表示，所有獨立的實驗重復3次取均值。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同濃度辛伐他汀對缺氧A375細胞增殖的影響

辛伐他汀濃度分別0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μmol/L時，A375細胞增殖抑制率分別為15.038%、22.535%、45.614%、58.186%、84.262%、84.815%，半抑制濃度（IC50）為1.3 μmol/L，故本研究后續實驗采用1.3 μmol/L作為辛伐他汀的處理濃度，且常氧聯合1.3 μmol/L辛伐他汀處理A375細胞時，細胞活力（0.662±0.018）與常氧對照組（0.812±0.032）比較，差異無統計學意義（t=2.027，P=0.08）。

二、缺氧與辛伐他汀對A375細胞增殖的影響

常氧環境與缺氧環境下，對照組與辛伐他汀組的A375細胞增殖活力差異有統計學意義（P＜0.001），缺氧辛伐他汀組與缺氧對照組A375細胞增殖活力均高于常氧組（P＜0.001），缺氧辛伐他汀組低于缺氧對照組（t=17.88，P＜0.001）。見表1。

表1 辛伐他汀對缺氧誘導的A375細胞增殖、凋亡及遷移的影響（±s）

表1 辛伐他汀對缺氧誘導的A375細胞增殖、凋亡及遷移的影響（±s）

注：n=3。a與常氧對照組比較，P＜0.01；b與缺氧對照組比較，P＜0.001

三、辛伐他汀對缺氧誘導A375細胞凋亡與遷移的影響

細胞凋亡實驗結果顯示，A375細胞凋亡細胞比例組間差異有統計學意義（P＜0.001），缺氧對照組低于常氧對照組、缺氧辛伐他汀組（t值分別為3.860、7.946，P ＜ 0.001）。細胞遷移實驗結果顯示，A375細胞遷移數組間差異有統計學意義（P＜0.001），缺氧對照組高于常氧對照組、缺氧聯合辛伐他汀組（t值分別為18.06、19.01，P ＜ 0.001）。見表1。

四、辛伐他汀調控缺氧A375細胞增殖凋亡的機制研究

缺氧環境下，辛伐他汀組HIF-1α mRNA水平與蛋白水平、生存素mRNA水平與蛋白水平均低于對照組，P27 mRNA水平與蛋白水平高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05或＜0.01）。見表2，圖1。

沉默缺氧A375細胞中HIF-1α后，生存素mRNA與蛋白表達低于對照組，P27 mRNA與蛋白表達高于對照組（P＜0.01），差異均有統計學意義（P＜0.05或＜0.01）。見表3，圖1。

討 論

黑素瘤過度增殖導致局部組織缺氧，缺氧可以通過上調血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素8（IL-8）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）等誘導黑素瘤細胞選擇性突變，發生表型轉化，使細胞適應缺氧環境，促進黑素瘤細胞增殖及遷移。HIF信號通路參與了缺氧對黑素瘤細胞的調控。常氧環境中，正常細胞及組織中HIF-1α被迅速降解幾乎檢測不到，而28%的黑素瘤組織可表達HIF-1α［8］。HIF-1α通過調控細胞周期蛋白水平、線粒體凋亡途徑等參與細胞的增殖、凋亡［9］。生存素作為凋亡蛋白抑制因子家族成員之一，可以在98%（62/63）的黑素瘤患者中檢出，且組織標本中生存素的mRNA水平與接受術后黑素瘤疫苗Canvaxin的患者的生存期成負相關［10］。P27是細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，參與調控細胞G0至S期轉換。研究顯示，P27的水平與腫瘤浸潤厚度負相 關［11］，是晚期轉移黑素瘤患者預后的獨立預測因子［12］。常氧環境中，他汀類藥物可以通過凋亡依賴途徑作為化療藥物的增敏劑發揮抗腫瘤作用［13］。他汀類藥物可以通過觸發一個“自分泌環”放大外源性途徑誘導細胞凋亡［14］。辛伐他汀可以通過誘導G1期停滯抑制腫瘤細胞增殖，其機制可能通過上調P27的表達而實現［15］。近期研究發現脂溶性他汀類藥物對常氧B16.F10小鼠黑素瘤細胞的細胞毒性作用可能通過抑制HIF-1α的表達和抗氧化防御機制實現［16］。

表2 缺氧環境下辛伐他汀對A375細胞低氧誘導因子（HIF）-1α、生存素、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）的mRNA及蛋白表達的影響（±s）

表2 缺氧環境下辛伐他汀對A375細胞低氧誘導因子（HIF）-1α、生存素、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）的mRNA及蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。a與對照組比較差異有統計學意義，P＜0.05；b與對照組比較差異有統計學意義，P＜0.01

