內蒙古草原土壤有機物提取分離及鑒定*

劉盛蘭 劉洪林 阿拉木斯? 李加榮?趙章濤 張 奇 吳洪新 王 海 紀 磊 秦 艷

（1 北京理工大學化學與化工學院，北京 102488）

（2 中國農業科學院草原研究所，呼和浩特 010018）

內蒙古草原土壤有機物提取分離及鑒定*

劉盛蘭1劉洪林2阿拉木斯2?李加榮1?趙章濤1張 奇1吳洪新2王 海2紀 磊2秦 艷2

（1 北京理工大學化學與化工學院，北京 102488）

（2 中國農業科學院草原研究所，呼和浩特 010018）

土壤中的有機物對于斥水性的研究具有重要的作用，但是目前關于內蒙古草原土壤的研究主要集中在有機碳上，而對土壤中有機物種類的研究很少。選取內蒙古錫林浩特市南部的牧草土壤樣品，使用溶劑超聲萃取的方法，對土壤中的有機物進行了分析。結果發現，石油醚的粗提物最少，異丙醇/氨水（7∶3）的粗提物最多。粗提物經紫外、紅外和GC-MS測定，結果表明用石油醚、異丙醇和甲醇作為萃取劑，得到的有機物主要為直鏈或環烴化合物，含量占總提取物的95%以上；氯仿及異丙醇/乙酸（7∶3）和異丙醇/氨水（7∶3）提取物除了含有直鏈或環烴化合物外，還含有酯、酰胺和甾類化合物，且甾類化合物在異丙醇/氨水提取物中含量相對最高。采用異丙醇/氨水對所有土壤樣品進行萃取，發現NM1和NM7提取物中甾類化合物的含量較高，占總提取物的25%左右。異丙醇/氨水的粗取物用石油醚：乙酸乙酯（4∶1）作洗脫劑，經柱層析分離主要得到A、B兩部分；經GC-MS測定、質譜圖庫檢索表明A為甾酮類物質，B為不含氧的甾烯類或者甾醇類物質。

土壤有機物；超聲提??；GC-MS；柱色譜；甾類化合物

內蒙古草原屬于半干旱氣候區，不僅是我國肉、奶的重要產地之一，也是我國北部地區極為重要的生態屏障［1］。近幾十年來，由于不合理利用和持續干旱導致草原土壤嚴重退化，土壤接納和保蓄降水的能力降低，斥水性嚴重。研究表明，造成土壤斥水性的主要原因是土壤中的有機物（烷烴、脂肪酸/酯、植烷醇、植烷和固醇、酰胺、醛/酮和復雜的環狀化合物）［2-7］，其主要來源于植物根莖葉及其分泌物、真菌和其他微生物的代謝產物、以及土壤污染等［8-11］。目前研究發現土壤中的有機物主要包括直鏈烷烴、酸類、醇類、石蠟、萜類、甾類、蠟、單酮、β-二酮和酯類化合物等［12-13］，且地區不同、土層深度不同所含有機物的種類和含量均有差別［14-18］。國內有關土壤有機物的研究主要集中在土壤總有機碳分布［19-21］、土壤中有機污染物的提取鑒定［22-23］以及土壤中有機物類型的研究［24-25］，而少有對土壤中有機物進行全面地分離鑒定。為此，為確切知道內蒙古草原土壤有機物的分布、種類及含量，以便于構建某種有機物與斥水性的關聯，本文選取內蒙古草原典型土壤樣品，采用溶劑超聲萃取、柱層析分離，GC-MS鑒定首次明確了內蒙古草原土壤有機物的種類和含量，為進一步研究土壤有機物與斥水性的關系提供基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于內蒙古錫林浩特市南部草原地區，地理坐標為43°33′～43°55′ N，116°06′～116°43′ E，海拔1 061～1 250 m，氣候屬中溫帶半干旱大陸性氣候。研究區年平均氣溫0.57 ℃，年均降水量350.4 mm，平均日照時數為2 617.5 h。風活動頻繁，全年大風天數達71 d，4—6月最為頻繁，一般占全年大風天數1/2左右。

