蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖的提取及其體外抗氧化活性研究

劉雨博，欒君笑，佟長青，李 偉，金 橋

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，遼寧大連 116023）

蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖的提取及其體外抗氧化活性研究

劉雨博，欒君笑，佟長青，李 偉，*金 橋

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，遼寧大連 116023）

以蝦夷扇貝裙邊為原料，采用復(fù)合蛋白酶進行酶解，研究糖胺聚糖的最佳提取工藝條件及其體外抗氧化活性。結(jié)果表明，酶解蝦夷扇貝裙邊提取糖胺聚糖的最優(yōu)工藝條件為提取時間3.0 h，酶添加量0.8%，提取溫度50℃，料液比1∶2，糖胺聚糖提取率為1.27%。體外抗氧化試驗結(jié)果表明，提取的蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖具有較好的抗氧化活性，可清除·OH，O-2·，DPPH·，其清除能力與濃度具有顯著的量效關(guān)系。

蝦夷扇貝裙邊；糖胺聚糖；提取；抗氧化性

蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensis） 屬軟體動物門扇貝科，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，由其干制的扇貝柱是高檔的海產(chǎn)品。扇貝裙邊是在扇貝加工過程中取出扇貝柱后的下腳料，約占整個扇貝的30%。近年來，我國的扇貝養(yǎng)殖已相當(dāng)普及，而在加工貝柱的過程中產(chǎn)生了大量的扇貝裙邊，這些扇貝加工廢棄物只有部分被用于生產(chǎn)飼料、肥料等低附加值產(chǎn)品，甚至有的被當(dāng)作廢料直接丟棄，對其中有價值的成分并未充分利用，不僅浪費資源，還會污染環(huán)境。其實，扇貝裙邊的營養(yǎng)成分與扇貝柱十分接近[1]，如何深度開發(fā)扇貝裙邊，對水產(chǎn)品加工綜合利用和保護環(huán)境有重要意義，也能促進我國水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

近年來的研究表明，扇貝裙邊中含有活性多肽、氨基多糖、不飽和脂肪酸、牛磺酸等多種生理活性物質(zhì)[2]。糖胺聚糖又稱氨基多糖，是氨基己糖和己糖醛酸重復(fù)聚合形成的長鏈不分支多糖，廣泛存在于動物體內(nèi)。海洋貝類的糖胺聚糖具有抗腫瘤[3-8]、抗凝血[9]、降血脂[10]、增強機體免疫力[11-13]、抗病毒[14]等生物活性。試驗以蝦夷扇貝裙邊為原料，對扇貝裙邊中糖胺聚糖的提取工藝及體外抗氧化活性進行初步研究，以期為蝦夷扇貝的精深加工和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦夷扇貝裙邊，大連漁大叔海洋食品有限公司提供，放置于冰柜中冷凍備用；胰蛋白酶（1∶250）、堿性蛋白酶（1∶200000），北京索萊寶（Solarbio） 科技有限公司提供；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

BS-110S型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；UV-1750型紫外分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司產(chǎn)品；GL-21M型離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；HH-A型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；HG202-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，南京實驗儀器廠產(chǎn)品；SD-1500型噴霧干燥機，上海沃迪自動化裝備股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖的提取

蝦夷扇貝裙邊用組織搗碎機研磨成糜，將堿性蛋白酶和胰蛋白酶按活力單位7∶3的比例混合作為酶解用復(fù)合酶進行酶解，改變溫度、pH值、酶添加量和時間等因素，利用正交試驗優(yōu)化提取工藝，樣品液離心后，等電點除雜蛋白，凍干后即為蝦夷扇貝糖胺聚糖粗品（PYSG）。提取結(jié)果以提取率為評價指標，糖胺聚糖含量的測定采用阿利新藍比色法[15]。

1.2.2 對·OH的清除作用[16]

