藜麥皂苷提取及萌芽對皂苷含量的影響

黃 金 秦禮康 石慶楠 文安燕

(貴州大學釀酒與食品工程學院，貴陽 550025)

藜麥皂苷提取及萌芽對皂苷含量的影響

黃 金 秦禮康 石慶楠 文安燕

(貴州大學釀酒與食品工程學院，貴陽 550025)

利用響應面分析法對藜麥籽粒皂苷的提取條件進行探索，并研究萌芽對藜麥皂苷含量的影響。在單因素試驗的基礎上，選取乙醇提取分數、料液比和浸提溫度進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計，通過響應面分析法對提取條件進行了優化；同時在優化條件下測定萌芽144 h藜麥中的皂苷含量變化。結果表明，在560 nm波長下，最佳提取條件為乙醇體積分數65%，料液比1:40，浸提溫度60 ℃，皂苷提取量為5.56 mg/g。萌芽試驗結果表明，萌芽初期(6 h內)皂苷含量迅速下降，在6～42 h期間含量保持平穩，42 h后逐漸升高直至96 h時達最高值7.80 mg/g，萌芽120 h后皂苷含量開始下降。

藜麥 萌芽 皂苷 響應面分析

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)不僅富含優質蛋白質，而且含有鈣、鐵、鋅和維生素E等微量營養素，具有提高人群健康，預防癌癥、過敏、炎癥以及降低心血管疾病等疾病發生的潛在功效[1-2]。古代印加人稱其為“糧食之母”和“安第斯山的真金”[3-4]。國際營養學家稱其為“營養黃金”、“超級谷物”或“未來食品”[5]。FAO將藜麥評為“高營養價值的食物”[6]。聯合國糧農組織(FAO)認為藜麥是唯一一種可滿足人體基本營養需求的單體植物,并正式推薦藜麥為最適宜人類的全營養食品，將2013年設立為“國際藜麥年”[7]。

藜麥具有豐富的營養價值，但藜麥中存在的抗營養因子-皂苷，略有苦澀味且具有潛在毒性[8]，阻礙了藜麥在食用、加工和推廣等方面的運用。藜麥皂苷主要以三萜皂苷的形式存在，質量分數在0.14%～2.30%[9]，隨著對皂苷的進一步了解，人們更加關注皂苷的生物活性及其對健康的作用。具已有研究表明，皂苷是一類具有抗炎[10]、抗過敏[11]、抗氧化[12]、抗糖尿病[13]、降膽固醇[14]等生物活性的物質，是許多中藥的有效成分。藜麥皂苷的去除、提取及再利用一直是困擾研究者的難題。傳統的流動水沖洗方法會造成大量的水資源浪費，同時也損失了皂苷的藥用價值。種皮打磨30%[15]，浸泡水洗[16]亦可有效降低種皮皂苷含量。種子萌發是高等植物生命活動最強烈的一個時期，涉及一系列形態和生理、生化的變化。通過發芽處理谷物可以改善它們的口感，提高營養成分的含量和利用率，以及降低抗營養成分的含量[17～18]。澳大利亞學者在處理藜麥皂苷時發現，長時間的浸泡會導致藜麥發芽[19]。Ren S等[20]人發現苦蕎種子萌芽處理期間總酚、總黃酮、蘆丁含量逐漸增加，并在第9天到最大值。這些現象在開發芽類食品方面受到了人們密切關注[21]。

目前，藜麥商品糧皂苷含量標準及其檢測方法尚不統一，提取工藝及條件各不相同。趙文婷[22]在乙醇濃度72%、提取溫度71.5 ℃、料液比1:20.8、提取時間147 min、吸收波長546 nm條件下測得藜麥麩皮的平均皂苷得率為1.685%。任卓偉等[16]在乙醇體積分數70%、料液比1:30、提取溫度50 ℃、吸收波長560 nm條件下測得藜麥的皂苷含量為10.709 mg/g。杜靜婷等[23]在料液比39:1、乙醇體積分數74%、超聲時間33 min、吸收波長550 nm條件下測得藜麥糠皂苷得率為23.371 mg/g。

本研究在目前通用的藜麥皂苷提取方法的基礎上，運用響應面法探索適宜的提取條件，對萌芽144 h內的藜麥皂苷含量的變化進行動態監測，旨在為藜麥皂苷的綜合利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