1.2 供試材料

供試土壤為栗鈣土。2015年6月于研究區每間隔一定距離設定一個采樣點，共采集土壤樣品7個，依次編號為NM1、NM2、NM3、NM4、NM5、NM6、NM7，采樣深度為0～5 cm。土壤樣點基本情況見表1。所采集樣品室內風干，剔除根系、礫石等雜質后過2 mm篩備用。

表1 土壤樣點的基本情況Table 1 Base information of the soil sample

試驗所用試劑為分析純。

1.3 土壤有機物的提取

分別采用石油醚（60～90 ℃）、氯仿、異丙醇、甲醇、異丙醇/乙酸（5.2 mol L-1）（7∶3）、異丙醇/氨水（14.8 mol L-1）（7∶3）對NM4土壤樣品進行提取，提取物依次編號為NM4-1、NM4-2、NM4-3、NM4-4、NM4-5、NM4-6。方法參照文獻［26，3］，具體步驟如下：稱取500.00 g土壤樣品于1 L燒杯中，分別加入500 ml提取劑，用塑料膜封口，浸泡過夜后超聲提取30 min（KQ5200B超聲波器，超聲頻率：40 kHz，超聲功率：200 W），抽濾，將濾液在旋轉蒸發儀上減壓除去溶劑（40～55 ℃），并將提取物真空干燥，稱量不同溶劑提取物的質量。

將異丙醇/氨水和異丙醇/乙酸提取物再次溶于200 ml氯仿/水（1∶1）溶液中進行萃?。?］，靜置后溶液分為兩層，上層為水相，主要含有兩親化合物和極性化合物，下層為氯仿相，主要含脂類化合物［4］。將氯仿相減壓濃縮至干（40 ℃），稱量氯仿相化合物的質量。

采用異丙醇/氨水分別對NM1～NM7這7種土壤樣品一一進行超聲提取，提取物編號依次為NM1-6、NM2-6、NM3-6、NM4-6、NM5-6、NM6-6、NM7-6。具體操作為：稱取不同土壤樣品500.00 g于1 L燒杯中，加入500 ml 異丙醇/氨水（14.8 mol L-1）（7∶3），用塑料膜封口，浸泡過夜后超聲提取30 min，抽濾，將濾液在旋轉蒸發儀上減壓除去溶劑（55 ℃）。提取物用200 ml氯仿/水（1∶1）溶液進行萃取，將氯仿相減壓濃縮至干（40 ℃），稱量氯仿相化合物的質量。

1.4 土壤提取物的鑒定

土壤提取物的鑒定主要采用紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、GC-MS等進行。

紫外可見光光譜測定，從每個提取液中取出少量液體，用TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）測定，掃描范圍為200～800 nm，來觀察提取物的吸收情況。為避免濃度的差異對特定波長吸收值的影響，單位濃度單位濃度吸光值為將所測樣品的濃度稀釋至1 mg L-1后測定的值。

紅外光譜的測定，使用美國Pcrkin-Elimer公司XT4A傅立葉紅外光譜儀，實驗中采用KBr壓片。用毛細管蘸取少量提取物于離心管中，然后加入適量丙酮（分析純）溶解，把樣品均勻地涂抹在KBr薄片上，并用該丙酮溶液為背景，掃描波長為450～4 000 cm-1。

GC-MS的測定采用Thermo Fisher-DSQ氣質聯用儀，溶劑為氯仿（色譜純），進樣量1 μl，不分流進樣。色譜條件：色譜柱為AB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，柱溫80 ℃持續2 min，以10 ℃ min-1的升溫速率升溫至300 ℃，保持15 min；進樣口溫度250 ℃；載氣為He，載氣流量1.0 ml min-1。質譜條件：離子源為EI源；離子源溫度250 ℃；電子能量70 eV；掃描模式全掃描；掃描范圍（m/z）35.0～650.0 amu。GC-MS數據應用標準質譜譜庫NIST02獲得，采用面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.5 土壤有機物的分離