取10 mL具塞試管11支，各加9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液1 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，樣品組加入一定濃度的多糖溶液2 mL，然后加入8.8 mmol/L的過氧化氫溶液2 mL啟動反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1 h，于波長510 nm處測定吸光度，重復(fù)3次，計算其平均值。同時，測定抗壞血酸對·OH的清除作用。

式中：A0——空白對照吸光度；

A1——不同濃度的樣品溶液吸光度；

A2——不加雙氧水的樣品溶液本體吸光度。

1.2.3 對DPPH·的清除作用[17]

稱取DPPH·固體2 mg，加入無水乙醇溶解，50 mL容量瓶定容。取10 mL具塞試管11支，樣品組各管分別加DPPH·溶液2 mL，以及一定濃度的多糖溶液2 mL，混合均勻后置于暗處反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定吸光度，重復(fù)3次，計算其平均值。同時，測定抗壞血酸清除DPPH·的能力。

式中：A0——空白對照吸光度；

A1——不同濃度的樣品溶液吸光度；A2——樣品溶液本體吸光度。

1.2.4 對O-2·的清除作用[18]

采用鄰苯三酚自氧化法，于10 mL具塞試管中分別加入pH值8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，以及一定濃度的多糖溶液1 mL，混勻后于25℃下保溫10 min，加入預(yù)熱的25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，計

由圖1可知，當(dāng)酶解溫度在30～70℃變化時，隨著酶解溫度上升，糖胺聚糖提取率逐漸升高，但當(dāng)溫度達到60℃，提取率達最大值后，再繼續(xù)提高酶解溫度，糖胺聚糖提取率則出現(xiàn)下降。溫度過高，可以使酶變性甚至失活。所以，扇貝裙邊最適酶解反應(yīng)溫度為60℃。

2.1.2 pH值對復(fù)合酶酶解扇貝裙邊制備糖胺聚糖的影響

將酶解條件設(shè)定為復(fù)合酶添加量1.0%，料液比1∶3，pH值分別為5，6，7，8，9，于60℃條件下分別酶解3 h。

pH值對糖胺聚糖提取率的影響見圖2。

由圖2可知，隨著pH值的逐漸升高，糖胺聚糖提取率也隨之上升，當(dāng)pH值為8時，提取率達最大值，之后再升高pH值，糖胺聚糖提取率則出現(xiàn)下降趨勢。原因是復(fù)合酶中的胰蛋白酶與堿性蛋白酶本身的最適pH值為8～9，pH值過低或過高均會影響酶的活性。所以，扇貝裙邊最適酶解反應(yīng)pH值為8。時、搖勻，準確反應(yīng)3 min后，加入10 mol/L的HCl溶液0.1 mL，終止反應(yīng)，以雙蒸水為參比，于波長325 nm處測定吸光度，重復(fù)3次，計算其平均值。同時，測定抗壞血酸清除O-2·的能力。

式中：A0——空白對照吸光度；

A1——不同濃度的樣品溶液吸光度；

A2——水代替鄰苯三酚時不同樣品溶液本體吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶酶解蝦夷扇貝裙邊制備糖胺聚糖單因素條件的影響

2.1.1 酶解溫度對復(fù)合酶酶解扇貝裙邊制備糖胺聚糖的影響

將酶解條件設(shè)定為pH值7.5，料液比1∶3，復(fù)合酶添加量1.0%，于30，40，50，60，70℃條件下分別酶解3 h。

酶解溫度對糖胺聚糖提取率的影響見圖1。

圖1 酶解溫度對糖胺聚糖提取率的影響

圖2 pH值對糖胺聚糖提取率的影響

2.1.3 酶解時間對復(fù)合酶酶解扇貝裙邊制備糖胺聚糖的影響

將酶解條件設(shè)定為復(fù)合酶添加量1.0%，料液比1∶3，pH值8，于60℃條件下分別酶解1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h。

