基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的橄欖果實(shí)多酚測(cè)定及其抗氧化活性分析

常 強(qiáng)，蘇明華,*，陳清西*，曾碧玉，李惠華，王 偉

基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的橄欖果實(shí)多酚測(cè)定及其抗氧化活性分析

常 強(qiáng)1,2，蘇明華1,2,*，陳清西1,*，曾碧玉1,2，李惠華2，王 偉1,2

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361006）

目的：定性分析和定量檢測(cè)橄欖（Canarium album L.）果實(shí)提取物中主要酚類(lèi)物質(zhì)以及評(píng)價(jià)其抗氧化活性。方法：采用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定了橄欖果實(shí)中的12 種酚類(lèi)化學(xué)成分；利用多重反應(yīng)檢測(cè)模式的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立一個(gè)快速、穩(wěn)定可靠檢測(cè)橄欖果實(shí)多酚的方法。該方法可在15 min內(nèi)完成，其檢測(cè)范圍內(nèi)線性良好（r＞0.98）；定量限小于1.436 ng/mL；檢出限小于4.786 ng/mL；準(zhǔn)確度大于80.19%，精密度大于1.12%；回收率大于80.13%。適用于橄欖果實(shí)中多酚物質(zhì)的定性定量分析。對(duì)橄欖果實(shí)不同溶劑提取的多酚組分定量分析表明，3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體含量最高，為橄欖果實(shí)提取物中主要成分。對(duì)不同溶劑提取的橄欖果實(shí)多酚及其抗氧化能力的研究表明，80%丙酮溶劑提取具有更高的多酚含量和抗氧化能力。

多酚；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；橄欖

多酚是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，已被證實(shí)具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓形成和抗動(dòng)脈硬化等多種生理功能，因其自身的安全性已成為近年來(lái)食品科學(xué)的研究熱點(diǎn)[1]。橄欖（Canarium album (Lour.) Raeusch）屬無(wú)患子目橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Canarium）植物，為我國(guó)特色果樹(shù)資源，可供鮮食或加工，自古為我國(guó)常用中藥材。據(jù)報(bào)道，橄欖果實(shí)富含總酚，其含量可達(dá)280.46 mg GAE/g（以干質(zhì)量計(jì)），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為97.11%，在68 種常見(jiàn)中藥材中含量屬最高，抗氧化能力最強(qiáng)，因此被認(rèn)為是一種優(yōu)良天然抗氧化劑的主要來(lái)源[2]。現(xiàn)已報(bào)道的橄欖果實(shí)中酚類(lèi)物質(zhì)有酚酸類(lèi)化合物（沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、沒(méi)食子酸乙酯、芥子酸）[3-4]、黃酮類(lèi)（山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、金絲桃苷、穗花衫雙黃酮、木犀草素、槲皮素）[4-5]、鞣花單寧類(lèi)化合物（異柯里拉京、六羥基聯(lián)苯二甲酸的衍生物）[3-4]。

目前，用于橄欖果實(shí)多酚類(lèi)物質(zhì)定量分析的方法僅限于福林-酚比色法和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[4]。其中，福林-酚比色法主要用于測(cè)定總多酚含量，無(wú)法分析多酚單體化合物含量。HPLC法可以測(cè)定多酚類(lèi)組分含量，但其分辨率低、耗時(shí)長(zhǎng)且難以達(dá)到對(duì)疊加峰相應(yīng)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確地分離鑒定。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS）法被認(rèn)為是一種強(qiáng)大的分析手段，具有高靈敏度、檢測(cè)時(shí)間短以及更高分辨率等特點(diǎn)，主要基于化合物的分子質(zhì)量和離子碎片的多反應(yīng)檢測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式進(jìn)行定量檢測(cè)，可提供分子離子信息，排除在HPLC中疊加峰的干擾[6]，具有同時(shí)定量定性檢測(cè)的特點(diǎn)。近年來(lái)該技術(shù)已大量應(yīng)用于多酚類(lèi)化合物的定量定性分析[7-12]。然而截至目前，國(guó)內(nèi)外較少有利用UPLC-MS/MS檢測(cè)橄欖果實(shí)中多酚類(lèi)物質(zhì)的方法報(bào)道。