齊墩果酸標準品:Sigma;藜麥:甘肅省農業科學院。

1.2 儀器與設備

Spectra Max 190酶標儀:Molecular Devices；MK-C315豆芽培育箱:MEIKONG；HYG-A全溫搖瓶機:大倉市實驗設備廠；FD-1A-50冷凍干燥機:北京博醫康實驗儀器有限公司；HC-700型超高速粉碎機:永康市天祺盛世工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的制備

參考任卓偉等[16]、趙文婷[22]的方法，選用齊墩果酸為標準品。準確稱取齊墩果酸標準品50 mg，加少量無水乙醇溶解后定容于50 mL的容量瓶中，制成1 mg/mL標準溶液。

1.3.2 標準曲線的繪制[16]

用移液槍準確地吸取0、50、100、200、400 μL的標準溶液，分別置于干燥的蒸發皿中，60 ℃水浴蒸干取出；依次加入0.8 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液和3.2 mL高氯酸，搖勻；用冰水浴冷卻20 min，加入20 mL冰醋酸，搖勻，靜置15 min。取400 μL的標準品用酶標儀于500～600 nm處進行掃描，選定最大吸收波長。以最大吸收波長處各濃度標準品的吸光度值(Abs)為橫坐標，以相應齊墩果酸標準品濃度(mg/mL)為縱坐標，繪制標準曲線。皂苷提取量根據標準曲線按公式計算:

皂苷提取量/mg/g=CV/m

式中：C為根據標準曲線求得的皂苷質量濃度/mg/mL；V為提取液總體積/mL；m為藜麥總質量/g；

1.3.3 響應面試驗設計

1.3.3.1 單因素試驗

每次試驗準確稱取5 g過60目篩的粉碎藜麥粉(未萌芽)，分別以乙醇體積分數、料液比、提取溫度3個因素進行單因素試驗，以皂苷含量為衡量指標，具體方案見表1。

表1 藜麥皂苷提取單因素試驗表

1.3.3.2 提取工藝的優化

根據單因素試驗結果，結合Box-Behnken中心組合試驗設計原理，確定了以乙醇體積分數、料液比、提取溫度3個因素為自變量，皂苷提取量為響應值，采用三因素三水平的響應面分析設計試驗，對高氯酸比色法測定藜麥皂苷條件進行優化，見表2。

表2 響應面分析因素與水平

1.3.3.3 萌芽藜麥的制備

粗藜麥(未脫殼)過篩，除雜后選取飽滿完好的藜麥粒，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡20 min后用去離子水沖洗2～3次[24]。然后將藜麥米平鋪于鋪有四層紗布的培芽箱上，噴曬去離子水，放入恒溫培芽箱于25 ℃、間隔6 h淋水、間隔6 h臭氧殺菌條件下發芽。每隔6 h取樣1次，分別制得發芽6、12、18、24、30、36、42、48，60、72、96、120、144 h的發芽藜麥。然后將收集的發芽藜麥于冰箱預凍待收集齊全后冷凍干燥，粉碎，過100目篩，得到發芽藜麥粉。

2 結果與分析

2.1 齊墩果酸標準曲線

由圖1可知，齊墩果酸標準品在500～600 nm處的最大吸收波長為560 nm，此結果與任卓偉等[16]的研究結果一致。因此，選用560 nm為檢測波長。

圖1 齊墩果酸標準品不同波長的吸光度值

以吸光度值為橫坐標(x)，以齊墩果酸濃度/mg/mL為縱坐標(y)繪制標準曲線如圖2，并采用線性擬合求得標準方程為y=2.863 1x+0.011 2；相關系數：R2=0.997 4，顯示在此范圍內有良好的線性關系(圖2)。

圖2 齊墩果酸標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對提取藜麥總皂苷的影響

大多數皂苷極性較大，多具有吸濕性，易溶于水、熱甲醇和乙醇，難溶于丙酮和乙醚。結合實驗室條件及安全性，故選擇乙醇為溶劑。從圖3可以看出，藜麥籽粒皂苷含量在一定范圍內隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數為70%時，提取出的皂苷含量最大，為5.35 mg/g。之后隨體積分數的增大含量反而減少，可能是因為當乙醇體積較大時，抑制了溶劑向物料的滲透，影響了皂苷的浸出，導致藜麥籽粒皂苷不能很好的提取出來[13]。因此選擇70%的乙醇為藜麥籽粒總皂苷的最佳提取條件。

圖3 單因素試驗結果

2.2.2 料液比對提取藜麥總皂苷的影響

由圖3可知，當料液比為1:30時，提取的皂苷含量最大，為5.14 mg/g。當料液比合適時，提取皂苷的效果才是最佳。太低時，提取不充分；太高，雖能完全提取，但提取液浪費較多。因此，由單因素試驗結果顯示，藜麥皂苷提取的最佳料液比為1:30。