首先選用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及甲醇及其混合溶劑對異丙醇/氨水的提取物進行展開，圖1a為石油醚、氯仿和乙酸乙酯的展開結果，未能展開；圖1b為甲醇的展開結果，所有的樣品全爬至薄層頂端。改用乙酸乙酯：石油醚（1∶4）混合展開劑（圖1c），254 nm處有一非常明顯的點（c1：A，Rf=0.56）；當用糖顯色時發現還有一點（c2：B，Rf=0.21）。研究選用該展開劑對粗提物進行柱層析，以期得到點A、B提取物。（層析板型號：HSGF254；涂層厚度：0.2 mm±0.03 mm；硅膠粉粒度：10～40 μm）

確定展開劑后進行柱層析實驗分離土壤有機物。采用濕法裝柱，硅膠填充，柱尺寸為26 mm ×203 mm；干法裝樣，乙酸乙酯：石油醚（1∶4）洗脫，Rf值相同的試樣濃縮，濃縮物用于GC-MS分析。

圖1 不同展開劑薄層板展開情況Fig. 1 Development on thin layer plates using different developing agents

1.6 數據處理

數據采用Origin 9.0軟件進行分析處理及圖譜疊加。

2 結果與討論

2.1 不同提取劑對土壤有機物提取的影響

石油醚、氯仿、異丙醇、甲醇、異丙醇/乙酸和異丙醇/氨水6種提取劑對NM4土壤樣品的提取情況見表2。

由表可知，使用不同提取劑，粗提物的外觀和質量均有差異。異丙醇/氨水的氯仿提取物最多，達0.61 g，而石油醚、氯仿、異丙醇和甲醇提取物相對較少。不同溶劑的提取物的外觀也不相同，石油醚、氯仿、異丙醇提取物為黃色；而異丙醇/乙酸、異丙醇/氨水的提取物為深褐色。

各提取物的紫外光譜見圖2。由圖2可知，所有提取物的紫外-可見光吸收波長均集中在200～480 nm范圍內，且石油醚、氯仿、異丙醇/乙酸和異丙醇/氨水的提取物在230 nm左右吸光度開始急劇上升，至240 nm左右達到最高吸收峰值，然后開始下降。異丙醇/乙酸和異丙醇/氨水提取物在390 nm左右存在一吸收平臺。甲醇和異丙醇提取物在200 nm處急劇上升到達最高吸收峰值209 nm，然后開始下降。所有提取物的吸收值隨著波長減小呈上升趨勢，并在260 nm或280 nm附近有一吸收平臺，這與腐殖酸的紫外光譜的基本特征類似［27］，表明所有提取物中可能均含有腐殖酸。

表2 不同溶劑提取NM4樣品得到的化合物Table 2 Compounds extracted from NM4 samples using different solvents

圖2 NM4樣品不同溶劑提取物的紫外光譜Fig. 2 UV spectra of the extracts of NM4 relative to solvent

各提取物的紅外光譜見圖3，由圖3可知，石油醚、氯仿、異丙醇、甲醇和異丙醇/乙酸及異丙醇/氨水的光譜基本相似，主要的峰分別為2 960 cm-1（CH3）、2 920 cm-1（CH2）、2 850 cm-1（CH2）、1 732 cm-1（C=O）、1 460 cm-1（CH2）和1 375 cm-1（C-CH3）［28］；甲醇和異丙醇/氨水及異丙醇/乙酸提取物在1 667 cm-1附近還有一個吸收強度稍弱的吸收峰，可能為芳環骨架或酰胺締合C=O雙鍵。

NM4提取物的GC-MS總離子流色譜圖見圖4。由圖4可知，不同提取物的GC-MS的峰基本一致，主要集中在保留時間為17～30 min內［7］，NM4-1石油醚提取物在保留時間27 min后基本沒有峰，可能是因為石油醚的極性較小，所提物質較少所致。

