金黃色葡萄球菌M型腸毒素原核表達、純化、鑒定及溶液構象分析

劉 驥，楊 帆，田萬帆，龍 虎，孫思雨，周玉珊，趙燕英，唐俊妮*

金黃色葡萄球菌M型腸毒素原核表達、純化、鑒定及溶液構象分析

劉 驥，楊 帆，田萬帆，龍 虎，孫思雨，周玉珊，趙燕英，唐俊妮*

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

葡萄球菌腸毒素M是由金黃色葡萄球菌νSa基因島編碼的分泌型超抗原。本研究將截去N端信號肽的金黃色葡萄球菌M型腸毒素（staphylococcal enterotoxin M，SEM）蛋白編碼基因亞克隆至原核表達載體pET-28a（＋），構建重組表達質粒pET-28a（＋）-ΔNspsem；隨后轉化感受態E. coli Rosetta（DE3）并探討融合蛋白最佳表達條件；利用Ni2＋-Sepharose 4 Fast Flow親合層析純化出His-ΔNspSEM融合蛋白；經質譜鑒定，純化的融合蛋白對SEM的氨基酸覆蓋率達96.3%；凝血酶切除6×His標簽肽后，圓二色譜分析表明ΔNspSEM重組蛋白富含β-折疊（35%）和β-轉角（21%）以及較少α-螺旋（16%）等二級結構；熒光發射譜揭示ΔNspSEM在278 nm和295 nm波長處激發時具有相同的Trp發射峰（341 nm）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分析表明ΔNspSEM重組蛋白表現出較高的熱穩定性。研究結果表明重組蛋白SEM表達成功，純化的ΔNspSEM重組蛋白溶液構象緊密并具有接近天然狀態的結構，這為深入研究SEM蛋白的結構與功能提供理論支持。

金黃色葡萄球菌M型腸毒素；原核表達；純化；質譜；圓二色譜；熒光發射譜；熱穩定性

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作為一個重要的食源性病原菌，其抗生素抗性獲得[1-2]、生物被膜形成[3]和致熱性毒素超抗原的胞外分泌[4]是逃避藥物與機體免疫系統攻擊的有效手段。其中，致熱性毒素超抗原是一類特殊的非糖基化、低分子質量、在多肽鏈N-末端具有跨膜分泌型信號肽的細胞外毒素蛋白。當其在信號肽引導分泌到胞外，其N-末端信號肽被切除，形成分子質量范圍為19～30 kD的成熟肽段[5]，該家族的毒素具有過度活化免疫系統，誘導免疫細胞分泌大量細胞因子，導致體液中大量產生多種促炎細胞因子的異常免疫應答，從而引發全身炎癥反應綜合征，嚴重者可導致多器官功能障礙綜合征[6]。金黃色葡萄球菌分泌的腸毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）和類腸毒素（staphylococcal-like enterotoxins，SEls）歸屬于上述的致熱性毒素超抗原家族。同時，SEs/SEls也是造成世界范圍內葡萄球菌食物中毒的重要毒力因子[7-8]。

金黃色葡萄球菌M型腸毒素（staphylococcal enterotoxin M，SEM）歸屬于V型超抗原[9-11]，與其他各型腸毒素不同的是，M型超抗原具有一個附加的15 個氨基酸殘基形成的插入序列，該插入序列位于第3個α-螺旋和第8個β-折疊股之間，被命名為α3-β8環，這個環可能在與T淋巴細胞表面的Vβ-TCR相互作用時發揮著關鍵作用[12]。由于該型超抗原缺乏催吐活性所要求的胱氨酸環結構，金黃色葡萄球菌超抗原國際命名委員會（International Nomenclature Committee for Staphylococcal Superantigens，INCSS）最初把SEM歸類于SEls中，記為SElM[13]。最近，Omoe等[14]通過獼猴喂飼實驗證實SEM具有催吐活性，但相對于傳統的腸毒素活性弱，因此根據INCSS命名規則，建議將SElM稱為SEM更為恰當。SEs具有顯著的熱穩定性、蛋白酶降解穩定性、酸穩定性和干燥穩定性等特點，這種超強的環境穩定性和生物學活性，使該家族蛋白中某些成員雖經極端條件的食品加工處理步驟，仍保持一定的活性[14-15]。到目前為止，針對SEM的研究不多，主要體現在毒素功能[16-17]和快速檢測[18]上。特別是關于SEM高產原核表達體系建立、表達條件優化、SEM溶液構象及維持等相關研究報道較少。