酶解時間對糖胺聚糖提取率的影響見圖3。

圖3 酶解時間對糖胺聚糖提取率的影響

由圖3可知，糖胺聚糖提取率隨著酶解時間的增加而升高，酶解2.5 h后提取率上升幅度平緩。綜合糖胺聚糖提取率和生產(chǎn)成本這2個方面因素，確定酶解時間2.5 h為最佳。

2.1.4 酶添加量對復(fù)合酶酶解扇貝裙邊制備糖胺聚糖的影響

將酶解條件設(shè)定為料液比1∶3，pH值8，于60℃條件酶解2.5 h。復(fù)合酶添加量分別為0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%。

復(fù)合酶添加量對糖胺聚糖提取率的影響見圖4。

圖4 復(fù)合酶添加量對糖胺聚糖提取率的影響

由圖4可知，隨著復(fù)合酶添加量的提高，糖胺聚糖提取率逐漸升高，當(dāng)復(fù)合酶添加量大于1.0%后其提取率上升幅度平緩。綜合糖胺聚糖提取率和生產(chǎn)成本這2個方面因素，確定復(fù)合酶添加量1.0%為最佳。

2.1.5 料液比對復(fù)合酶酶解扇貝裙邊制備糖胺聚糖的影響

將酶解條件設(shè)定為復(fù)合酶加量為1.0%（質(zhì)量比），pH值8，于60℃條件下酶解2.5 h。料液比分別為 1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5。

料液比對糖胺聚糖提取率的影響見圖5。

圖5 料液比對糖胺聚糖提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)料液比為1∶3時，糖胺聚糖的提取率達到最大。

2.2 正交試驗結(jié)果

單因素試驗雖然得出了各因素最佳條件，但并沒有考慮到各反應(yīng)條件之間的相互影響，不能簡單認為把各單因素試驗的最佳結(jié)果組合在一起就是整個提取反應(yīng)的最佳條件，因此需要在單因素試驗基礎(chǔ)上，以糖胺聚糖提取率為指標采用正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化。

以復(fù)合酶添加量、酶解時間、酶解溫度、料液比進行四因素三水平正交試驗，確定酶解的最佳工藝。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1，正交試驗的結(jié)果與分析見表2。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

表2 正交試驗的結(jié)果與分析

由極差分析（R值）可知，4個因素對扇貝裙邊糖胺聚糖提取率的影響依次為A＞B＞D＞C，優(yōu)化所得條件為A3B1C1D1，即提取時間3.0 h，復(fù)合酶添加量0.8%，溫度50℃，料液比1∶2，在此條件下扇貝裙邊糖胺聚糖（PYSG）提取率為1.27%。

2.3 扇貝裙邊糖胺聚糖體外抗氧化研究

2.3.1 對·OH的清除作用

·OH是活性氧的一種，是體內(nèi)產(chǎn)生的正常代謝產(chǎn)物，通常情況下，機體處于動態(tài)平衡中，一旦平衡被打破，·OH會對機體造成損害，引起疾病[19]。以VC為參照物，研究扇貝裙邊糖胺聚糖對·OH的清除作用。

VC和扇貝裙邊糖胺聚糖對·OH的清除作用見圖6。

圖6 VC和扇貝裙邊糖胺聚糖對·OH的清除作用

由圖6可知，VC對·OH具有很強的清除作用，明顯強于蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到0.5 mg/mL時，清除率接近100%，之后質(zhì)量濃度再增加，VC對·OH的清除作用基本不變。在所選的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖對·OH具有清除作用，并且隨著質(zhì)量濃度增加，清除作用增強，表明蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖對·OH的清除能力與質(zhì)量濃度有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)糖胺聚糖的質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，·OH的清除率達到最大值為91.84%。

2.3.2 對O-2·的清除作用

O-2·是生物體內(nèi)主要的氧自由基，是其他活性氧的前體，對生物體內(nèi)細胞、蛋白酶、不飽和脂肪酸、核酸等物質(zhì)均能產(chǎn)生影響。而且O-2·可作為自由基鏈式反應(yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強的自由基，對機體造成更大傷害[20]。

