京尼平交聯乳清蛋白和殼聚糖膜的制備

李 媛，呂 佳，徐雨春，薛海燕

（陜西科技大學，陜西西安 710021）

京尼平交聯乳清蛋白和殼聚糖膜的制備

李 媛，呂 佳，徐雨春，*薛海燕

（陜西科技大學，陜西西安 710021）

以乳清蛋白和殼聚糖為原料制備復合膜，同時利用天然無毒的京尼平作為交聯劑，研究其制備工藝。通過單因素試驗研究成膜材料比例、熱處理溫度、塑形劑、交聯劑對乳清蛋白和殼聚糖復合膜性能的影響，并對復合膜進行表征和抑菌性研究。結果表明，京尼平可以作為交聯劑用來制備乳清蛋白和殼聚糖復合膜，并且可以較好地改善復合膜的拉伸性能和阻隔性能，膜制備的最佳工藝條件是乳清蛋白（WPC） 與殼聚糖（CS） 配比為6∶4，甘油添加量4%，熱處理溫度70℃，京尼平添加量0.4%，此時復合膜的拉伸強度（TS） 1.79 MPa，斷裂伸長強度（E）30.28，透光率（T） 37%，水蒸氣透過率（WVP） 1.25，溶解性（S） 34%。在此條件下制得的復合膜具有良好的阻隔性能、抗拉強度、致密性和抑菌性能，可用于食品保鮮和抗菌內外包裝的使用。

乳清蛋白；殼聚糖；京尼平；交聯劑；抗菌性；表征

環境保護是21世紀人們普遍關注的熱點話題之一，采用生物可降解材料作為食品及其他產物的包裝是解決包裝材料的環境污染問題行之有效的方法。乳清蛋白是由干酪生產過程中所產生的副產品乳清，經過一定工藝濃縮精制而成的高蛋白質，占乳蛋白質的18%～20%，具有很高的營養價值、生產利用價值，也有許多優良的功能特性，最為突出的是成膜性。乳清蛋白能夠形成柔軟、透明、不溶于水、富有彈性的薄膜，并且具有良好的成膜特點。例如，乳清蛋白在低濕度下對于氧氣、油脂和芳香物質有良好的阻隔性。通過查閱大量文獻資料了解到，乳清蛋白可食用膜目前的應用面還很窄，主要是用于涂膜保鮮。細究其難以被大量應用在生產中的原因主要是乳清蛋白膜較脆、防潮阻濕性能較差、耐水性不好、抑菌防腐效果差、不具有保健功能等，難以適應食品包裝多功能性的要求。

殼聚糖是由幾丁質經過脫乙酰作用得到的一種物質。其作為生物保鮮劑，無味、無毒、無害，是一種良好的成膜材料。殼聚糖經化學、物理方法的修飾，可以做成可食用的保鮮膜。殼聚糖膜能夠降低蔬菜水果的呼吸作用，抑制微生物的生理生化變化，延長貨架期，可以看作一種天然食品抗菌劑。經過試驗研究證明，這類薄膜能夠阻隔食物與空氣接觸，在食品保鮮、抑菌防腐等方面都明顯優于傳統保鮮方法，現在已在一些蔬菜水果上進行了試驗和使用。

試驗將乳清蛋白和殼聚糖這2種成膜材料共混復合，以期克服單一組分可食用膜在實際應用中不可避免的問題，如阻隔能力不穩定、機械強度低等，并加入京尼平作為交聯劑來優化復合膜的最佳制備條件，從而獲得具有優良成膜性能和理化性質、高效抗菌性能的功能性復合膜。同時，對復合膜的結構進行表征，揭示乳清蛋白和殼聚糖組分的相容性和京尼平的交聯性及復合膜的微觀結構的變化規律，從而為京尼平對乳清蛋白和殼聚糖復合膜的實際應用提供參考。

交聯劑對于膜的性能非常重要，常用的化學交聯劑有戊二醛、三聚磷酸鈉和甲醛等。然而，這些常用的化學交聯劑都有一定的毒性[1]。京尼平是一種是從天然梔子苷經β-葡萄糖苷酶水解后的天然交聯劑，其本身具有優良的藥理價值，如保肝利膽、抗炎、抗菌、抗腫瘤、治療胃炎、治療糖尿病等。這種天然的交聯劑比常用的交聯劑（如戊二醛）的毒性小10 000倍[2]。試驗使用京尼平作為交聯劑來優化復合膜，考查乳清蛋白、殼聚糖二者復配比例，以及成膜影響因素（如增塑劑甘油比例、熱處理溫度、交聯劑比例）對成膜特性的影響。為今后乳清蛋白復合膜和京尼平的使用提供一定的理論和實踐基礎。

