影響熒光假單胞菌J-8產藍色色素的培養(yǎng)基成分及色素的穩(wěn)定性研究

魏 蜜，張 偉，陳嘉敏，周 飛，劉云霞

(1.湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北工程學院 生命科學技術學院，湖北 孝感 432000)

影響熒光假單胞菌J-8產藍色色素的培養(yǎng)基成分及色素的穩(wěn)定性研究

魏 蜜1,2，張 偉1,2，陳嘉敏1,2，周 飛2，劉云霞2

(1.湖北工程學院 特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北工程學院 生命科學技術學院，湖北 孝感 432000)

從蘆薈的腐爛組織中篩選獲得一株能產藍色色素的熒光假單胞菌J-8。該菌株在不同培養(yǎng)基上產藍色色素能力不同或者喪失，為找出促進J-8產藍色色素的關鍵培養(yǎng)基成分，在固體培養(yǎng)條件下采用平板劃線法研究了不同培養(yǎng)基配方、碳源、氮源、無機鹽等對J-8菌株產藍色色素的影響。結果表明：單糖是促進J-8菌株產藍色色素的關鍵成分，且六碳糖比五碳糖更能促進J-8產藍色色素。同時研究了pH、溫度、氧化劑、還原劑、光照和金屬離子對該菌株產生的藍色色素穩(wěn)定性的影響，結果表明：該色素不耐高溫，在中性和避光條件下保存較好，在氧化劑和還原劑長時間存在下不穩(wěn)定，Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+對該色素有一定的固色和增色作用。該研究為開發(fā)并保存新的天然微生物藍色色素提供參考依據(jù)。

熒光假單胞菌J-8；藍色色素；培養(yǎng)基成分；穩(wěn)定性

熒光假單胞菌是一類常見于土壤中的革蘭氏陰性桿狀細菌[1]，能夠同時分泌多種色素，產生水解酶和鐵載體等化合物，這些色素物質、水解酶和鐵載體化合物有的還具有抗生素能力，能防治多種植物病害，因此也是一種重要的植物病害生防菌和根際促生菌[2-4]。1942年， “Pyoverdine”這一名稱首次被Turfreijer提出，專指熒光性假單胞菌群能分泌黃綠色熒光，具有水溶性的色素，1958年，Elliott等[5]將泛指熒光性假單胞菌群分泌出的各色色素統(tǒng)稱該名稱。

微生物色素一般是菌體在生長后期合成的一種次級代謝產物。比如綠膿桿菌色素合成和調控需多個基因，操縱子和調控系統(tǒng)共同作用，其機制十分復雜。研究表明綠膿素的合成受多種因素影響，如細胞密度、營養(yǎng)條件、培養(yǎng)方式和抗生素的使用等[6]。自然界中，這種存在許多色素表達量差異巨大的菌株之間，其調控機制也未知[7]。

微生物色素相對于植物和動物色素具有較大優(yōu)勢，廣泛應用于食品、藥劑以及其他輕工業(yè)，具有重要的經(jīng)濟和社會效益[8-9]。國內外對熒光假單胞菌在生物防治方面有很多報道，但對其所產藍色色素的條件及色素穩(wěn)定性方面的報道相對較少[2，10]。本研究從蘆薈的腐爛組織中篩選獲得一株能產藍色色素的熒光假單胞菌J-8，但該菌種在不同培養(yǎng)基上產藍色色素能力不同或者喪失，因此，對J-8產藍色色素的關鍵培養(yǎng)基成分及色素的穩(wěn)定性展開研究，以期對天然微生物藍色素的開發(fā)、利用與保藏提供理論基礎和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種、試劑和培養(yǎng)基

熒光假單胞菌J-8由湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室鑒定保藏。

硝酸鉀、氯化鉀、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銨、雙氧水、抗壞血酸、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈣、硫酸鐵、硫酸鋅等，以上化學試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

培養(yǎng)基參照文獻配制[11]，LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH7.0～7.2；牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL，pH7.0～7.2；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL，自然pH；豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽100 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，水1000 mL，自然pH。

1.2儀器與設備

高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司GT10-1T)，生化培養(yǎng)箱(武漢一恒蘇凈科學儀器有限公司MJ-250)，旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠SY-2000)。

1.3方法

1.3.1 菌種活化

將保存在 4 ℃ 的菌種轉接至固體基礎培養(yǎng)基上，于 25 ℃ 恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使菌種充分活化。

1.3.2 關鍵培養(yǎng)基成分的研究方法

菌種在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的方法均采用平板劃線法，單因素分析。

(1) 不同基礎培養(yǎng)基對藍色色素產生的影響

挑選同一J-8單菌落分別接種在1.1中4種基礎培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基3個重復，將接種后的培養(yǎng)皿置于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6 h觀察菌落的生長情況和顏色，并記錄，下同。

(2) 氯化鈉和蛋白胨對藍色色素產生的影響

配制如下6種培養(yǎng)基，A：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基去掉氯化鈉；B：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中的氯化鈉換成等量硝酸鉀；C：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中的氯化鈉換成等量氯化鉀；D：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基；E：PDA培養(yǎng)基中添加氯化鈉；F：豆芽汁培養(yǎng)基中添加氯化鈉。將菌種接種在A、B、C、D、E和F培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

配制如下6種培養(yǎng)基，A：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基；B：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基去掉蛋白胨；C：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中蛋白胨換成等量黃豆粉；D：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中蛋白胨換成等量硫酸銨；E：PDA培養(yǎng)基加蛋白胨；F：豆芽汁培養(yǎng)基加蛋白胨。將菌種接種在A、B、C、D、E和F培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

(3) 碳源對藍色色素產生的影響

配制如下6種培養(yǎng)基，A：LB培養(yǎng)基加葡萄糖；B：LB培養(yǎng)基；C：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基加葡萄糖；D：牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基；E：PDA培養(yǎng)基中不加葡萄糖；F：豆芽汁培養(yǎng)基中不加葡萄糖。將菌種接種在A、B、C、D、E和F培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

配制如下8種培養(yǎng)基，A：PDA培養(yǎng)基；B：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成蔗糖；C：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成麥芽糖；D：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成淀粉；E：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成甘露糖；F：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成果糖；G：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成阿拉伯糖；H：PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成木糖。將菌種接種在以上8種培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

1.3.3 色素的粗提取及最大吸收波長的測定

將菌種接種于PDA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d后，得到含菌發(fā)酵液。8000 r/min離心10 min后取上清，旋轉蒸發(fā)后用10 mL 甲醇溶解，得到色素粗提物。將色素提取液，用紫外分光光度計進行全波長掃描，以甲醇溶劑作為空白對照，確定該藍色色素的最大吸收波長為390 nm。

1.3.4 藍色色素的穩(wěn)定性研究[12-14]

(1) 酸堿穩(wěn)定性

取藍色色素發(fā)酵液，用6 mol/L的HCl和4 mol/L的NaOH調節(jié)該色素的pH 值分別為1、3、5、7、9、11和13，30 ℃避光放置12 h后，在390 nm下測其吸光值。

(2) 熱穩(wěn)定性

取一定量的藍色色素發(fā)酵液分別置于4、25、40、60、80和100 ℃的恒溫水浴鍋中保溫120 min，在390 nm下測其吸光值。

(3) 對氧化劑還原劑的穩(wěn)定性

取一定量的色素發(fā)酵液以1:1加入0.1% H2O2混勻，30 ℃避光放置，每隔30 min取樣，在最大吸收波長下測其吸光度值。取一定量色素發(fā)酵液以1:1加入0.1%抗壞血酸混勻，30 ℃避光放置，每隔30 min取樣，在390 nm下測其吸光值。

(4) 對白熾光和紫外光的穩(wěn)定性

取等量的藍色色素發(fā)酵液6份，3份置于紫外燈下照射，3份置于白熾燈下照射。每隔2 h分別取樣，在390 nm下測其吸光值。

(5) 對金屬離子的穩(wěn)定性

取一定量的色素發(fā)酵液，分別以1:1加入濃度為0.05 mol/L的Ca2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+的離子溶劑混勻，在4 ℃下避光放置24 h后取樣，在390 nm下測其吸光值。