2.2.3 提取溫度對提取藜麥總皂苷的影響

從圖3可以看出，溫度從20 ℃升高到50 ℃，提取出的皂苷含量先緩慢降低再勻速升高。50～60 ℃時的皂苷提取含量相差不大。可能是因為溫度升高加速了溶質的擴散及溶劑的滲透，從而使得提取含量的升高；而溫度過高時也加快了雜質的溶出，從而與黎麥皂苷的溶出產生了競爭，影響了皂苷的溶出效果[22]。基于實驗室條件限制及實驗安全性，故選用50 ℃為最佳提取溫度。

2.3 響應面試驗設計及結果

2.3.1 響應面提取藜麥皂苷模型及顯著性檢驗

應用Box-Behnken模型的中心組合試驗設計原理，根據單因素試驗結果進行三因素三水平的試驗設計，其中自變量為乙醇體積分數70%；料液比為1:30；提取溫度為50 ℃，以總皂苷含量為響應值，進行響應面分析，試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果

在17個試驗中，有12組析因試驗，12個析因點為自變量在A、B、C所構成的三維定點。以及5組中心零點試驗，用于估計試驗誤差。對表中的試驗結果進行多次擬合回歸分析，得到模型的二次多項回歸方程為：

Y=5.28-0.12A+0.31B+0.22C-0.13AB-0.37AC+0.055BC-0.43A2-0.26B2-0.29C2

其中對該模型進行方差分析，結果見表4。

表4 響應面試驗結果的方差分析

由表4可看出，本試驗選用模型P<0.000 1，表明模型達到極顯著；失擬項P=0.546 7>0.05，表明失擬不顯著；相關系數R2=0.993；信噪比=26.957，遠大于4，這說明該回歸方程的擬合度和可信度均很高。因此，此模型可用于預測高氯酸法測藜麥皂苷及工藝優化。由方差分析表中對回歸方程系數顯著檢測可知，藜麥皂苷提取的乙醇體積分數、料液比、提取溫度的一次項、二次項，乙醇體積和料液比、乙醇體積和溫度的交互作用均達到極顯著水平(P<0.01)，料液比和提取溫度的交互作用不顯著。由回歸方程分析可知，影響藜麥皂苷提取的因素主次順序為：料液比(B)>提取溫度(C)>乙醇體積分數(A)。

2.3.2 響應面分析及最佳條件確定

在方差分析的基礎上，利用Design Expert繪制交互項乙醇體積分數，料液比，提取溫度交互作用的曲面圖和等高線圖，如圖4、圖5和圖6所示。

由于等高線的形狀可以反映交互項的強弱，等高線圖呈橢圓形表示兩者交互作用顯著，圓形則與之相反。由圖6的響應面等高線圖可以看出，圖6呈現出的形狀沒有其他圖的明顯。結合方差分析表的數據，因素間的交互作用對提取率的影響效果為：AC>AB>BC通過Design Expert軟件對非線性回歸模型進行求解，得出最優的因素水平分別為：乙醇體積分數63.74%，料液比1:38.33 g/mL，提取溫度58.52 ℃，在此條件下皂苷含量預測值為5.54 mg/g。由于操作可行性，將最佳條件修正為：乙醇體積分數65%，料液比1:40 g/mL，提取溫度60 ℃。在此條件下進行3次平行驗證試驗，測得藜麥皂苷含量均值為5.56 mg/g，結果與預測值相近。

圖4 Y=f(A,B)響應面與等高線圖

圖5 Y=f(A,C)響應面與等高線圖

圖6 Y=f(B,C)響應面與等高線圖

2.4 萌芽藜麥皂苷含量測定

經過單因素試驗及響應面優化試驗，得到修正的藜麥皂苷最佳制備條件為：乙醇體積分數65%，料液比1:40 g/mL，提取溫度60 ℃。在此條件下測得萌芽藜麥皂苷含量，結果如表5和圖7。