1 試驗方法

1.1 復合膜的制備方法

1.1.1 乳清蛋白溶液熱改性

稱取一定質量的乳清蛋白，使其充分溶解于蒸餾水中，放置于90℃水浴中改性25 min，在加熱過程中要用玻璃棒一直攪拌并保持攪拌方向不變，改性之后將乳清蛋白溶液置于45℃水浴中備用。

1.1.2 殼聚糖溶液的制備

將一定質量的殼聚糖溶解于2%的乙酸溶液中，于45℃條件下置于磁力攪拌，使殼聚糖充分溶解。

1.1.3 混合膜液的制備

將改性后的乳清蛋白溶液冷卻至室溫（23℃），在高速旋轉攪拌器上，緩慢將乳清蛋白液注入充分溶解的殼聚糖溶液中并繼續攪拌。待膜液充分混合后，緩慢加入增塑劑甘油。

1.1.4 調節pH值

用乙酸緩沖液調節pH值3.5～5.5。

1.1.5 真空脫氣

將膜液真空抽氣處理10 min，以消除氣泡。

1.1.6 鋪膜干燥

取15 mL膜液，涂膜于10 cm×10 cm大小相同的有機玻璃板上，噴涂京尼平溶液。于室溫下干燥24 h。

1.1.7 揭膜保存

干燥冷卻后揭膜，置于相對濕度50%的箱內平衡48 h備用。

1.2 復合膜基礎性能的測定

1.2.1 膜的厚度（FT）

采用接觸法測定可食膜的厚度，用螺旋測微器在膜表面四角各取1點，中央取1點，共5個點測定膜厚，取平均值，單位為（mm），膜厚用于計算膜的其他性能。

1.2.2 機械性能的測定（TS.E）

用電子拉伸試驗機測定其抗拉強度，每個樣品大小為2.54 cm×10 cm。確定其拉抗強度（TS） 和斷裂伸長率（E）。

1.2.3 透光率測定（T）

將復合膜液置于比色皿中，在400 nm波長處用紫外分光光度計測量，以乙酸作為對照。每批3個平行樣，每個樣重復進行3次。

1.2.4 溶解度（S） 的測定

參照ASTM（D664-94，1994），取膜樣，稱質量為m1，然后在105℃的條件下干燥至恒質量，稱其質量m2。根據干質量和濕質量之差計算含水量。

1.2.5 水蒸氣透過率的測定（WVP）

將復合膜裁剪成圓形放入水蒸氣透過率儀中[3]，用TSY-T1L透濕性測試儀測定水蒸氣透過系數，測定3組數據，取平均值。

1.3 復合膜的抑菌研究

培養基配制按照國標《食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑》；（GB/T 4789.28—2003）[4]，將牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉12 g，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解后，用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH值，使滅菌后pH值在7.2～7.4，分裝后置于壓力蒸汽滅菌器內，于0.1 MPa，121℃條件下高壓滅菌15 min。

采用紙片擴散法測定復合膜的抗大腸桿菌性能。用微量移液管將0.1 mL菌濃度為105CFU/mL的大腸桿菌菌懸液導入營養瓊脂培養基，用無菌三角棒涂布均勻，通風干燥15 min，將直徑約6 mm的無菌濾紙片置于平板培養基中央，分別滴入添加不同濃度殼聚糖的抗菌膜液，在37℃下培養24 h和48 h，觀察并測量抑菌直徑。每個樣品做3組平行試驗。以添加不含殼聚糖復合膜液為空白對照組[5]。

（1）菌種貯藏。大腸桿菌菌種和金黃色葡萄球菌接種于營養瓊脂培養基斜面上，在37±1℃培養箱內培養24 h后，置于4℃下貯藏，作為斜面貯藏菌。

（2）菌種活化。將斜面貯藏菌轉接到營養瓊脂培養基上，在37±1℃培養箱內培養24 h后再進行轉接，取連續轉接2次以上的新鮮細菌培養物備用。

（3）菌懸液制備。取5.0 mL稀釋液加入到活化后的菌種培養基中，輕輕振蕩，使菌種分散，吸取3.0 mL稀釋液加入營養瓊脂培養基斜面試管內，反復操作，再將洗液移至另一支無菌試管中，輕輕振蕩數次，得到均勻懸浮的大腸桿菌菌懸液待用。