圖3 NM4樣品不同溶劑提取物的紅外光譜Fig. 3 IR spectra of the extracts of NM4 relative to solvent

用NIST02標準質譜庫對NM4提取物的GC-MS進行檢出，相應峰值可能對應的檢出物及其含量見表3。結果表明石油醚、異丙醇和甲醇的提取物主要為直鏈或環烴類化合物；兩種醇的提取物所含化合物基本相同，但甲醇提取物中還鑒定到芥酸酰胺；氯仿及異丙醇/氨水和異丙醇/乙酸三者的提取物中除了含有直鏈或環烴化合物外還包括酯類、酰胺類和甾類化合物，其中異丙醇/氨水和異丙醇/乙酸的提取物中還含有酚、脂肪酸等化合物。

由提取物的相對含量可以看出：石油醚、異丙醇和甲醇提取物中烴類含量占總提取物的95%以上，氯仿提取物中烴類含量占總提取物的90%左右，而異丙醇/氨水和異丙醇/乙酸提取物中烴化物僅占總提取物的70%左右。烴化合物是這6種提取物中含量最多的化合物，且碳原子數為20～31的長直鏈脂肪烴化合物，而且C23的直鏈烴含量最高。甾類化合物（主要為谷甾醇）僅從氯仿、異丙醇/氨水和異丙醇/乙酸作為溶劑時提取到的化合物中檢測到，相對含量均不高，其中異丙醇/氨水提取到的甾體類化合物含量相對最高［4］。

2.2 不同采樣地點對土壤有機物提取的影響

采用前述提取NM4-6樣品的工藝，對其他樣品進行處理，粗提物的外觀和重量見表4。由表4可知，不同地點的異丙醇/氨水提取物有一定差別，NM5和NM6樣品的提取物重量最少，其他地點的樣品提取物重量差不多，NM3提取物重量最高。

紫外光譜結果顯示，異丙醇/氨水對不同地點的提取物在200～480 nm范圍內均有吸收，在波長230 nm左右吸光度開始急劇上升，至240 nm左右達到最高吸收峰值，而后開始下降，情況與圖2相似。

紅外光譜中，異丙醇/氨水對不同樣品提取物的紅外特征吸收峰基本一致，且與圖3相似，不同的是1 215 cm-1、1 170 cm-1和1 042 cm-1附近有較弱的吸收峰，可能來自酯鍵或醇的C-O-C擾動吸收；且在3 300 cm-1附近有一吸收峰，可能是氨基或者羥基的吸收峰。

異丙醇/氨水對不同樣品的提取物對應的可能化合物及含量見表5。通過GC-MS對這七個樣品的初步鑒定結果顯示，七個采樣地點所含化合物基本相同，大致有30個，主要是酚、酯、烴、酸、酰胺、甾等六種化合物，這與文獻中報道的土壤提取物所含有的種類基本一致［12-13］。

圖4 NM4樣品不同溶劑提取物的總離子流色譜Fig. 4 Total ions chromatogram of the extracts of NM4 relative to solvent

在檢測到的有機化合物中烴類物質占有很大比重，主要是一些長直鏈烴類化合物，碳鏈長度集中在C20～C27之間，其中NM1、NM2和NM7樣品中含直鏈烴的比例在30%左右，其他樣品中直鏈烴類高達60%左右；除了NM1和NM6樣品中C22的烴類最多外，其余樣品中C23的烴最多。此外，還有一些帶有支鏈的長鏈烴和一些烯烴，但含量相對較少。