表3 缺氧環境下A375細胞沉默HIF-1α對生存素、P27的mRNA及蛋白表達的影響（±s）

表3 缺氧環境下A375細胞沉默HIF-1α對生存素、P27的mRNA及蛋白表達的影響（±s）

注：n=3。si-NC：陰性對照小干擾RNA；si-HIF：針對HIF-1α的小干擾RNA；a與si-NC組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；b與si-NC組比較差異有統計學意義（P＜0.01）

圖1 缺氧環境下A375細胞低氧誘導因子（HIF）-1α、生存素、細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）的mRNA及蛋白的表達 1A：缺氧及辛伐他汀對A375細胞HIF-1α、生存素、P27的蛋白表達的影響；1B：缺氧A375細胞沉默HIF-1α對生存素、P27的蛋白表達的影響；si-NC：對照小干擾RNA；si-HIF：針對HIF-1α的小干擾RNA；a：P ＜0.05；b：P ＜ 0.001

本研究通過檢測缺氧環境下人黑素瘤細胞A375細胞的增殖、凋亡及遷移能力，明確了缺氧促進黑素瘤細胞增殖及遷移、抑制凋亡的作用，證實了缺氧是黑素瘤生長和轉移的重要誘導因素。同時，使用辛伐他汀干預缺氧A375細胞，可以逆轉缺氧對A375細胞的促生長和遷移作用。沉默缺氧黑素瘤細胞HIF-1α之后，生存素表達下降，P27增加，提示生存素及P27可能是HIF-1α的下游靶蛋白。辛伐他汀可以抑制缺氧黑素瘤細胞HIF-1α的表達，從而下調生存素、上調P27，提示辛伐他汀通過HIF-1α信號通路發揮抑制缺氧黑素瘤細胞增殖、促進凋亡的作用。

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Effect of simvastatin on the proliferation,apoptosis and migration of hypoxic A375 melanoma cells

Li Juan,Li Li
Department of Dermatology,Women&infants Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450012,China（Li J）;Department of Dermatology,Zhengzhou Second Hospital,Zhengzhou 450006,China（Li L）

Li Juan,Email:l1984210@163.com

Objective To evaluate the regulatory effect of simvastatin on the proliferation,apoptosis and migration of hypoxic A375 melanoma cells,and to explore their molecular mechanisms.Methods Under normoxic or hypoxic culture conditions,A375 cells were treated with 0.25,0.5,1,2,4,8 μmol/L simvastatin（simvastatin groups）and dimethyl sulfoxide（DMSO,control group）separately for 48 hours.Cell counting kit-8（CCK-8）assay,Transwell assay using immersion culture system and flow cytometry using annexin-V/propidium iodide（PI）staining were conducted to assess the proliferative and migratory activities and apoptosis of A375 cells,respectively.RT-PCR and Western blot analysis were performed to measure the mRNA and protein expression of hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α）,survivin and cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in the simvastatin groups and control group,as well as in the HIF-1α-silenced hypoxic A375 cells.Results Under normoxic or hypoxic culture conditions,there were significant differences in the proliferative activities of A375 cells,proportion of apoptotic cells and number of migrating cells between the simvastatin groups and control groups（F=95.84,37.22 and 177.5 respectively,P ＜0.001）.The hypoxic control group showed significantly higher cellular proliferative activity（1.391 ± 0.129）and higher number of migrating cells（322.550 ± 26.226）compared with the normoxic control group（0.807±0.049,125.583±17.256 respectively,both P＜0.001）and hypoxia+simvastatin group（0.685±0.417,115.167±12.050 respectively,both P＜0.001）,but significantly lower proportion of apoptotic cells（6.167% ±2.714%）compared with the normoxic control group（11.833% ±2.483%,P ＜0.01）and hypoxia+simvastatin group（17.833% ±2.714%,P ＜0.01）.Under the hypoxic condition,the simvastatin group showed significantly lower mRNA and protein expression of HIF-1α and survivin compared with the control group（all P ＜ 0.05）,but significantly higher mRNA and protein expression of P27 compared with the control group（both P ＜ 0.05）.Under the hypoxic condition,HIF-1αsilenced A375 cells showed significantly decreased mRNA and protein expression of survivin（t=5.346 and 8.281 respectively,both P ＜ 0.05）,but significantly increased mRNA and protein expression of p27（t=31.37 and 9.954 respectively,both P ＜ 0.01）compared with the unsilenced cells.Conclusion Simvastatin can inhibit the proliferation and migration of hypoxic A375 cells,and promote their apoptosis,likely by activating the HIF signaling pathway.

Melanoma;Cell line,tumor;Anoxia;Cell proliferation;Apoptosis;Cell migration assays;Survivin;Hypoxia inducible factor;Simvastatin

李娟，Email：l1984210@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.009

2016-10-31）

（本文編輯：朱思維 顏艷）