污泥中嗜酸酵母菌的分離鑒定及其重金屬耐受性研究*

邱秀文 周桂香，3 王天峰 單瑤瑤 楊期勇#

(1.九江學院鄱陽湖生態經濟研究中心，江西 九江 332005；2.九江市流域管理與生態保護重點實驗室(九江學院)，江西 九江 332005；3.土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，江蘇 南京 210008；4.九江學院化學與環境工程學院，江西 九江 332005)

污泥中嗜酸酵母菌的分離鑒定及其重金屬耐受性研究*

邱秀文1，2周桂香1，2，3王天峰4單瑤瑤4楊期勇1，2#

(1.九江學院鄱陽湖生態經濟研究中心，江西 九江 332005；2.九江市流域管理與生態保護重點實驗室(九江學院)，江西 九江 332005；3.土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，江蘇 南京 210008；4.九江學院化學與環境工程學院，江西 九江 332005)

從污水處理廠的活性污泥中分離純化出一株嗜酸異養菌，命名為JJU-2，并對其進行了形態觀察、生理生化特性測試及26S rDNA的D1/D2區序列分析，鑒定該菌株為假絲酵母菌(Candidapalmioleophila)。進一步對JJU-2菌株的生長特性和重金屬耐受性進行研究。結果表明：該菌株最適生長pH為3～6，且能適應pH<3的極端酸性環境，最適生長溫度為25 ℃，最高耐受溫度為40 ℃，當培養至3 h，JJU-2菌株進入對數生長期，培養至18 h進入穩定期。Cr3+、Ni2+、Pb2+對JJU-2菌株的最低抑菌摩爾濃度分別為20、2.0、40 mmol/L。

嗜酸性 序列分析 重金屬耐受性 假絲酵母菌

隨著我國經濟發展和城市化進程的加快，生活污水的排放量和處理比例也快速增加[1]。污泥是污水生物處理過程中產生的副產物，隨著污水處理力度的不斷加大，污泥產量也在快速增加[2]。污泥中含有豐富的有機質、氮、磷、鉀等，所以污泥農用成為污泥資源化利用的有效途徑之一[3]。污泥農用可提高土壤有機質含量，改善土壤物理性狀并提供植物需要的養分，但是城市污泥中高含量的重金屬是限制污泥農用的重要因素之一[4]。目前，脫除污泥中重金屬的方法有吸附法、化學法和生物淋濾法等[5]。其中，生物淋濾法因耗酸量小、成本低、重金屬去除率高、實用性強等優點而越來越受關注[6]。

生物淋濾法是指利用自然界中一些微生物的直接作用或其代謝產物的間接作用，產生氧化、還原、絡合、吸附或溶解作用，將固相中某些不溶性成分(如重金屬、硫等)浸出的一種技術[7]。目前，用于生物淋濾的微生物主要是化能自養微生物，該類微生物生長緩慢，重金屬去除效果差[8-9]。有研究表明，自養微生物的一些代謝產物對其自身的生長有抑制作用[10-11]。若在生物淋濾過程中加入以有機物為能源物質的嗜酸異養菌，就可在一定程度上解除這種抑制作用，有利于自養微生物的生長，充分發揮其去除污泥中重金屬的作用，提高去除率[12-13]。因此，篩選嗜酸異養菌對于提高自養微生物生物淋濾去除重金屬效率具有重要意義。從污水處理廠的活性污泥中分離得到一株嗜酸異養菌，命名為JJU-2，對該菌株進行形態學觀察和分子鑒定，同時對該菌株的生理生化特征、生長特性和重金屬耐受性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 培養基

基礎鹽溶液：(NH4)2SO42.5 g/L、KCl 0.1 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、Ca(NO3)20.2 g/L，用稀硫酸調pH至4，在121 ℃滅菌15 min。