VC和扇貝裙邊糖胺聚糖對O-2·的清除作用見圖7。

由圖7可知，VC對O-2·具有很強的清除作用，明顯強于蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到1.0 mg/mL時，清除率達到90.05%，之后質(zhì)量濃度再增加，VC對O-2·的清除作用增加緩慢。蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖對O-2·的清除作用隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸增強，具有明顯的質(zhì)量濃度依賴性。在所選的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，當(dāng)糖胺聚糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，O-2·的清除率達到最大值76.06%。

圖7 VC和扇貝裙邊糖胺聚糖對O-2·的清除作用

2.3.3 對DPPH·的清除作用

對DPPH·的清除作用可用來衡量物質(zhì)的抗氧化能力，清除率越高，抗氧化能力越強。抗氧化物質(zhì)對DPPH·的清除程度與其所能接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，即與該物質(zhì)的供氫能力相關(guān)[21]。

VC和扇貝裙邊糖胺聚糖對DPPH·的清除作用見圖8。

圖8 VC和扇貝裙邊糖胺聚糖對DPPH·的清除作用

由圖8可知，VC對DPPH·具有很強的清除作用，明顯好于蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖，當(dāng)其質(zhì)量濃度達到0.5 mg/mL時，清除率達到96.14%，之后質(zhì)量濃度再增加，VC對DPPH·的清除作用增加緩慢。在所選的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對DPPH·的清除作用隨著蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，顯示出蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖對DPPH·的清除能力具有明顯的濃度依賴性。當(dāng)糖胺聚糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，DPPH·的清除率達到最大值94.38%。

3 結(jié)論

采用由堿性蛋白酶和胰蛋白酶組成的復(fù)合酶將蝦夷扇貝裙邊酶解，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖的提取工藝為提取時間3.0 h，復(fù)合酶添加量0.8%，提取溫度50℃，料液比1∶2，經(jīng)試驗驗證，糖胺聚糖提取率為1.27%。

蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖的體外抗氧化活性試驗表明，蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖具有較好的抗氧化活性，對·OH、O-2·、DPPH·的清除能力與質(zhì)量濃度有顯著的量效關(guān)系。蝦夷扇貝裙邊糖胺聚糖來源廣泛，無毒副作用，且具有較好的抗氧化活性，可以開發(fā)成天然高效的抗氧化劑。因此，試驗對于蝦夷扇貝的精深加工和綜合利用提供了依據(jù)。

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Extraction and in Vitro Antioxidant Activities of Glycosaminoglycan from Patinopecten yessoensis Skirt

LIU Yubo，LUAN Junxiao，TONG Changqing，LI Wei，*JIN Qiao
（Key and Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province，College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian，Liaoning 116023，China）

The extraction and in vitro antioxidant activities of glycosaminoglycan from scallop （Patinopecten yessoensis） skirt were studied in this article.The scallop skirt was hydrolyzed by compound protease.The results showed that optimal conditions of enzymolysis of scallop skirt were extraction time 3.0 h，0.8% （mass ratio） of compound protease，extraction temperature 50℃，solid to liquid ratio 1∶2，and the yield of glycosaminoglycan reached up to 1.27%.Glycosaminoglycan from scallop（Patinopecten yessoensis） skirt had a certain degree of antioxidant activities in vitro and exhibited a dose-dependent inhibitory effect on·OH，O-2·，and DPPH·.

Patinopecten yessoensis skirt；glycosaminoglycan；extraction；antioxidative activity

R285

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.003

1671-9646（2017） 11a-0010-05

2017-09-13

大連海洋大學(xué)科研項目（DHDY20150105）。

劉雨博（1995— ），女，碩士，研究方向為海洋生物資源開發(fā)利用。

*通訊作者：金橋（1977— ），男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為海洋生物資源利用。