據(jù)此，本研究基于超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-Q time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）研究橄欖果實(shí)中12 種多酚化合物的質(zhì)譜信息，采用MRM模式的UPLC-MS/MS技術(shù)建立一種快速靈敏、準(zhǔn)確分析橄欖果實(shí)中12 種多酚類(lèi)成分含量的方法；并采用所建方法研究不同溶劑的橄欖果實(shí)提取物中相應(yīng)化合物的含量，測(cè)定橄欖果實(shí)提取物總多酚和總黃酮含量以及評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為橄欖果實(shí)多酚保健功能的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，對(duì)全面評(píng)價(jià)橄欖果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

橄欖為‘檀香’品種，于2013年11月25日到福建省福州市閩清縣采集（37°36’N，110°17’E），分別從20 株橄欖樹(shù)采摘5 kg果實(shí)用于實(shí)驗(yàn)。果實(shí)要求大小均一，成熟一致，無(wú)病蟲(chóng)害。

異柯里拉京（分析純） 上海詩(shī)丹德公司；3-O-沒(méi)食子酰基奎寧酸、鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、鞣花酸-4-O-D-木糖、柯勒黎酸、老鸛草素以及同分異構(gòu)體為本實(shí)驗(yàn)室從橄欖果實(shí)中分離（純度＞93.5%）；沒(méi)食子酸、鞣花酸、短葉蘇木酚、穗花雙黃酮、金絲桃苷、DPPH、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-S-triazine，TPTZ）、2,2’-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-amino-di(3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）、水溶性VE（Trolox）、熒光素鈉鹽（fluoroscein disodium salt，F(xiàn)L）、2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride，AAPH）、福林-酚試劑 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈（色譜級(jí)） 美國(guó)Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda 35紫外-可見(jiàn)光光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer公司；Heto PowerDry LL1500真空冷凍干燥機(jī)（冷阱倉(cāng)溫度-110 ℃，面板加熱溫度為25 ℃，真空泵vacuubrand RZ2.5 Pressure 4×10-4mbar） 美國(guó)Thermo Electron公司；ACQUITY UPLC-SYNAPT G2-Si超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜、ACQUITY UPLC-Xevo TQS超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 定性分析

UPLC條件：Waters ACQUITY UPLC超高效液相系統(tǒng)，液相分析柱為T(mén)3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫保持40 ℃，流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙睛；洗脫梯度為0 min，1% B；0～2 min，1%～7% B；2～13 min，7%～40% B；13～14 min，40%～99% B；14～18 min，99%～1% B；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

MS條件：Waters ACQUITY UPLC配SYNAPT G2-Si HDMS質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離接口，采用負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓2.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣流速（N2）800 L/h；脫溶劑氣溫度450 ℃；錐孔反吹氣流速（N2）50 L/h；錐孔電壓30 V；碰撞氣電壓10～50 eV；取樣錐孔電壓35 V，微通道板電壓1 800 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200；鎖定質(zhì)量校正：亮氨酸-腦啡肽（質(zhì)量濃度200 pg/μL，流速10 μL/min，[M-H]-=554.261 5 D，14 min為鎖定質(zhì)量溶液）。

1.3.2 定量分析

色譜條件：色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為0.1%乙腈溶液；洗脫程序：0～10 min，5%～24% B；11～13 min，24%～100% B；13～16 min，100%～5% B；進(jìn)樣量1 μL；流速0.3 mL/min；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)范圍190～800 nm。

MS條件：ACQUITY UPLC-Xevo TQS超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；MRM模式；離子源溫度150 ℃；毛細(xì)管電壓2.1 kV；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣流速（N2）800 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔反吹氣流速（N2）150 L/h；碰撞氬氣流速（Ar）0.13 mL/min；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 200；數(shù)據(jù)處理采用MassLynx software version 4.1工作站。