表5 萌芽藜麥皂苷含量

圖7 萌芽藜麥皂苷含量

從圖7可看出，萌芽6 h內的藜麥皂苷含量極速下降。藜麥籽粒皂苷80%集中于種皮[7]，且藜麥屬于易發芽的種子[25]。在萌芽初期，種皮吸水膨脹掉落，皂苷隨淋水而流走，從而導致皂苷含量的驟降。之后在6～42 h之間，皂苷含量變化不大，保持3.5 mg/g上下小幅度浮動。從42 h開始，皂苷含量逐漸升高，48～72 h期間萌芽藜麥皂苷含量增長速度高于72～96 h。王莘等[26]對萌芽期綠豆功能性營養成分的研究發現，萌芽39 h后，異黃酮和皂苷含量出現最大值，分別增加54.8%和138%。萌芽96 h后，藜麥皂苷含量出現緩慢下降趨勢。萌芽后期，皂苷含量增加的原因及機理，目前還沒有相關報道。據PawelPasko等[27]對萌芽藜麥抗氧化性的研究表明，萌芽藜麥抗氧化活性的明顯增高是因為萌芽過程使多酚、花青素及其他未知成分含量的增加。L.Alvarea-J等[28]認為萌芽過程中某些內源性水解酶的產生及其活性的增加導致萌芽期間抗氧化活性增加。

3 結論

本試驗采用響應面法對藜麥籽粒中皂苷的提取條件進行探索，得出最佳調提取條件為:乙醇體積分數65%，料液比1:40 g/mL，提取溫度60 ℃。影響藜麥皂苷提取的因素主次順序為：料液比(B)>提取溫度(C)>乙醇體積分數(A)。在此條件下，觀察萌芽144 h的藜麥皂苷含量的變化，發現萌芽初期(6 h內)皂苷含量較未萌芽狀態下降了約40%，6～42 h保持約3.5 mg/g，42 h后開始增加直至96 h時達最高值0.78 mg/g。萌芽后期(120 h后)皂苷含量緩慢減少。至于皂苷含量增加的原因及機理、萌芽藜麥抗氧化活性的增高是否與皂苷含量的增加有關待進一步的研究。

[1]DiniI,Tenore G C,Dini A.Antioxidantcompound contents and antioxidant activities before and after cooking in sweet and bitter Chenopodium quinoa seeds[J].Food Science and Technology,2010,43:447-451

[2]Han X,Shen T,Lou H.Dietary polyphenols and their biological significance[J].International Journal of Molecular Sciences,2007,8:950-988

[3]Jacobsen S E.The worldwide potential for quinoa(Chenopodium quinoa Wild.)potential[J].Food Reviews International,2003,19:167-177

[4]Atul B,Sudhir S,Deepak O.Chenopodium quinoa-An International perspective[J].Industrial Crops and Products,2006,23:73-87

[5]Stikic R,Glamoclija D,Demin M,et al.Agronomical and nutritional evaluation of quinoa seed(Chenopodium quinoa Wild)as an ingredient in bread formulations[J].Journal of Cereal Science,2012,55:132-138

[6]FAO.Quinoa:An ancient crop to contribute to world food security[EB/OL].Santiago,FAO Regional Office for Latin American and the Caribbean[2011]http://www.fao.org/alc/file/media/pubs/2011/cultivo_quinoa_en.pdf

[7]FAO.Home-international year of quinoa 2013[EB/OL][2014-2-21].http://www.fao.org/quinoa-2013/en/

[8]Estrada A,Li B,LaarryeldB.Adjuvant action of Chenopodium. quinoa saponins on the induction of antibody responses to intragastric and intranasal administered antigens in mice[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,1998,21(3):225-236

[9]Ozlem G,Gluseppe M.Saponins:properties,applications and processing[J].Food Science and Nutrition,2007,47:231-258

[10]Ma W W,Heinstein P,Mclaughlin J,et al.Additional toxic,bittersaponins from the seeds of Chenopodium quinoa[J].Journal of Natural Products,1989,52(5):1132-1135

[11]Abdou A M,Abdallah H M,Mohamed MA,et al.A new anti-inflammatory triterpenesaponin isolated from Anabasis setifera[J].Archives of Pharmacal Research,2013:1-8

[12]María E,Carmen R R,Sebastián S J,et al.Surfactant and antioxidant properties of an extract from Chenopodium quinoa Willd seed coat[J].Journal of Cereal Science,2011,53:239-243

[13]Brittany L G,Alexander P,Peter K,et al.Quinoa seeds leach phytoecdysteroids and other compounds with anti-diabetic properties[J].Food Chemistry,2014,163:178-185

[14]Meyer B N,Heinstein P F,Burnouf R M,et al.Bioactivity-directed isolation and characterization of quinoside A:one of the toxic/bitter principles of quinoa seeds(Chenopodium quinoa Willd.)[J].Agriculture Food Chemistry,1990,38:205-208