鑒于SEs引起的食物中毒普遍性和高發性，為了進一步理解新型腸毒素結構與功能關系，探討SEs高穩定性原因，本研究通過優化SEM原核表達體系獲得足量融合蛋白，進而利用圓二色譜和熒光光譜對SEM溶液構象及維持進行研究，旨在揭示SEM溶液構象及其維持的分子基礎，為探索破壞SEM結構穩定性的方法和建立更加高效合理的食品消毒工藝提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保存于本實驗室臨床分離的金黃色葡萄球菌SA003；感受態大腸桿菌（E. coli）菌株DH5α、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）以及高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase） 天根生化科技（北京）有限公司；原核表達質粒pET-28a（＋） 美國Novagen公司；卡那霉素、氯霉素、牛血清白蛋白組分V（bovine albumin V，BSA） 美國Sigma公司；鎳親和層析介質（Ni2＋-NTA-Sepharose） 美國GE Healthcare公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑、核酸分子質量標準、限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ 寶生物工程（大連）公司。

1.2 儀器與設備

HZQ-F160全溫振蕩培養箱 江蘇太倉培英實驗設備有限公司；5804R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；WD800B型微波爐 中國格蘭仕集團；TSNENEN031445型PCR儀、伯樂Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYY-6C型核酸電泳儀北京六一儀器廠；JY92-IIN型超聲破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；F-7000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Model 400圓二色譜儀 美國Aviv公司。

1.3 方法

1.3.1 引物合成與設計

根據GenBank中報道的S. aureus 04-02981的sem基因序列（GenBank accession No. CP001844.1）和S. aureus strain H4的selm基因序列（登錄號：KT853047.1），利用SignalP 4.1 Server在線服務器預測信號肽序列。在預測的信號肽剪切位點，利用Premier 6.0進行引物設計，克隆不含信號肽的sem基因序列。不含信號肽的sem基因5’端引物序列：5’-CGTACGCATATGGATGTCGGAGTTTTGAA TCTT-3’（下劃線示出NdeⅠ酶切位點），3’端引物序列為：5’-CCGCTCGAGTTAACTTTCGTCCTTATAAGATA TT-3’（下劃線示出XhoⅠ酶切位點，加粗斜體為插入的終止密碼子）。

1.3.2 ΔNspSEM蛋白原核表達載體構建

采用本實驗室建立的微波加熱法提取金黃色葡萄球菌基因組DNA，以提取的1 ng SA003菌株的基因組DNA為模板，利用1.3.1節設計的引物進行PCR擴增。擴增體系如下：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）4 μL，Mg2＋（25 mmol/L）5 μL，5?-引物（20 μmol/L）2.5 μL，3?-引物（20 μmol/L）2.5 μL，金黃色葡萄球菌基因組DNA模板1 μL，Pfu DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 34 μL，反應體系共計50 μL。PCR參數為：94 ℃60 s；66 ℃ 60 s；72 ℃ 150 s，38 輪循環；第1次循環前先經95 ℃變性4 min，最后1次循環后于72 ℃延伸8 min。擴增所得片段經瓊脂糖凝膠電泳檢測及PCR產物純化試劑盒純化后，與質粒載體pMD18-T進行T-A連接，轉化至大腸桿菌DH5α，同時將空質粒pET-28a（＋）轉化至大腸桿菌DH5α。分別將插入ΔNspsem基因的pMD18-T質粒與空載質粒pET-28a（＋）用NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切（注：ΔN表示N端缺失，sp是信號肽signal peptide的縮寫），將上述雙酶切獲得的基因片段用T4 DNA連接酶連接，使得目的基因定向克隆至表達載體。將插入ΔNspsem基因的質粒命名為pET-28a（＋）-ΔNspsem，轉化至大腸桿菌DH5α擴增，將提取到的質粒pET-28a（＋）-ΔNspsem進行NdeⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定。同時將提取到的質粒送成都擎科生物技術有限公司測序。

1.3.3 重組質粒在大腸桿菌中表達及表達條件優化

將經過測序驗證的重組質粒pET-28a（＋）-ΔNspsem分別轉化感受態大腸桿菌BL21（DE3）、BL21（DE3）pLysS和Rosetta（DE3），在相應的抗生素抗性平板上隨機挑取含有重組質粒的單克隆，分別過夜培養后，按1∶50的比例擴大至含相應抗生素抗性的LB培養基中，37 ℃振蕩培養3 h，然后加入適當濃度誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）后，繼續恒溫振蕩培養一定時間，離心收集菌體，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）檢測蛋白表達情況。選擇高表達菌株，分別進行誘導時間梯度（37 ℃，0.5 mmol/L IPTG分別誘導4、8、16 h），誘導用IPTG濃度梯度（37 ℃，8 h，IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）和誘導溫度（8 h，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導溫度分別為17、27、37 ℃）優化，確定最佳誘導條件。