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 對(duì)照品溶液制備

對(duì)照品儲(chǔ)備液：取用1.5 mL EP管，準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，然后加入1 mL色譜甲醇溶解，其中鞣花酸，鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和鞣花酸-4-O-D-木糖難溶于甲醇，需用N,N-二甲基甲酰胺溶解。配制為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。混合對(duì)照品溶液配制：根據(jù)每個(gè)對(duì)照品信號(hào)強(qiáng)弱及峰面積大小，選擇不同比例配制對(duì)照品，形成混標(biāo)。然后采用50%甲醇溶液稀釋為不同水平的質(zhì)量濃度溶液。

1.3.3.2 樣品溶液制備

用于方法學(xué)考察試樣：2 g樣品按照比1∶20（g/mL）的比例加入4 ℃預(yù)冷的80%甲醇溶液；10 g橄欖果肉凍干樣品按上述比例加入有機(jī)溶劑（80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮、80%乙酸乙酯和超純水）。30 ℃超聲波350 W（超純水溶劑提取樣在60 ℃水浴振蕩器中提取60 min），提取25 min，濾紙過(guò)濾，果渣再重復(fù)提取2 次。合并3 次離心上清液，真空條件下45 ℃蒸干，方法學(xué)考察樣品用甲醇-水（85∶15，V/V）定容至5 mL；-80 ℃冷藏備用。溶劑提取試樣置于真空冷凍干燥器中凍干為粉末，轉(zhuǎn)入玻璃密閉容器中-80 ℃冷藏備用。

1.3.3.3 質(zhì)量控制溶液與回收率相關(guān)溶液制備

質(zhì)量控制溶液配制：質(zhì)量控制溶液為混合基質(zhì)，其中含有3 個(gè)單糖（蔗糖、葡萄糖、果糖）質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL，分低、中、高3 個(gè)混合對(duì)照品質(zhì)量濃度加入基質(zhì)中，使混標(biāo)溶液的終質(zhì)量濃度為100、400、800 ng/mL，以此作為質(zhì)量控制溶液。

回收率相關(guān)溶液配制：樣品原液稀釋500 倍，然后加入100、400 μL和800 μL的混標(biāo)溶液（1 μg/mL）各兩管以及未加標(biāo)樣品稀釋液。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 線性范圍實(shí)驗(yàn)

將混合對(duì)照品溶液依次稀釋?zhuān)玫? 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的對(duì)照品溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)樣3 次實(shí)驗(yàn)。以峰面積y（對(duì)照品峰面積）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.4.2 準(zhǔn)確度和精確度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確度和精密度參照Bataglion等[7]的方法，利用質(zhì)量控制樣品來(lái)評(píng)價(jià)。日內(nèi)重復(fù)測(cè)定3 次，隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度，連續(xù)測(cè)定3 d，共9 次，同理計(jì)算質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度。準(zhǔn)確度根據(jù)測(cè)定的質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度和已知質(zhì)量控制溶液質(zhì)量濃度的比值分別計(jì)算日內(nèi)和日間的平均百分比值，準(zhǔn)確度達(dá)到80%～120%為合理區(qū)間。精密度為日內(nèi)（n=3）和日間（n=9）的變異系數(shù)，精密度小于20%為合理區(qū)間。

1.3.4.3 回收率實(shí)驗(yàn)

回收率按下式計(jì)算：

1.3.4.4 檢出限和定量限測(cè)定

將混合對(duì)照品溶液不斷稀釋?zhuān)總€(gè)質(zhì)量濃度梯度進(jìn)樣3 次。信噪比為3和10時(shí)所對(duì)應(yīng)的對(duì)照品質(zhì)量濃度即為檢出限和定量限。

1.3.5 總多酚和總黃酮含量以及抗氧化活性分析

總多酚含量采用福林-酚比色法[4]并作適當(dāng)修改，沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，總多酚提取量以每克干質(zhì)量等同于沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）的毫克數(shù)表示（mg GAE/g）；總黃酮含量采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法測(cè)定[13]，蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，總黃酮含量以每克干質(zhì)量等同于蘆丁（rutin equivalent，RE）的毫克數(shù)表示（mg RE/g）；多酚化合物含量以干質(zhì)量計(jì)（mg/g）。