BSYG液體培養基：1 L基礎鹽溶液中配入1 g/L葡萄糖、1 g/L酵母膏。

BSYG固體培養基：BSYG液體培養基加1%(質量分數)瓊脂。

1.2 菌株的富集與分離

JJU-2菌株的富集培養采用BSYG液體培養基。JJU-2菌株的純化采用平板涂布分離法，pH用稀硫酸調至4。將涂布的平板置于30 ℃的培養箱中倒置培養2～3 d，即可長出單菌落。然后，選擇具有代表性的單菌落在顯微鏡下觀察，重復數次，直至獲得目的菌株的純培養。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態及生理生化鑒定

將富集純化的JJU-2菌株經平板涂布置于25 ℃培養箱培養48 h，觀察單菌落形態，并于顯微鏡下觀察菌體形態。參照文獻[14]對JJU-2菌株做進一步鑒定。

1.3.2 菌株基因組DNA的提取

離心收集5 mL JJU-2菌體，用pH=8的TE緩沖液洗滌3次，棄上清液，沉淀備用。采用Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒(SK8257)提取JJU-2菌株的基因組DNA。

1.3.3 26S rDNA的D1/D2區的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增

26S rDNA的D1/D2區的PCR擴增采用引物為：正向引物NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAAAAG-3’)和反向引物NL4(5’-GGT CCG TGTTTC AAG ACG G-3’)。PCR反應體系(50 μL)：模板1 μL，10×Buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 2 μL，高保真(Taq) DNA聚合酶0.4 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，加去離子水至50 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，32個循環后72 ℃ 10 min。取5 μL產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結果。

1.3.4 PCR擴增產物的純化與測序

PCR擴增產物采用凝膠回收試劑盒(SK8131)純化。純化產物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作。

1.3.5 序列分析和系統發育樹的構建

根據供試菌株的26S rDNA的D1/D2區序列，運用BLAST程序在GenBank數據庫中分別進行同源序列搜索。下載相關菌種的序列，用MEGA 4軟件進行系統發育樹的構建。

1.4 菌株生理生化特征分析

1.4.1 碳源發酵測定

利用14種有機物進行發酵測試，25 ℃培養3 d。

1.4.2 最適初始pH的測定

各取99 mL BSYG液體培養基裝于6個250 mL三角瓶中，將pH分別調節為1～6，121 ℃下滅菌15 min。然后，接種處于對數生長期的1 mL菌液至培養基中，置于25 ℃、180 r/min下振蕩培養。培養至3 h后，每隔2 h測定600 nm處的吸光度(OD600)。試驗重復3次。

1.4.3 最適生長溫度的測定

各取99 mL BSYG液體培養基裝于6個250 mL三角瓶中，將pH調節為5，121 ℃下滅菌15 min，接種處于對數生長期的1 mL菌液至培養基中，分別置于不同溫度(20～45 ℃)下，180 r/min振蕩培養。培養至3 h后，每隔2 h測定OD600。試驗重復3次。

1.5 菌株對重金屬的耐受能力測定

將培養至對數期的JJU-2菌株涂布于設置了不同濃度重金屬(Cr3+、Ni2+、Pb2+，分別以硫酸鉻、硫酸鎳、硝酸鉛配制)的BSYG固體培養基中，置于25 ℃的培養箱中倒置培養2～3 d，觀察JJU-2菌株的生長情況。

2 結果與討論

2.1 菌株的形態和碳源發酵測定

如圖1所示，JJU-2菌株在BSYG固體培養基上形成白色菌落，菌落表面呈圓形凸起，表面濕潤光滑且有光澤，不透明，質地黏稠，邊緣齊整；JJU-2菌株細胞呈圓形或卵圓形，出芽增殖。

如表1所示，該菌株可利用大部分有機物進行繁殖，但不利用尿素、L-半胱氨酸、甘油、乙酸、草酸銨。根據文獻[15]，初步判斷JJU-2菌株為酵母菌。

圖1 JJU-2菌株的形態學特征Fig.1 The morphological characteristics of the strain JJU-2

2.2 26S rDNA的D1/D2區序列的系統發育樹分析

表1 JJU-2菌株的碳源發酵測定1)