1.3.4 His-ΔNspSEM蛋白分離純化及質譜鑒定

根據1.3.3節確定的最優表達菌株為出發菌種接種于5 mL LB液體培養基中，37 ℃過夜振蕩培養。次日將種子液轉接到500 mL LB中按照1.3.3節確定的最佳表達條件擴大培養，監測菌液A600nm至0.6～0.7時，進行IPTG誘導表達。離心收集菌體，菌體經PBS緩沖液洗滌后重懸浮于20 mL Buffer A緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 8.0）中，冰浴超聲破壁，離心收集上清液。將制備的His-ΔNspSEM蛋白粗提液上樣于事先用含Buffer A緩沖液平衡好鎳親合層析柱。先以Buffer A緩沖液和含50 mmol/L咪唑的Buffer A緩沖液除去大部分雜蛋白，再以含500 mmol/L咪唑的Buffer A洗脫目的蛋白，SDS-PAGE分析純度。將純化的His-ΔNspSEM進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色直徑3 mm以上，切下染色后的條帶，送北京華大蛋白質研發中心有限公司進行質譜鑒定。

1.3.5 凝血酶去除6×His標簽肽及ΔNspSEM重組蛋白純化

將按1.3.4節中純化的His-ΔNspSEM融合蛋白用截留分子質量10 kD、容量15 mL的millipore超濾管脫鹽至6 mmol/L Britton-Robinson緩沖液（pH 7.0）中，作為凝血酶的酶切底物，配制為1 IU/μL Thrombin儲液，按10 IU Thrombin/mg目標蛋白的酶與底物比例，恒溫20 ℃分別進行0、0.5、1、2 h酶切。按上述方案酶切后的樣品經鎳親和層析柱吸附6×His標簽肽，收集穿透液再次超濾濃縮至6 mmol/L pH 7.0 Britton-Robinson緩沖液，調節超濾后ΔNspSEM融合蛋白的280 nm波長處吸光度使之與超濾前樣品一致，SDS-PAGE驗證酶切效率與純化所得ΔNspSEM重組蛋白純度。

1.3.6 圓二色譜測定

將1.3.5節純化的ΔNspSEM重組蛋白質量濃度調節為0.089 5 mg/mL，在Model 400型圓二色譜儀上測定遠紫外圓二色譜的掃描范圍為190～260 nm。激發光和發射光狹縫均設為1 nm，掃描速度設為中速，光譜校正設為開啟以消除光柵和檢測器響應的波長依賴性。每個樣品掃描3 次取平均值，3 次掃描差別較大時再掃描一次，測試在25 ℃條件下進行。采用DichroWeb在線分析軟件，選擇CDSSTR擬合方案，采用圓二色譜參考數據集SMP180，190～240 nm波長范圍內對掃描數據進行擬合，計算溶液中ΔNspSEM蛋白二級結構含量[19]。

1.3.7 熒光光譜分析

將1.3.5節純化的ΔNspSEM重組蛋白質量濃度調節為25 μg/mL，使用F-7000熒光光譜儀進行測定，激發波長分別為278 nm和295 nm，發射譜波長掃描范圍為300～400 nm，掃描速率為1200 nm/min，所有掃描激發光和發射光狹縫均設為5 nm，PMT電壓均設為700 V，光譜校正均設為開啟以消除光柵和檢測器響應的波長依賴性。每個樣品掃描3 次取平均值，3 次掃描差別較大時再掃描一次，測試在25 ℃進行。

1.3.8 ΔNspSEM重組蛋白熱穩定性分析

分別將去除6×His標簽肽的ΔNspSEM重組蛋白、BSA和商品化高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）進行100 ℃熱處理1 h，間隔15 min采樣，將離心所得上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒pET-28a（＋）-ΔNspsem的基因測序鑒定

將重組表達質粒ΔNspsem基因測序，得到長度為651 bp的片段，利用NCBI BLAST多序列比對發現克隆到的ΔNspsem基因序列與來源于S. aureus strain H4的SElM蛋白基因序列（登錄號：KT853047.1）的第67～717位堿基序列具有100%的相似度。如圖1A所示，利用SignalP 4.1 Server在線服務器預測，被截去的第1～66位堿基為SEM編碼信號肽的堿基序列。圖1B表明，含組氨酸標簽并截去N端信號肽的SEM融合蛋白（His-ΔNspSEM）表達載體被成功構建。