總還原力采用鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測(cè)定[14]。準(zhǔn)確吸取橄欖果實(shí)多酚樣提取液50 μL，加入3 mL TPTZ工作液，37 ℃條件下水浴30 min，測(cè)定波長(zhǎng)593 nm處吸光度。Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中FRAP值以每克干質(zhì)量相當(dāng)Trolox當(dāng)量的微摩爾數(shù)表示（μmol TE/g）。

DPPH法測(cè)定樣品提取液的抗氧化能力[15]。取樣品溶液50 μL，置于5 mL離心管中，加入3.0 mL 6.0×10-5mol/L的DPPH試劑（2.4 mg DPPH溶解與100 mL乙醇溶劑中得到，DPPH試劑現(xiàn)配現(xiàn)用），搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min，同時(shí)以無(wú)水乙醇為空白，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算自由基清除率達(dá)到50%的樣品質(zhì)量濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

清除ABTS＋·能力測(cè)定參照Choi等[16]的方法，并略作修改。3.0 mL ABTS工作液，加入50 μL Trolox或不同質(zhì)量濃度樣品稀釋液，準(zhǔn)確振蕩30 s，測(cè)定反應(yīng)6 min后于波長(zhǎng)734 nm處的吸光度，計(jì)算IC50值。

氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）參考Huang Dejian等[17]方法并加以改進(jìn)。向96 孔板中加入橄欖果實(shí)提取液25 μL，10 min后向各孔加入150 μL FL工作液和25 μL AAPH，振蕩5 s后進(jìn)行讀數(shù)。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm，每2 min測(cè)定一次熒光強(qiáng)度，測(cè)定時(shí)間為達(dá)到初始熒光強(qiáng)度的5%為止。計(jì)算熒光衰退曲線下面積。然后將其與Trolox凈熒光衰退曲線條件下面積的比值與二者濃度（C）的比值做比，獲得ORAC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果實(shí)中12 種多酚化合物定性分析

圖1 UPLC-QTOF-MS圖譜Fig. 1 Representative UPLC-QTOF-MS chromatograms of fruit extracts of Chinese olives and a standard mixture of phenols

UPLC-QTOF-MS技術(shù)由于具有分辨率高、質(zhì)量范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于酚類(lèi)化合物的精確分子質(zhì)量檢測(cè)[18-21]。本研究利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)檢測(cè)了橄欖果實(shí)12 種多酚類(lèi)化合物；并根據(jù)樣品化合物的出峰時(shí)間、最大吸收波長(zhǎng)以及在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜信息，結(jié)合對(duì)照品和相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，對(duì)化合物進(jìn)行鑒定，如圖1和表1所示。

表1 橄欖果實(shí)提取物的UPLC-QTOF-MS譜圖鑒定Table 1 UPLC-QTOF-MS characterization of phenolic compounds in Chinese olive fruit

如圖1所示，橄欖果實(shí)提取物中化合物主要集中于2～10 min內(nèi)，該段時(shí)間的流動(dòng)相為5%～24%乙腈溶液，說(shuō)明橄欖果實(shí)多酚屬中極性化合物。從表1可以看出，12 個(gè)已選化合物的最大吸收波長(zhǎng)均在200～400 nm之間，屬于多酚類(lèi)物質(zhì)的特征吸收波長(zhǎng)。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同將12 個(gè)化合物分為4類(lèi)：沒(méi)食子酸衍生物（沒(méi)食子酸和3-O-沒(méi)食子酰基奎寧酸）、鞣花酸衍生物（鞣花酸、鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和鞣花酸-4-O-D-木糖）、鞣花單寧（異柯里拉京、柯勒黎酸、老鸛草素及其同分異構(gòu)體）、黃酮類(lèi)（短葉蘇木酚、穗花雙黃酮、金絲桃苷）。