2 結果分析

2.1 材料復配比例對復合膜機械強度的影響

成膜材料配比對復合膜拉伸強度的影響見圖1，成膜材料配比對復合膜斷裂伸長率的影響見圖2。

圖1 成膜材料配比對復合膜拉伸強度的影響

圖2 成膜材料配比對復合膜斷裂伸長率的影響

隨著WPC-CS膜中殼聚糖配比的逐漸增大，可食膜的抗拉強度（TS）呈現先增加后減小再增加的趨勢。斷裂伸長率（E）見圖2呈現先增大后減小的趨勢。當復合膜中殼聚糖含量較多時，殼聚糖中的羥基與乳清蛋白中的氨基和羧基形成穩定的化學鍵，使得復合膜拉伸強度較大，但隨著乳清蛋白含量逐漸增多，乳清蛋白分子間作用力增強，取代了乳清蛋白和殼聚糖之間的共價鍵及氫鍵，導致復合膜拉伸強度變小。WPC-CS膜的斷裂伸長率（E）隨著WPC和CS配比的增大而先增大后減小，這是因為WPC和CS分子間結合位點有限，當二者充分結合即比例為6∶4時，此時的拉伸強度為1.72 MPa，分子間連接最緊密。

2.2 材料復配比例對復合膜透光率的影響

復合膜透光率可以反映物質成分的相容性，若復合膜透光率很低，則說明其中的物質相容性差。

成膜材料配比對復合膜透光率的影響見圖3。

圖3 成膜材料配比對復合膜透光率的影響

由圖3可知，隨著成膜材料配比的增大，透光率（T）稍微減小，但是差異并不明顯，這是因為乳清蛋白與殼聚糖分子通過氫鍵結合時，連續相和分散相界面發生光反射和散射，導致透光率減小。

2.3 材料復配比例對復合膜阻隔性能的影響

成膜材料配比對復合膜水蒸氣透過率的影響見圖4。

圖4 成膜材料配比對復合膜水蒸氣透過率的影響

WPC-CS膜的水蒸氣透過系數（WVP） 隨著成膜材料配比的增大而先減小后增大。膜的WVP與成膜材料的極性基團密切相關，在CS濃度較高時，WPC-CS膜的WVP較小，隨著WPC∶CS的增大，WPC分子與CS分子以氫鍵等相互作用在有限的結合位點充分結合，使復合膜結構緊密，當達到6∶4時，WVP最小為1.21。隨著CS加入量的增大，使阻水性變弱，使復合膜的透水性增強。

2.4 增塑劑添加量的影響

試驗證明在未加入增塑劑時，可食用復合膜較脆、易斷裂，甚至不能完整地揭膜。在添加低濃度的增塑劑時，復合膜的性能都有很大提升。以甘油為增塑劑的可食用復合膜。隨著甘油濃度的增加，復合膜的拉伸強度（TS）顯著增加，在4%達到最大為1.72 MPa。

增塑劑對復合膜拉伸強度的影響見圖5，增塑劑對復合膜斷裂伸長率的影響見圖6。

復合膜斷裂伸長率（E）在不斷增加，這說明甘油的添加對復合膜的柔韌性有了較大提升。在甘油添加量為8%時復合膜的斷裂伸長率最大為41.13 MPa。可是在揭膜過程中，由于黏度過大而不易揭膜。為考慮揭膜成度和膜的拉伸效果，應選取4%的甘油添加量為最佳。

2.5 熱處理溫度對復合膜的影響

熱處理溫度對復合膜拉伸強度的影響見圖7，熱處理溫度對復合膜阻隔性能的影響見圖8。

圖5 增塑劑對復合膜拉伸強度的影響

圖6 增塑劑對復合膜斷裂伸長率的影響

圖7 熱處理溫度對復合膜拉伸強度的影響

圖8 熱處理溫度對復合膜阻隔性能的影響

由圖7可以看出，隨著熱處理溫度的升高，膜的整體拉伸強度（TS）先減小后增大。當熱處理溫度為70℃時，復合膜的拉伸強度達到最大，為30.14 MPa。

由圖8可以看出，復合膜的WVP隨著熱處理溫度的升高而下降，當溫度到60，70℃時WVP沒有顯著的改變，這是由于乳清蛋白和殼聚糖分子在適當的加熱溫度下能更好地交聯，提高其阻隔水蒸氣的性能。

2.6 交聯劑對膜改性的影響

京尼平對復合膜拉伸強度的影響見圖9。

圖9 京尼平對復合膜拉伸強度的影響

由圖9可以看出，以京尼平作為交聯劑，對復合膜的拉伸強度（TS）有所增強。可能是由于促進乳清蛋白和殼聚糖的交聯作用，使復合膜分子結構更加緊密，透光性和復合膜的光滑性有所增加。而對韌性影響不大，故伸長率變化不大。由于復合膜結構更加緊致，透水性有所減弱。