2 結果與分析

2.1 4種基礎培養(yǎng)基對菌落產藍色色素的影響

J-8接種在4種基礎培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，菌落顏色情況如圖1所示。結果表明，PDA培養(yǎng)基，豆芽汁培養(yǎng)基中菌落顏色顯藍色，有藍色色素產生；而LB培養(yǎng)基。牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基中菌落顯示乳黃色，沒有藍色色素產生。可見，不同培養(yǎng)基對J-8是否產生藍色色素有較大影響。A和B中相同的培養(yǎng)基成分是蛋白胨和氯化鈉，可能是抑制菌株產藍色色素的成分，同時也不排除酵母粉和牛肉膏的影響；C和D中相同的培養(yǎng)基成分是葡萄糖，可能是促進菌株產藍色色素的成分，同時也不排除在土豆和豆芽的浸提液中的某些成分對菌株產藍色色素的促進作用。因此，下面通過對培養(yǎng)基組成成分的逐一分析找出影響J-8是否產生藍色色素的關鍵因子。

圖1 4種培養(yǎng)基上J-8產藍色色素的情況

2.2氯化鈉和蛋白胨對菌落顏色的影響

為確定氯化鈉是否是抑制菌株產藍色色素的成分，將J-8接種在表1中6種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，結果表明，表1中A、B、C、D4種培養(yǎng)基上生長的菌落仍然都為乳黃色，而PDA和豆芽汁培養(yǎng)基中添加氯化鈉后菌株仍然為藍色，且色素深淺不變。這一現(xiàn)象說明氯化鈉不是抑制菌株產藍色色素產生的唯一因素，對菌株是否產藍色色素無影響。

表1 氯化鈉對菌株產藍色色素的影響

為確定蛋白胨是否是抑制菌株產藍色色素的成分，將J-8分別接種在表2中6種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，結果表明，表2中4種培養(yǎng)基的菌落都為乳黃色。PDA培養(yǎng)基和豆芽汁培養(yǎng)基中不含蛋白胨，這2種培養(yǎng)基上生長的菌株能產生藍色色素，當添加蛋白胨組分到這2種培養(yǎng)基中后，E、F培養(yǎng)基上生長的菌株同樣能產藍色色素，且色素深淺不變，這些現(xiàn)象說明蛋白胨不是抑制菌株產藍色色素產生的唯一因素，對菌株是否產藍色色素無影響。

表2 蛋白胨對菌落顏色的影響

2.3葡萄糖對菌落顏色的影響

為確定葡萄糖是否是促進菌株產藍色色素的成分，將J-8分別接種在表3中6種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后，結果表明，菌株在LB和牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基上生長原本不產生藍色色素，但在這2種培養(yǎng)基中添加葡萄糖后，菌株產藍色色素；菌株在PDA和豆芽汁培養(yǎng)基上生長原本產生藍色色素，但在這2種培養(yǎng)基中去掉葡萄糖后，菌株不產藍色色素，由此說明，葡萄糖可能是影響菌落藍色色素生成的關鍵因素。

表3 葡萄糖對菌落顏色的影響

2.4不同碳源對菌落產藍色色素的影響

為進一步考察葡萄糖或其他碳源對菌株產藍色色素的影響，將PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖換成其他等量碳源如蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘露糖、果糖、阿拉伯糖和木糖制作培養(yǎng)基，將J-8接種在這8種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后觀察菌落顏色情況，如圖2所示。結果表明：將PDA培養(yǎng)基中的葡糖糖替換成蔗糖、麥芽糖、淀粉時，菌株J-8不產生藍色色素；將PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖替換成其他單糖物質如甘露糖、果糖、阿拉伯糖和木糖時，菌株產藍色色素，且碳源為葡萄糖、甘露糖和果糖時比阿拉伯糖和木糖所產生的藍色色素更多，菌株在六碳糖存在時產藍色色素的能力更強。由此說明，碳源為二糖或多糖時，對菌落產生藍色色素沒有促進作用，而只有速效碳源單糖能促進菌落產生藍色色素，其中六碳糖的促進菌株產藍色色素的作用優(yōu)于五碳糖的促進作用。有研究表明，10%～15%的葡萄糖對鐵皮石斛內生真菌H1B1產生的紅色素增色效應最為明顯[15]。