2.2 橄欖果實(shí)中12 種多酚化合物UPLC-MS/MS定量分析

相比HPLC系統(tǒng)，UPLC具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測(cè)時(shí)間[22]。本研究選擇12 種多酚化合物可在15 min內(nèi)完成檢測(cè)。UPLC的流動(dòng)相選用文獻(xiàn)中最為常見(jiàn)的系統(tǒng)[23]：0.1%甲酸-水溶液和0.1%甲酸-乙腈溶液。經(jīng)正負(fù)離子掃描對(duì)比，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下響應(yīng)高，背景干擾少，且橄欖果實(shí)中富含多元酚類(lèi)物質(zhì)，屬于酸性化合物，適宜于負(fù)離子模式檢測(cè)，因此采用負(fù)離子模式掃描。為了得到母離子和特征子離子以及優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，采用針泵將標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)甲醇溶液進(jìn)樣，以全掃描確定母離子，然后找出響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)的1 種或2 種碎片離子作為對(duì)應(yīng)的子離子，最終以母離子和子離子組成檢測(cè)離子對(duì)，以響應(yīng)信號(hào)最強(qiáng)的離子為定量離子，采用MRM方式對(duì)樣品進(jìn)行定性定量分析。如圖2、表2所示。優(yōu)化后，MRM的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)可對(duì)色譜峰重疊的化合物分別給出準(zhǔn)確的定性定量信息，從而可有效避免因部分化合物在色譜上難以完全分離而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的定量結(jié)果，達(dá)到準(zhǔn)確可靠的定量目的。

圖2 多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的碎片離子色譜圖Fig. 2 UPLC-MS/MS identification of phenolic standards and phenolic compounds present in Chinese olive fruit

表2 UPLC-MS/MS分析定量酚類(lèi)化合物的MRM參數(shù)Table 2 List of MRM parameters for qualified and quantified phenolic compounds in the UPLC-MS/MS analysis

2.3 UPLC-MS/MS定量分析方法學(xué)考察結(jié)果

為了評(píng)價(jià)在MRM模式下UPLC-MS/MS檢測(cè)方法的有效穩(wěn)定性，本研究考察了相關(guān)質(zhì)量控制參數(shù)，保證備選的多酚組分很好地被定性定量。

表3 UPLC-MS/MS定量分析的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率Table 3 Regression equations, linearity ranges, correlation coefficients,limits of detection (LODs), limits of quantitation (LOQs) and recovery for quantitative analysis of phenolic compounds by UPLC-MS/MS

表4 質(zhì)量控制樣本評(píng)價(jià)方法的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精密度Table 4 Intra-and inter-day precision and accuracy for quality control(QC) samples at three different concentration levels

不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于優(yōu)化后條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以各組分特征離子峰面積為縱坐標(biāo)，以9 種質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，如表3所示。12 種多酚在0.5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（0.985～0.999）；定量限和檢出限分別為0.049～1.436 ng/mL和0.163～4.786 ng/mL。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性和精確性，利用質(zhì)量控制溶液作為評(píng)價(jià)溶液體系，如表4所示。該方法的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度在80.19%～120.81%之間，日內(nèi)和日間的精密度在1.12%～12.64%之間，均在所規(guī)定范圍內(nèi)（準(zhǔn)確度為（100±20）%，變異系數(shù)小于10%）。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。平均回收率在80.13%～112.01%之間，表明該方法的回收率達(dá)到要求。可見(jiàn)，UPLC-MS/MS的MRM模式可在保證分離度的情況下大大縮短了分析時(shí)間，同時(shí)在很大程度上節(jié)省了溶劑消耗，降低了分析成本，具有靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、快捷準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

2.4 橄欖果實(shí)多酚組分含量以及抗氧化活性分析

表5 橄欖果實(shí)不同溶劑提取的多酚化合物含量Table 5 Contents of phenolic compounds in different extract solvents of Chinese olive fruitmg/g