酚類化合物主要在前五個樣品中檢測到，且含量相對較少，僅占檢測到的化合物的1%～4%；前六個樣品所含棕櫚酸及其酰胺等長直鏈酸或酰胺的含量在10%～17%之間［4］，而NM7所含該類物質的含量高達34%左右；樣品檢測所含檸檬酸三乙酯及鄰苯二甲酸二丁酯等酯的含量占到總檢有機物的15%～25%之間。Morley等［7］從土壤提取物中鑒定出了甾類化合物，包括一些甾醇類及甾酮類化合物。在樣品NM1和NM7中該類物質含量在25%～29%之間，而其余樣品含量相對較少在2%～13%之間，尤其是γ-谷甾醇［29］，其在各個樣品中均有鑒別到并且其相對含量均在2%以上，NM1-6及NM7-6樣品中的該提取物達到15%左右。

2.3 GC-MS對柱色譜分離后得到的化合物鑒定結果

異丙醇/氨水所有提取物經過柱色譜分離純化后，分別收集到在薄層板上顯示Rf為0.56和0.21（A、B）兩部分物質，其總離子流色譜見圖5。A部分的化合物主要出峰時間集中在30～34 min之間，而B部分的化合物主要集中在25～30 min之間。對它們分別進行GC-MS分析，A部分的GC-MS總離子流色譜圖出峰比較明顯，分離效果較好，有四個相對較大的峰，由質譜圖庫檢索每個峰所對應的化合物主要為甾酮類物質（表6），占總量的80%左右。B部分的GC-MS總離子流色譜圖峰型相對比較復雜，峰比較多，化合物沒有完全分離開，由質譜圖庫檢索每個峰所對應的可能化合物為甾烯類或者甾醇類物質（表6），其中甾醇的含量較高，占總量的85%以上，甾烯的含量較少，只占7%左右。

表3 NM4提取物及其相對含量Table 3 Extracts of NM4 and their relative contents

表4 異丙醇/氨水對不同樣品提取物的情況Table 4 Extracts from different samples using isopropanol/ammonia

表5 不同地點樣品用異丙醇/氨水提取得到的主要化合物Table 5 Main compounds extracted from different samples with isopropanol/ammonia

圖5 柱色譜分離的A、B部分的總離子流色譜Fig. 5 Total ions chromatogram of A and B after column chromatography

表6 A和B部分通過GC-MS鑒定所得化合物表Table 6 Compounds identified with GC-MS in A and B

3 結 論

先經溶劑超聲萃取，再用柱色譜進行分離，對典型內蒙古草原牧草土壤有機物分離提取發現使用石油醚、異丙醇和甲醇等單溶劑超聲萃取所得萃取物主要為直鏈或環烴類化合物；而氯仿及異丙醇/乙酸和異丙醇/氨水的超聲萃取物除了含有直鏈或環烴化合物外，還包括酯類、酰胺類和甾類化合物。以石油醚：乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，對異丙醇/氨水的萃取物進行柱色譜分離，可以得到兩部分化合物（A和B）；經GC-MS測定，前者主要含有四種化合物，其中甾酮物占到80%左右；后者所含有化合物較多，主要為甾烯和甾醇化合物，占到總量的90%左右。

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（責任編輯：盧 萍）

Isolation and Identification of Soil Organic Matter in Inner Mongolia Grassland

LIU Shenglan1LIU Honglin2A Lamusi2?LI Jiarong1?ZHAO Zhangtao1ZHANG Qi1WU Hongxin2WANG Hai2JI Lei2QIN Yan2
（1 Beijing Institute of Technology School of Chemistry and Chemical Engineering，Beijing 102488，China）
（2 Institute of Grassland Research of CAAS，Huhhot 010018，China）