圖1 SEM蛋白編碼基因和氨基酸序列的比對Fig. 1 Analysis of the full-length DNA and amino acids sequences of SEM

2.2 ΔNspsem基因在大腸桿菌中的表達條件優化及純化

2.2.1 編碼ΔNspSEM蛋白的基因在不同大腸桿菌中誘導表達及表達條件優化

圖2 編碼ΔNspSEM蛋白的基因在不同大腸桿菌中誘導表達及表達條件優化Fig. 2 Influence of expression vector and induction conditions on expression efficiency of ΔNspsem gene

編碼ΔNspSEM蛋白的基因在不同大腸桿菌中誘導表達及表達條件優化時，如圖2A所示，ΔNspSEM蛋白在BL21（DE3）菌株無明顯表達；圖2B表明在BL21（DE3）pLysS菌株中融合蛋白呈現較低的表達量；圖2C顯示ΔNspSEM蛋白在Rosetta（DE3）菌株中表達量普遍較高。因此，選取表達量最高的Rosetta（DE3）菌株為后續表達條件優化實驗的菌種。由圖2C可見，6 個重組子均能表達分子質量約為30 kD的蛋白帶，與理論計算的His-ΔNspSEM蛋白分子質量接近。

進一步探討融合蛋白的最佳表達條件，如圖2D所示，誘導時間超過4 h融合蛋白表達量下降；圖2E顯示，融合蛋白表達量在IPTG濃度0.4～0.6 mmol/L時最高；圖2F表明，37 ℃時誘導融合蛋白產量最高。確定最優表達條件為：4 h、IPTG 0.5 mmol/L、誘導溫度37 ℃。

2.2.2 最優條件下His-ΔNspSEM蛋白的表達與純化及6×His標簽肽的凝血酶切除

圖3 最優條件下His-ΔNspSEM蛋白的可溶性表達驗證與純化Fig. 3 Soluble expression and purification of His-ΔNspSEM protein under the optimal conditions

如圖3A所示，利用2.2.1節確定的最優表達條件對Rosetta（DE3）宿主菌2號單克隆進行小量誘導表達驗證，3 次平行實驗均獲得了His-ΔNspSEM蛋白高產量表達。將1 mL菌液離心收集菌體經過Buffer A緩沖液重懸后超聲破碎，裂解液離心所得上清液（圖3B泳道1）和沉淀（圖3B泳道2）分別上樣于SDS-PAGE，結果表明融合蛋白為可溶性表達。將擴大培養所得融合蛋白超聲破碎粗提液進行鎳親合層析純化，得純度大于98%的His-ΔNspSEM融合蛋白。經軟件分析目的蛋白分子質量約30 kD，與預期相符合（圖3B泳道8）。按照1.3.5節方案凝血酶切割6×His標簽肽，如圖3C所示，對于1 mg融合蛋白2 h即可完全除去標簽肽。進一步，將酶切后的樣品經鎳親和層析柱吸附6×His標簽肽，收集穿透液再次超濾濃縮至6 mmol/L pH 7.0 Britton-Robinson緩沖液，調節超濾后ΔNspSEM融合蛋白的280 nm波長處吸光度使之與超濾前一致，SDS-PAGE表明（圖3C泳道5），除去His標簽肽的電泳純ΔNspSEM重組蛋白純度大于95%，滿足后續光譜學測定要求。

2.3 純化的His-ΔNspSEM質譜鑒定

圖4 His-ΔNspSEM重組蛋白的質譜分析Fig. 4 Identification of purified His-ΔNspSEM recombinant fusion protein by mass spectrometry

純化的融合蛋白通過氣相色譜-串聯質譜鑒定，圖4A表明，離子得分大于28的肽片段可信，圖4B說明通過與金葡菌基因組數據庫比對，鑒定的融合蛋白得分（大于75 000）與其他可能的蛋白得分相差10 000 倍以上，圖4C顯示，純化的蛋白與來自金黃色葡萄球菌的M型腸毒素（NCBI編號：D0K667）氨基酸覆蓋率在扣除了信號肽之后，高達96.3%，圖4D是隨機選擇的一段肽段的指紋圖譜。質譜鑒定表明，目標蛋白純化成功。