2.7 復合膜抑菌效力的測定

不同配比殼聚糖的抑菌效果見表1，添加京尼平的抑菌效果效果見表2。

表1 不同配比殼聚糖的抑菌效果

表2 添加京尼平的抑菌效果效果

由表1可以看出，乳清蛋白、殼聚糖復合凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。乳清蛋白和殼聚糖復合膜中對革蘭氏細菌有抑菌效力的主要成分是殼聚糖，隨著殼聚糖成分的增加，抑菌直徑變大，抑菌效果逐漸增大。證明此復合膜有一定的抑菌性，且對大腸桿菌的抑菌能力強于金黃色葡萄球菌。

由表2可以看出，添加京尼平對復合膜的抑菌效果影響不大，增加添加量后抑菌直徑沒有明顯變化。故復合膜抑菌效果的強弱主要依靠殼聚糖的配比。殼聚糖配比越大，復合膜的抑菌性越強。

3 結論

將乳清蛋白和殼聚糖作為原料制備復合膜，同時探究以京尼平作為交聯劑制備復合膜時的最優條件。利用抑菌試驗，檢驗復合膜對革蘭氏細菌的抑菌作用，生產出具有抑菌性的功能復合膜。最后對復合膜進行表征，更加形象地反映出復合膜的結構特征。

根據試驗數據分析，復合膜制備的最佳工藝條件為乳清蛋白與殼聚糖的配比6∶4，甘油添加量4%，熱處理溫度70℃，京尼平添加量0.4%。該復合膜可作為新型的生物材料，并對新型交聯劑的使用和發展提供了參考和理論依據。

[1]Welsh E R， Schauer C L， Qadri S B， et al.Chitosan cross-linking with a water-soluble，blocked diisocyanate.1.Solid state[J].Biomacromolecules，2002，3 （6）：1 370-1 374.

[2]Jin J，Song M，Hourston D J.Novel chitosan-based films cross-linkedby genipin with improved physical properties[J].Biomacromolecules，2004，5 （1）：162-168.

[3]賈艷菊，馬同鎖，劉坤，等.不同殼聚糖抗菌膜對草魚保鮮效果的比較 [J].中國農學通報，2010，26（5）：337-340.

[4]Atarés L，Bonilla J.Chiralt A.Characterization of sodium caseinate-based edible films incorporated with cinnamon or ginger essential oils[J].Journal of Food Engineering，2010 （18）：1-10.

[5]石磊，王世平，顧介明.不同濃度殼聚糖膜對葡萄保鮮效果的研究 [J].山東農業科學，2009（8）：99-101.◇

The Preparation of Whey Protein and Chitosan Composite Films Crosslinking by Genipin

LI Yuan，LV Jia，XU Yuchun，*XEU Haiyan
（Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an，Shaanxi 710021，China）

In this paper，whey protein and chitosan composite membrane preparation process were studied with taking advantage of natural non-toxic genipin as a crosslinking agent.The proportion of two film-forming materials，influence of thermal denaturation temperature，and shaping and crosslinking agent of whey protein/chitosan composite membrane performance were explored through the single factor experimental study.And we do bacteriostatic study of the composite film.The results showed that geniposidic whey protein could be used as a crosslinking agent and chitosan composite membrane preparation used.And could better improve the tensile properties and the barrier properties of films.The optimum conditions for preparation of the film was derived from whey protein ratio（WPC） ∶chitosan （CS） 6∶4，glycerol concentration 4%，heat treatment temperature 70℃，geniposidic concentration 0.4%，the tensile strength of the composite film（TS） was 1.79 MPa，elongation at break strength（E） was 30.28，the light transmittance（T） was 37%， the water vapor transmission rate（WVP） was 1.25 and solubility（S） 34%.Under these conditions，the resulting composite film had good barrier properties，tensile strength，density and antibacterial properties.It could be used for food preservation and antimicrobial outside packaging.

whey protein；chitosan；genipin；cross-linking agent；antibacterial；characterization

O636.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.002

1671-9646（2017） 11a-0006-04

2017-07-17

陜西省教育廳專項項目（16JK1101）；陜西科技大學大學生創新創業訓練計劃項目（008）。

李 媛（1996— ），女，在讀本科，研究方向為食品科學。

*通訊作者：薛海燕（1979— ），女，博士，副教授，研究方向為乳品質量安全與控制。