【Objective】Inner Mongolia grassland is not only one of the important meat and milk production areas of China，but also an important ecological barrier in North China. In recent decades，in addition to global climate warming and continuous drought，unreasonable use of the land resources has caused severe degradation of the grassland，and reduction of the soil’s capacity of accommodating rain water. Consequently，the soil is becoming more and more water repellent. In order to find out causes of water repellency and to help to solve the problem，it is necessary to get to know exactly distribution，species and content of the soil organic matter in the grassland，and especially relationship of the organic compounds with soil water repellency，so as to facilitate monitoring and eliminating soil water repellency. The purpose of this paper is to establish a method for separation and purification of soil organic compounds in the grassland，to obtain some certain-structured organic matter，and to lay down some foundations for further studies on relationship of the organic compounds with soil water repellency.【Method】In this paper，soil samples were collected from the surface soil layer（0～5cm）of a tract of forage grassland in the south of Xilinhot city，Inner Mongolia and petroleum ether，chloroform，isopropanol，methanol，isopropanol/acetic acid（7∶3），isopropanol/ammonia（7∶3），different in polarity were used as extraction agent for ultrasonic extraction of the soil samples. Crude extracts were tentatively identified with UV，IR and GC-MS，and then processed with column chromatography to get different species of organic compounds.【Result】The following findings were obtained. The crude extract，using isopropanol/ammonia，isopropanol/acetic acid as extraction agents was quite large in quantity，while those using petroleum ether，chloroform，isopropanol and methanol as extraction agents was less. The extracts using different solvents differed in appearance，the crude extracts using petroleum ether，chloroform，and isopropanol appeared to be yellow；while those using isopropanol/acetic acid and isopropanol/ammonia，dark brown. The UV-Vis absorption wavelengths of all the crude extracts were concentrated in the range of 200～480 nm. The crude extracts，though using different extractants，were basically quite similar in infrared spectrum，but their chief absorption peak appeared separately at 2 960 cm-1，2 920 cm-1，2 850 cm-1（C-H stretching vibration），1 732 cm-1（C‖O）1 460 cm-1and 1 375 cm-1（C-H，C-C bending vibration）. Besides a relatively weak absorption peak was observed in the vicinity of 1 667 cm-1，in the IR spectra of the crude extract using methanol and isopropanol/ammonia and isopropanol/acetic acid，reflecting the existence of aromatic skeleton or amide associated with a C=O double bond. Comparison between the GC-MS of the crude extracts and the standard mass spectra reveals that hydrocarbons made up about 95% of the crude extract using petroleum ether，isopropanol or methanol extract，and only about 70% of the total extract using isotropanol/ammonia or isopropanol/acetic acid extracts，and both were dominated with C23linear hydrocarbon. Steroid（mainly sitosterol）was only detected in the crude extracts using chloroform，isopropanol/ammonia and isopropanol/acetic acid. The crude extract using isopropanol/ammonia was further separated and purified with column chromatography，and then two portions of substances displaying Rf=0.56 and 0.21（A，B）（petroleum ether：ethyl acetate =4∶1），respectively，were obtained on the plate. In the GC-MS spectra，the retention time of the compound in Part A varied mainly in the range of 30～34 min，while that in Part B mainly in the range of 25～30 min.【Conclusion】The crude extract using petroleum ether，isopropanol or methanol as extractant was composed mainly of linear or cyclic hydrocarbons；and that using chloroform，isopropanol/acetic acid（7∶3）or isopropanol/ammonia（7∶3）mainly of esters，amides and steroids besides in addition to linear or cyclic hydrocarbons. The crude extract using isopropanol/ammonia（7∶3）was separated into Part A and Part B with column chromatography. Part A was identified as steroidal ketones，and Part B as oxygen-free sterenes or sterols with GC-MS and MS library search.

Soil organic matter；Ultrasonic extraction；GC-MS；Column chromatography；Steroids

S153.6

A

10.11766/trxb201704190629

* 國家自然科學基金項目（41471198）和國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2014CB138801）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41471198）and the National Key Basic Research Program of China（No.2014CB138801）

? 通訊作者 Corresponding author，E-mail：alms721@163.com，jrli@bit.edu.cn

劉盛蘭（1992—），女，湖南人，碩士研究生，主要從事土壤有機質的研究。E-mail：2120151204@bit.edu.cn

2017-04-19；

2017-06-11；優先數字出版日期（www.cnki.net）：2017-07-25