表4 不同碳源對菌落顏色的影響

圖2 碳源對菌株產藍色色素的影響

注：A、B、C、D、E、F、G和H 8種培養(yǎng)基所對應的糖類分別是：葡糖糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、甘露糖、果糖、阿拉伯糖和木糖。

2.5 J-8產生的藍色色素的穩(wěn)定性分析

2.5.1 pH值對色素穩(wěn)定性的影響

在最大吸收波長390 nm下，考察不同pH值對藍色色素穩(wěn)定性的影響。結果(見圖3)表明，原液pH=4的吸光度最大，吸光值為1.028；pH在5～7時，吸光值減少不顯著；而在偏酸(pH≤3)或者偏堿(pH≥9)條件下，色素均發(fā)生了較明顯的褪色，且堿性條件下褪色更嚴重。說明該藍色色素在近中性條件下有較好的穩(wěn)定性，這一結果與郭瑞軍報道的由一株放線菌產生的棕色色素的性質類似[16]。

圖3 pH對色素穩(wěn)定性的影響

2.5.2 溫度對色素穩(wěn)定的影響

溫度對藍色色素穩(wěn)定性的影響見圖4，結果表明，25 ℃時吸光度最大，且經(jīng)過60 ℃以下的溫度處理其吸光值變化微量，在80 ℃條件下處理后下降12.3%，但經(jīng)過100 ℃處理后吸光度值下降35.0%。說明該藍色色素在低于60 ℃的環(huán)境下吸光度穩(wěn)定，但高溫條件下(>80 ℃)吸光度下降較快，色素穩(wěn)定性較差。這與類球紅細菌紅色素及鐵皮石斛內生真菌H1B1 產紅色素對溫度的穩(wěn)定性結果相似[15，17]。建議此藍色色素置于60 ℃以下保藏。

2.5.3氧化還原劑對色素穩(wěn)定的影響

氧化劑和還原劑對藍色色素穩(wěn)定性的影響見圖5。結果表明，隨著氧化劑和還原劑存在時間增加，樣品吸光值都呈下降趨勢，在氧化劑和還原劑存在的前4小時內，樣品的吸光值下降很緩慢，超過4小時后，吸光值直線下降，說明氧化劑和還原劑長時間存在均不利于該藍色色素的穩(wěn)定和保存。表明氧化劑和還原劑對不同色素穩(wěn)定性的影響表現(xiàn)不同，張馨等報道還原劑Na2SO3對產紫青霉菌生產的紅色色素有一定的增色作用[18]，牛世全報道稱氧化劑H2O2對放線菌產生的藍色色素有較強的消色作用，而還原劑Na2SO3對該藍色色素影響不大[19]，因此氧化劑和還原劑對不同微生物產生的不同色素的影響應分別檢測分析。

圖4 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

圖5 氧化劑和還原劑對色素穩(wěn)定性的影響

2.5.4 光照對色素穩(wěn)定性的影響

紫外光和白熾光對藍色色素穩(wěn)定性的影響見圖6，隨著照射時間的延長，兩種燈光照射都使菌株J-8產生的藍色色素吸光值降低，且在白熾燈下，色素的吸光值降低的幅度更大，速度更快；這與牛世全等報道的放線菌產生的藍色色素對光照的穩(wěn)定性結論相反[19]，可見不同的藍色色素對光的敏感性不同，本實驗結果表明，此藍色色素對光的穩(wěn)定性較弱，最好避光保持。

2.5.5 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響

金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響見圖7，大多數(shù)金屬離子Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+對該藍色色素的影響很小，且它們均使藍色色素的吸光值略微增大，說明這4種金屬離子對該色素有一定的固色和增色作用。但Fe2+和Fe3+的存在使該藍色色素的吸光度增幅較大，尤其是Fe3+的影響十分顯著，溶液呈紅褐色，推測是熒光假單胞菌產生的噬鐵素與Fe3+反應形成的，有研究報道，假單胞菌屬細菌產生的鐵載體主要有 3 種類型，其中膿青素與過量Fe3+會使其水溶液呈紅褐色，使色素的吸光值顯著增加[20]。