[15]Ana M G C,GinvannaI,Vito V,et al.Influence of pearling process on phenolic and saponin content in quinoa(Chenopodium quinoa Wild)[J].Food Chemistry,2014(157):174-17

[16]任卓偉,倪文杰,劉森.藜麥皂苷的測定研究[J].山西農業科學，2015,43(8):932-935

Ren Z W,Ni W J,Liu S.Determination of quinoa saponins[J].Journal of Shanxi Agriculture Science,2015,43(8):932-935

[17]Rimsten L,Haradsson A K,Andesson R,et al.Effects of malting on ?-glucanase and phytase activity in barley grain[J].Journal of the Science and Food Agriculture,2002,82(8):904-912

[18]Yang T K,Basu B O,Oraikul F.Studies on germination conditions and antioxidant contents of wheat grain[J].International Journal of Science and Nutrition,2001,52(4):319-330

[19]Kuljanabhagavad T,Thongphasuk P,Chamulitrat W,et al.Triterpenesaponins from chenopodium quinoa wild[J].Phytochemistry,2008,69(9):1919-1926

[20]Ren S,Sun J.Changes in phenolic content,phenylalanine ammonia-lyase(PAL)activity and antioxidant capacity of two buckwheat sprouts in relation to germination[J].Journal of Functional Foods,2014,7:298-304

[21]Chavan J K,Kadam S S,Beuchat L R.Nutritional improvement of cereals by sprouting[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1989,28(5):401-437

[22]趙文婷.藜麥麩皮總皂苷的提取純化及其抗氧化和免疫增強作用[D].山西：山西農業大學,2015

Zhao W T.The extraction,purification,antioxidant and immunoenhancement in chenopodium quinoa wild bran total saponins[D].Shanxi:Shanxi Agriculture University,2015

[23]杜靜婷,陳超,范三紅.響應面法優化藜麥糠皂苷的提取及抗氧化活性[J].山西農業科學,2016,44(7):932-937

Du J T,Chen C,Fan S H.Optimization of extraction conditions for saponins from Chenopodium quinoa bran by Response Surface and its antioxidant activities[J].Journal of Shanxi Agriculture Science,2016,44(7):932-937

[24]吳鳳鳳.發芽對糙米主要營養成分,功效和加工特性的影響[D].無錫：江南大學，2013

Wu F F.Effect of germination on nutritional components physiological functions and processing characteristics of brown rice[D].Wuxi:Jiangnan University,2013

[25]Repo C R,Espinoza C,Jacobsen S E.Nutritional value and use of the andean crops quinoa(chenopodium quinoa)and kafliwa(chenopodiumpallidicaule)[J].Food Reviews International,2003,19(1/2):179-189

[26]王莘，王艷梅，等.綠豆萌芽期功能性營養成分的測定和分析[J].中國食品學報,2004(4):48-50

Wang X,Wang Y M,et al.Analysis and determination of functional nutrition composition in Mung beans during sprouting period[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2004(4):48-50

[27]Pawel P,Henryk B,Pawet Z,et al.Anthocyanins,total polyphenols and antioxidant activity in amaranth and quinoa seeds and sprouts during their growth[J].Food Chemistry,2009(115):994-998

[28]Alvarez-Jubete L,Wijingaard H,Arendt E K,et al.Polyphenol composition and in vitro antioxidant activity of amaranth,quinoa buckwheat and wheat as affected by sprouting and baking[J].Food Chemistry,2010(119):770-778.

Effect of Quinoa Saponins Extraction and Sprouting on Saponins Content

Huang Jin Qin Likang Shi Qingnan Wen Anyan

(School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025)

Response surface design was applied to optimize the extraction process of quinoa seed saponin.And then the effect of sprouting on saponin content was investigated.On the basis of single factor experiments,alcohol concentration,solid-liquid ratio and extraction temperature were selected for a three-factor-three-level Box-Behnken experimental design and the response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions.The desired amount of saponin was 5.56 mg/g under the condition:65% ethanol,solid-liquid ratio of 1:40 and extraction temperature at 60 ℃.The germinating test results showed that the saponin was quickly decreased in the early bud(within 6 h),kept steady during 6～42 h and then increased gradually with sprouting after 42 h.The peak value(7.80 mg/g)was reached on the fourth day,after that,it declined slowly with germinating after 120 h.

quinoa,germinated,saponins,response surface design

S512.9

A

1003-0174(2017)11-0034-07

六盤水市級科技計劃(52020-2015-02)

2016-10-31

黃金，女，1991年出生，碩士，食品科學

秦禮康，男，1965年出生，教授，食品科學