利用建立的UPLC-MS/MS的MRM模式對(duì)橄欖果實(shí)不同溶劑提取的多酚組分含量進(jìn)行測(cè)定。如表5所示，80%丙酮溶液對(duì)12 種化合物具有更高的提取率，其次是80%甲醇溶液和80%乙醇溶液，80%乙酸乙酯溶液和水為最低。沒(méi)食子酸衍生物、鞣花酸衍生物和鞣花單寧類(lèi)物質(zhì)為主要組成部分，黃酮類(lèi)含量最低。單個(gè)組分中，3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體含量最高，分別為22.09～47.42 mg/g和1.77～62.84 mg/g。He Zhiyong等[4]研究表明橄欖果實(shí)多酚中沒(méi)食子酸含量最高，而林玉芳等[24]則認(rèn)為鞣花酸含量最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人研究存在差異的原因可能是采用不同檢測(cè)方法所造成。本研究采用UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，主要是根據(jù)化合物的碎片離子的響應(yīng)值定量并且利用相應(yīng)離子對(duì)定性，而前人研究均采用HPLC分析技術(shù)，該方法是根據(jù)化合物吸收紫外光定量，由于疊加峰的存在很難達(dá)到定性的目的。因此，本研究對(duì)橄欖果實(shí)多酚組分的定性定量更具針對(duì)性。本研究還發(fā)現(xiàn)3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體在80%丙酮提取液中含量最高。據(jù)報(bào)道，3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸具有抗HIV活性[25]，老鸛草素具有鎮(zhèn)痛和抗感染病活性[26]。表明80%丙酮溶劑適用于提取橄欖果實(shí)中3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸和老鸛草素以用于藥物先導(dǎo)化合物。

不同溶劑提取對(duì)橄欖果實(shí)提取物的總多酚和總黃酮含量同樣有顯著影響。從表6可以看出，總多酚提取量最高的為80%丙酮溶液，為171.95 mg GAE/g。其次為80%甲醇溶液和80%乙醇溶液，80%乙酸乙酯溶液和水最低。這表明溶劑的極性可能引起多酚提取量不同的原因。Kuo等[27]報(bào)道橄欖果實(shí)采用不同溶劑提取對(duì)多酚含量的提取能力依次為50%乙醇溶液＞水＞甲醇＞丙酮＞乙酸乙酯，本研究采用80%丙酮溶液提取多酚含量高于Kuo等[27]采用純丙酮溶劑提取的多酚提取量。這表明雙溶劑系統(tǒng)比單一溶劑系統(tǒng)多酚提取效率更高[28]。

表6 橄欖果實(shí)不同溶劑提取的總多酚、總黃酮含量以及抗氧化能力Table 6 Contents of total phenolics, total flavonoids and antioxidant activities indifferent solvent extracts of Chinese olive fruit

采用4 種抗氧化活性評(píng)價(jià)方法（DPPH、ABTS、FRAP和ORAC）對(duì)不同溶劑提取進(jìn)行研究。由表6可知，80%丙酮溶液提取的DPPH和ABTS法IC50值最低，分別為0.78 mg/mL和0.27 mg/mL。較低的IC50值具有更高的自由基清除能力[29]。表明80%丙酮溶液的橄欖果實(shí)提取物清除自由基的能力最強(qiáng)，其余順序依次為80%甲醇溶液＞80%乙醇溶液＞80%乙酸乙酯溶液＞水。FRAP和ORAC表現(xiàn)為同樣的趨勢(shì)，說(shuō)明80%丙酮溶液橄欖果實(shí)提取物的總還原能力和氧自由基清除能力最強(qiáng)。這表明提取溶劑對(duì)橄欖抗氧化能力同樣具有顯著影響。前人研究表明，提取物間抗氧化能力的顯著差異，本質(zhì)上是由于提取溶劑極性的差異，使得提取出的抗氧化物質(zhì)含量存在差異[30]。

表7 抗氧化能力與總多酚和黃酮的相關(guān)性分析Table 7 Correlation coefficients between antioxidant capacity and total phenols and total flavonids contents

如表7所示，總多酚和總黃酮含量與抗氧化能力顯著或極顯著正相關(guān)，這表明橄欖果實(shí)抗氧化活性主要?dú)w因于其高含量的總多酚。單寧類(lèi)物質(zhì)相比黃酮具有更強(qiáng)的抗氧化能力[31]，且沒(méi)食子酰基數(shù)量、分子質(zhì)量大小以及鄰位酚羥基結(jié)構(gòu)均可增強(qiáng)單寧的抗氧化[32]。本研究結(jié)果表明，橄欖果實(shí)提取物中主要含有沒(méi)食子酸衍生物以及鞣花單寧類(lèi)物質(zhì)，如異柯里拉京、柯勒黎酸、老鸛草素及其同分異構(gòu)體。此類(lèi)具多羥基和沒(méi)食子酰基的組分可能是強(qiáng)抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者。