圖6 紫外光和白熾光對藍色色素穩(wěn)定性的影響

圖7 金屬離子對色素吸光值的影響

3 結論

大多微生物在生長代謝過程中都能分泌多種顯色物質，其中假單胞菌屬細菌產色素物質的特性比其他微生物更為顯著[21]。該屬細菌產生的色素化合物顏色豐富，有紅色、藍色、黃綠色、黃色、褐色、黑色等[22]。近些年，對熒光假單胞菌引發(fā)的食品安全問題研究較多，Leonardo Caputo 報道了通過牛乳鐵蛋白防止由熒光假單胞菌引起馬蘇里拉奶酪的藍色變色及延遲相關的腐敗細菌的生長[23]。Cenci-Goga等建立了一個體系來探究熒光假單胞菌引起的馬蘇里拉奶酪的腐敗、顏色異常和儲藏條件之間的聯(lián)系[24]。本文從蘆薈軟腐組織中分離出一株能夠產藍色色素的熒光假單孢菌J-8，通過單因素實驗找出了影響J-8產藍色色素的關鍵培養(yǎng)基成分是碳源，并探究出單糖類的六碳糖是決定該菌種是否產藍色色素的關鍵因素，這一結論對奶制品、肉類等日常食品的腐敗變色是否由熒光假單胞菌引發(fā)有一定的指示作用。但是，六碳糖能夠促進熒光假單胞菌J-8產生藍色色素的原因及相關作用機制，現(xiàn)在尚不明確，有待進一步的研究。色素的穩(wěn)定性是色素在應用中的一個重要問題，色素穩(wěn)定性的好壞將直接影響到著色物質的色澤和品質，因此，色素的生產應用價值很大程度上取決于其穩(wěn)定性[25]。本文研究了pH、溫度、氧化劑、還原劑、光照和金屬離子對該菌株產生的藍色色素穩(wěn)定性的影響，研究表明該色素不耐高溫，在氧化劑和還原劑長時間存在的條件下不穩(wěn)定，且應盡量避免光照，除Fe3+外，大多數(shù)金屬離子Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+對該色素有一定的固色和增色作用。以后的工作可針對該藍色色素的物質基礎、呈色機理等方面展開進一步深入研究。

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(責任編輯：熊文濤)

StudyontheMediumComponentsAffectingtheProductionofBluePigmentandItsStabilityProducedbyPseudomonasfluorescensJ-8

Wei Mi1,2, Zhang Wei1,2, Chen Jiamin1,2, Zhou Fei2, Liu Yunxia2

(1.HubeiKeyLaboratoryofQualityControlofCharacteristicFruitsandVegetables，HubeiEngineeringUniversity，Xiaogan，Hubei432000，China;2.SchoolofLifeScienceandTechnology,HubeiEngineeringUniversity,Xiaogan,Hubei432000,China)

Abstract：A strain identified as Pseudomonas fluorescens and named J-8 was screened from decaying aloe in the laboratory. The ability to produce blue pigment was different or lost in different medium. In order to find the critical medium components which affect the production of blue pigment produced byPseudomonasfluorescens, the change of colony color in different medium with different carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts were studied. The results suggested that mono-saccharose was the key factor to promote the production of blue pigment. And the hexose played a greater role than pentose. The stability of the blue pigment was also studied under different pH, temperates, oxidants, deoxidizers, illumination and metal ions. It indicated that the pigment was not resistant to high temperature. It was better preserved under the condition of neutral light and being kept in the dark. It was not stable in the long-time presence of oxidant and reducing agent. Metal ions Ca2+,Zn2+, Cu2+and Mg2+had certain fixing and color enhancement effects on this blue pigment. The study provided scientific basis for the development and preservation of the natural microbial blue pigment.

PseudomonasfluorescensJ-8; blue pigment; medium components; stability

TS201.3; TS202.3

A

2095-4824(2017)06-0011-07

2017-08-23

湖北省自然科學基金青年項目(2016CFB204)；國家自然科學基金資助項目(31600055)

魏 蜜(1987- )，女，湖北孝感人，湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室、生命科學技術學院講師，博士。