注：1)“+”表示可利用；“-”表示不可利用。

依據形態及生理特征難以對酵母菌進行準確鑒定，而分子鑒定技術是一種更有效且準確的鑒定手段。目前，一般認為酵母菌同一個種的不同菌株其26S rDNA的Dl/D2區堿基差異不超過1%，因此大多數種都可通過該序列分析進行區別。KURTZMAN等[16]通過26S rDNA的D1/D2區序列分析對500余種酵母菌進行了鑒定，確定了大部分菌種的系統發育地位。謝婕等[17]利用26S rDNA的D1/D2區序列分析，對采自西藏羊八井地區傳統發酵牦牛酸乳中的酵母菌進行分子生物學鑒定，結果表明，該方法可有效鑒定不同的酵母菌種。褚學英等[18]借助分子技術對7株酵母菌進行鑒定，通過同源性比較和系統發育樹分析發現，其中6株菌與GenBank數據庫中已知酵母有較高的相似性和親緣關系，另外1株菌確定為新種。本實驗對JJU-2菌株進行了26S rDNA的D1/D2區分子鑒定，結果見圖2。JJU-2菌株的26S rDNA的D1/D2區序列與假絲酵母菌(Candidapalmioleophila)17323(KJ705005.1)序列處于同一分支，其相似度最高。因此，結合其形態、生理生化特征和分子鑒定技術，鑒定JJU-2菌株屬假絲酵母菌。

2.3 JJU-2菌株的生長曲線

由圖3可見，JJU-2菌株在1～3 h為延滯期。3～12 h為對數生長期，該時期由于營養充足，環境條件適宜，菌體生長速率大，胞內酶系活躍、代謝旺盛，JJU-2菌株數量呈指數增長。12～18 h，JJU-2菌株數量上升變緩，增殖率降低，開始向穩定期過渡。JJU-2菌株接種18 h數量達到最大值，此后數量無明顯變化，說明JJU-2菌株進入穩定期，該時期JJU-2菌株數量沒有凈增長或凈減小，保持在相對平衡狀態。

圖2 JJU-2菌株的系統發育樹分析Fig.2 The phylogenetic tree of the strain JJU-2

圖3 JJU-2菌株的生長曲線Fig.3 The growth curve of the strain JJU-2

2.4 pH對JJU-2菌株的生長活性影響

從圖4可以看出，JJU-2菌株在不同的pH情況下生長存在差異，最適生長pH為3～6，當pH=2時生長仍良好，當pH=1時仍能生存。這表明，JJU-2菌株能適應極端的酸性環境。當pH從5增至6時，JJU-2菌株的OD600反而下降。當pH>6或pH<1時，菌株細胞酶活力受到抑制，不利于菌株的生長[19]。酵母菌在自然界中分布廣泛，在陸地、城市污泥和水環境中均有發現[20-25]。酵母菌主要生長在偏酸性環境中，可利用各種底物進行生長。到目前為止，關于酵母菌在極端酸性環境(pH<3)的研究鮮見報道。JJU-2菌株的分離為嗜酸異養菌協助去除污泥中的重金屬提供了良好的材料。

圖4 pH對JJU-2菌株的生長活性影響Fig.4 The effect of pH on the growth activity of the strain JJU-2

2.5 溫度對JJU-2菌株的生長活性影響

如圖5所示，當溫度≥35 ℃時，JJU-2菌株生長緩慢，最高耐受溫度為40 ℃，45 ℃時JJU-2菌株基本停止生長。20～30 ℃時，JJU-2菌株均生長良好，25 ℃時OD600達到最大。所以，JJU-2菌株的最適生長溫度為25 ℃，說明JJU-2菌株為中溫型微生物。

圖5 溫度對JJU-2菌株的生長活性影響Fig.5 The effect of temperature on the growth activity of the strain JJU-2

樊潔[26]研究了不同溫度對酵母菌株A05生長活性的影響，結果表明，菌株A05在20～25 ℃時生長緩慢，在30～35 ℃時生長良好。杭姣等[27]從新疆羅布泊地區取得一株淺白隱球酵母菌，研究發現，該菌在39 ℃的高溫中也能正常生長，表明淺白隱球酵母菌是耐高溫型菌。該菌與JJU-2菌株有很大差異。劉瀅等[28]研究了溫度對增香酵母菌株C6生長活性的影響，發現菌株C6的最適生長溫度為28 ℃，在24～32 ℃內均良好生長。該菌株最適溫度與JJU-2菌株最適溫度基本接近。