3 結(jié) 論

本研究利用UPLC-QTOF-MS分析了橄欖中已選擇的12 種多酚化合物的質(zhì)譜信息，并根據(jù)結(jié)構(gòu)不同分為沒(méi)食子酸及其衍生物、鞣花酸及其衍生物、鞣花單寧、黃酮共4 組。利用MRM模式的UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了一個(gè)快速、穩(wěn)定靈敏的可定性定量橄欖果實(shí)多酚的方法。該方法可在15 min內(nèi)完成，其檢測(cè)范圍內(nèi)線性良好（r＞0.98）；檢出限小于4.786 ng/mL；定量限小于1.436 ng/mL；準(zhǔn)確度大于80.19%，精密度大于1.12%。回收率大于80.13%；表明該方法可以對(duì)橄欖果實(shí)多酚組分進(jìn)行真實(shí)的定性定量檢測(cè)。對(duì)橄欖果實(shí)不同溶劑提取的多酚組分定量分析表明，沒(méi)食子酸衍生物、鞣花酸衍生物和鞣花單寧類(lèi)物質(zhì)為主要組成部分，黃酮類(lèi)含量最低。單個(gè)組分中，3-O-沒(méi)食子酸奎寧酸和老鸛草素同分異構(gòu)體含量最高，為橄欖果實(shí)提取物中主要多酚類(lèi)化合物。對(duì)不同溶劑提取的橄欖果實(shí)多酚及其抗氧化能力的研究表明，80%丙酮溶劑提取具有更高的多酚含量和抗氧化能力。

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Determination of Polyphenols and Antioxidant Activity in Chinese Olive Fruits by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHANG Qiang1,2, SU Minghua1,2,*, CHEN Qingxi1,*, ZENG Biyu1,2, LI Huihua2, WANG Wei1,2
(1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant, Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen 361006, China)

The aims of the study were to identify and quantify the phenolic compounds present in extracts of Chinese olive fruit (Canarium album L.) and to investigate their respective antioxidant activities. A total of 12 phenolic compounds were identified in Chinese olive fruit by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) coupled to time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS). A quantitative method was established by UPLC coupled to triple quadrupole mass spectrometry(TQ-MS/MS) under the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Phenolic compounds were separated within 15 min.The linearity (r ＞ 0.98), limit of detection (LOQ) (＜ 1.436 ng/mL), limit of quantification (LOQ) (＜ 4.786 ng/mL), interand intra-day accuracy ( ＞ 80.19%), precision ( ＞ 1.12%) and recovery ( ＞ 80.13%) of the method were all satisfactory and thus it could provide an efficient protocol to analyze phenolic compounds in fruit pulp extracts of Chinese olive. Quantitative analysis of different solvent extracts suggested that 3-O-galloylquinic acid and Geraniin isomers was the most abundant polyphenols in Chinese olive. Furthermore 80% acetone extract contained more polyphenols and possessed stronger antioxidant capacity.

phenolic compounds; ultra-performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS); Chinese olive

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724024

S667.5

A

1002-6630（2017）24-0150-09

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10.7506/spkx1002-6630-201724024. http://www.spkx.net.cn

2017-04-12

廈門(mén)市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（3502Z20142001）；福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013N002-4）；

廈門(mén)市重大科技創(chuàng)新平臺(tái)項(xiàng)目（3502Z20131004）；福建省亞熱帶植物研究所基金項(xiàng)目（20150318-1）

常強(qiáng)（1983—），男，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锾烊划a(chǎn)物開(kāi)發(fā)。E-mail：chyile_1@163.com

*通信作者：蘇明華（1952—），男，研究員，本科，研究方向?yàn)楣麡?shù)生理生化。E-mail：mhsu068@163.com

陳清西（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)閳@藝植物栽培生理。E-mail：cqx0246@fafu.edu.cn

CHANG Qiang, SU Minghua, CHEN Qingxi, et al. Determination of polyphenols and antioxidant activity in Chinese olive fruits by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 150-158. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724024. http∶//www.spkx.net.cn