2.4 純化的ΔNspSEM重組蛋白圓二色譜與熒光發射譜測定

圖5 ΔNspSEM重組蛋白遠紫外圓二色譜（A）與室溫熒光發射譜（B）Fig. 5 Far-UV circular dichroism spectrum and room temperature fluorescence emission spectrum of ΔNspSEM fusion protein

圖5 A所示為ΔNspSEM重組蛋白的遠紫外區圓二色譜，表現為192 nm強正峰和208 nm強負峰信號，215 nm與222 nm波長處肩峰使負峰展寬。采用DichroWeb在線分析軟件，計算出溶液中ΔNspSEM重組蛋白二級結構含量為：α-螺旋16%、β-折疊35%、β-轉角21%和無規卷曲29%，實驗數據與擬合數據之間的誤差在可接受范圍之內。圖5B所示為ΔNspSEM重組蛋白的熒光發射譜，表現為278 nm激發和295 nm激發時，具有相同的341 nm色氨酸熒光發射峰。色氨酸的熒光發射峰位相對于親水環境中的354 nm發射峰藍移了13 nm，說明ΔNspSEM重組蛋白中色氨酸并未完全暴露于極性水環境中，重組蛋白具有折疊態的三級結構。

2.5 純化的ΔNspSEM重組蛋白熱穩定性分析

圖6 100 ℃熱處理對BSA（A）、SEM（B）和Pfu DNA Polymerase（C）穩定性的影響Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the effect of incubation at 100 ℃ on stability of BSA, SEM and Pfu DNA polymerase

將去除His標簽肽的ΔNspSEM重組蛋白100 ℃熱處理，間隔15 min采樣，將離心所得上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析。如圖6所示，15～45 min范圍內，主要在上清液中檢測到ΔNspSEM重組蛋白，同時在沉淀中出現少量重組蛋白；經過1 h熱處理后，沉淀中重組蛋白顯著增加，但上清液和沉淀中重組蛋白總和基本不變。上述結果表明，經過100 ℃熱處理1 h后，ΔNspSEM重組蛋白并未發生顯著降解，而是產生了沉淀。對比溶解于相同緩沖液的BSA而言，經過15 min熱處理，BSA形成大量可溶性高分子質量聚合體（有些聚合體分子質量高到沉積于加樣孔，而不能進入4%濃縮膠內）；30 min熱處理后，可溶性BSA及其聚合體顯著降解，同時在熱處理過程中基本不產生沉淀。與之形成鮮明對比的是，商品化高保真DNA聚合酶（Pfu DNA Polymerase）在100 ℃加熱1 h過程中，既不降解也不形成沉淀，具有很高熱穩定性，這與該酶用于PCR循環過程中，需要94 ℃變性雙鏈DNA所需高熱穩定性要求是一致的。

3 討 論

本研究首先采用經典的BL21（DE3）原核表達系統[20-22]，對His-ΔNspSEM蛋白編碼的基因進行誘導表達。SDSPAGE表明目標蛋白表達量極低，因此，改用能有效抑制外源基因本底水平表達的BL21（DE3）pLysS系統[23-25]，雖然實現了His-ΔNspSEM蛋白原核表達，但表達量較低。由此推測，BL21（DE3）原核表達系統對融合蛋白表達量低的原因是外源基因本底水平轉錄和表達降低了宿主系統的蛋白生產能力。進一步利用http∶//www.doe-mbi.ucla.edu/～sumchan/caltor.html在線分析，發現ΔNspSEM蛋白編碼基因存在21個稀有密碼子，分別為編碼精氨酸的AGG（1 個）和AGA（4 個）、編碼甘氨酸的GGA（9 個）、編碼異亮氨酸的AUA（5 個）和編碼亮氨酸的CUA（2 個）。稀有密碼子的存在可能是造成表達量低的原因之一，為了提高融合蛋白表達量，將編碼His-ΔNspSEM蛋白的基因轉化到能夠高效表達稀有密碼子的Rosetta（DE3）菌株[26-27]中，由于該型菌株補充了上述5種稀有密碼子對應的tRNA，目標蛋白的表達量顯著提高。

通過圓二色譜分析揭示，ΔNspSEM重組蛋白溶液構象β-折疊為35%。王小紅[28]研究表明，B型腸毒素具有高達40.4%的β-折疊，經過121 ℃處理30 min后，仍具有39.9%的β-折疊含量，表明高β-折疊對B型腸毒素熱穩定性維持具有關鍵作用。本研究發現M型腸毒素與B型高度同源，因此可以推測ΔNspSEM重組蛋白溶液構象及維持也依賴于其高含量的β-折疊。