2.6 JJU-2菌株對重金屬離子的耐受性研究

不同金屬離子抑制菌株生長的最低濃度叫做最低抑菌濃度(MIC，以摩爾濃度計)。通常MIC與菌體的重金屬耐受性成正比。從圖6可以看出，Cr3+、Ni2+、Pb2+對JJU-2菌株的MIC分別為20、2.0、40 mmol/L。因此，JJU-2菌株對3種重金屬離子的耐受能力由強到弱依次為Pb2+(40 mmol/L)>Cr3+(20 mmol/L)>Ni2+(2.0 mmol/L)。

麗麗[29]研究了Pb2+對酵母菌株WT6-5生長的影響，結果表明，較低濃度Pb2+可刺激酵母菌株WT6-5的生長，高濃度Pb2+則會抑制菌株WT6-5的生長。這與本研究分離到的菌株對Pb2+的抗性一致。王世梅等[30]從固體廢物中分離得到酵母菌株R30，研究發現，不同濃度Cr3+對酵母菌株R30的生長有影響，當Cr3+>10 mmol/L時明顯抑制酵母菌株R30的生長。這與JJU-2菌株對Cr3+的耐受能力接近。

圖6 JJU-2菌株對不同摩爾濃度重金屬離子的耐受性Fig.6 The tolerance of JJU-2 strain to different heavy metals of different molar concentrations

3 結 論

(1) 從污水處理廠的活性污泥中分離得到JJU-2菌株。通過對JJU-2菌株進行形態學鑒定、生理生化特征測試及26S rDNA的D1/D2區序列分析，確定該菌株為假絲酵母菌。

(2) JJU-2菌株最適生長pH為3～6，當pH=2時生長良好，當pH=1時仍能生存，說明JJU-2菌株能適應極端的酸性環境；最適生長溫度為25 ℃，最高耐受溫度為40 ℃；JJU-2菌株培養至3 h進入對數生長期，培養至18 h進入穩定期。

(3) JJU-2菌株對Cr3+、Ni2+、Pb2+均有不同程度的耐受性，MIC分別為20、2.0、40 mmol/L。

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Isolationandidentificationofanacidophilusyeastfromsewagesludgeanditstolerancetoheavymetal

QIUXiuwen1，2，ZHOUGuixiang1，2，3，WANGTianfeng4，SHANYaoyao4，YANGQiyong1，2.

(1.PoyangLakeEco-economyResearchCenter，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005；2.JiujiangKeyLaboratoryofBasinManagementandEcologicalProtection，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005；3.StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture，InstituteofSoilScience，ChineseAcademyofSciences，NanjingJiangsu210008；4.CollegeofChemistryandEnvironmentalEngineering，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005)

A heterotrophic acidophilic strain，named JJU-2，was isolated from sewage sludge of a sewage treatment plant. JJU-2 was identified asCandidapalmioleophilaby morphology，chemical and physical characteristics and 26S rDNA D1/D2 gene sequence analysis. The experiment of grow characteristics and tolerance to heavy metal was carried out. The results showed that：the optimum pH was 3-6 and it tolerated extreme acid environment (pH<3). The optimum temperature and the highest temperature were 25 ℃ and 40 ℃，respectively. The strain JJU-2 grew to logarithmic phase after 3 hours of inoculation and grew to stable phase after 18 hours. The maximum tolerance concentrations of Cr3+，Ni2+and Pb2+were 20，2.0 and 40 mmol/L，respectively.

acidophily; sequence analysis; tolerance to heavy metal;Candidapalmioleophila

邱秀文，男，1984年生，博士，講師，研究方向為環境微生物。#

。

*國家自然科學基金資助項目(No.21367014)；江西省自然科學基金資助項目(No.20151BAB203026)；江西省科技廳對外科技合作計劃項目(No.20132BDH80008)；江西省教育廳科技項目(No.GJJ14732)；長江水環境教育部重點實驗室開放課題(No.YRWEF201502)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.11.001

2016-10-04)