對ΔNspSEM重組蛋白的熒光發射譜進行分析，發現278 nm波長激發時未見顯著的303 nm酪氨酸熒光發射峰，同時呈現特征性的341 nm色氨酸熒光發射主峰。該峰位與295 nm單獨激發色氨酸殘基時，產生的熒光發射峰接近，說明重組蛋白分子中酪氨酸吸收的能量通過熒光共振能量轉移給色氨酸[29]，形成了341 nm的色氨酸熒光發射峰。因此，根據蛋白質分子內能量轉移有效性和色氨酸熒光峰位相對于極性水環境（354 nm發射峰）的顯著藍移[30]，可以推測純化的重組蛋白處于構象緊密的天然折疊狀態。

分別以BSA和Pfu DNA Polymerase為100 ℃熱處理負對照和正對照，ΔNspSEM重組蛋白表現出較高的熱穩定性，這與天然SEM具有類似的性質。

綜上，本研究成功構建了高產融合蛋白His-ΔNspSEM的可溶性原核表達體系，經該表達體系純化并切除標簽肽之后的重組蛋白溶液構象緊密，其溶液構象的維持依賴于二級結構中的高含量的β-折疊，這為進一步研究SEM的結構與功能關系提供了理論支持。

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Prokaryotic Expression, Purification, Identification and Solution Conformation of Staphylococcal Enterotoxin M

LIU Ji, YANG Fan, TIAN Wanfan, LONG Hu, SUN Siyu, ZHOU Yushan, ZHAO Yanying, TANG Junni*
(College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China)

Staphylococcal enterotoxin M (SEM) is a secretory superantigen encoded by the νSa genomic islands of Staphylococcus aureus. In this study, the sem gene from S. aureus without N-terminal signal peptide was subcloned into the prokaryotic expression vector pET-28a (+) to construct the recombinant plasmid pET-28a (+)-ΔNspsem and the recombinant expression plasmid was then transformed into E. coli Rosetta (DE3) competent cells. The positive clones, induced by IPTG, effectively expressed His-tag containing soluble ΔNspSEM fusion protein in E. coli Rosetta (DE3). The expression conditions including expression vector, time, IPTG concentration and temperature were optimized. Purified His-ΔNspSEM fusion protein was obtained by Ni2+-Sepharose affinity chromatography. Mass spectrometric analysis indicated that the amino acid sequence of the fusion protein was 96.3% similar to that of SEM. Circular dichroism revealed ΔNspSEM, whose 6 × His sequence was cleaved by thrombin, was rich in β-sheet (35%) and β-turn (21%) but low in α-helix (16%). The fluorescence emission spectrum of ΔNspSEM exhibited identical tryptophan emission peak (341 nm) with excitation at 278 and 295 nm.The time-dependent thermal stability of ΔNspSEM obtained at 100 ℃ by SDS-PAGE indicated that the recombinant protein had relatively high thermal stability. To conclude, our results showed that the ΔNspSEM recombinant protein was successfully expressed and that the purified protein exhibited a compact conformation similar to the natural one in solution,which can provide a basis for insight into the structure and function of SEM protein.

staphylococcal enterotoxin M; prokaryotic expression; purification; mass spectrometry; circular dichroism;fluorescence emission spectroscopy; thermal stability

10.7506/spkx1002-6630-201724007

TS201.1

A

1002-6630（2017）24-0040-07

2016-11-12

國家自然科學基金面上項目（31371781）；四川省應用基礎項目（2014JY0253）；

西南民族大學大學生創新創業訓練計劃項目（201610656053）；四川省教育廳項目（15ZB0482）作者簡介：劉驥（1978—），男，講師，博士，研究方向為食品與生物技術。E-mail：liuji965@aliyun.com

*通信作者：唐俊妮（1971—），女，教授，博士，研究方向為食品安全與食品微生物。E-mail：junneytang@aliyun.com

劉驥, 楊帆, 田萬帆, 等. 金黃色葡萄球菌M型腸毒素原核表達、純化、鑒定及溶液構象分析[J]. 食品科學, 2017,38(24): 40-46.

10.7506/spkx1002-6630-201724007. http∶//www.spkx.net.cn

LIU Ji, YANG Fan, TIAN Wanfan, et al. Prokaryotic expression, purification, identification and solution conformation of staphylococcal enterotoxin M[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 40-46. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724007. http∶//www.spkx.net.cn