響應面優化金線草主根多酚提取工藝及其抗氧化性

,,,,,*

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

響應面優化金線草主根多酚提取工藝及其抗氧化性

方蘭1,2,邱樹毅1,2,周鴻翔1,2,曾海英1,2,王曉丹1,2,*

(1.貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州貴陽 550025)

采用乙醇回流法從金線草主根中提取多酚類物質,利用響應面法建立多酚得率與溫度、乙醇濃度、液料比、時間之間的數學模型。通過此模型確定金線草主根多酚的最適提取工藝參數,并通過體外抗氧化實驗評價其抗氧化能力。結果表明:該多酚得率模型的擬合度很好,最佳工藝參數為溫度83.7 ℃、乙醇濃度43%、液料比30 mL/g、時間149 min。在此條件下,經過第一次提取其多酚得率為90.065 mg/g,而提取兩次時可高達93.380 mg/g。金線草主根多酚具有較強的DPPH·和羥基自由基清除能力,其半數抑制濃度分別為0.175 mg/mL和0.025 mg/mL。

金線草主根,多酚,響應曲面,抗氧化

金線草(AntenoronfiliformeRob. et Vaut.)為蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)下的一個種,多年生草本,高50～100 cm,為民間草藥,始載于《本草拾遺》[1],以毛蓼之名載于《植物名實圖考》[2]。金線草具有祛風除濕;止痛、健脾燥濕、散瘀消腫、治霍亂、癰腫瘰疬;散瘀止血、解毒利氣;收斂、治跌打損傷[3-6]等多種功效;通過經典的抗炎、鎮痛實驗也表明了金線草具有抗炎、鎮痛及抗凝血的藥理作用[7],具有較高的藥用價值,這有可能和金線草多酚有關。多酚具有抗癌、抗菌、抗氧化和預防心腦血管疾病等多種生物活性[8-10],抗氧化活性是植物多酚的一個重要性質,其抗氧化能力與多酚類物質的含量和種類有關[11]。金線草分布范圍廣,主要分布貴州、山東、河南、山西、陜西、湖北、四川、云南、廣西、廣東、江西、浙江、江蘇等地,資源較為豐富。若能充分利用這一資源,將能提高金線草的社會價值。

目前,植物多酚提取方法主要有經典的回流提取、超聲波輔助提取、微波協同提取、酶法輔助提取等,回流提取法是用乙醇等易揮發的有機溶劑提取原料成分,將浸出液加熱蒸餾,其中揮發性溶劑餾出后又被冷卻,重復流回浸出容器中浸提原料,這樣周而復始,直至有效成分回流提取完全的方法。此實驗選用乙醇為提取劑,為了減少乙醇的揮發,選用回流提取金線草主根中的多酚。

近年來,有關金線草的研究報道中,樊寶娟等[1]用HPLC法測定金線草不同部位沒食子酸的含量,趙友興等[12]從金線草的乙醇提取物中共分離鑒定出11種化合物,曹望弟等[13]對金線草的質量標準進行了研究。但鮮有文獻對其主根中多酚類物質進行研究,鑒于此,本文采用響應面設計對金線草主根多酚的提取工藝進行優化,并測定金線草主根多酚提取液對二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)和羥基自由基的清除作用,研究金線草主根多酚的體外抗氧化能力,為后續開發利用金線草提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

金線草 貴州省六盤水市六枝特區，采摘時間:2017年4月1日,將金線草主根洗凈,打碎,并過20目篩,于自封袋中(鮮樣)保存于4 ℃的冰箱,及時使用;沒食子酸標準品 貴州迪大生物科技有責任限公司,純度≥99%;福林酚 北京索萊寶科技有限公司;無水碳酸鈉 天津市永大化學試劑有限公司;無水乙醇 天津市富于精細化工有限公司;VE、VC北京奧博星生物技術有限責任公司;DPPH 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司。

721可見分光光度計 上海菁華科技有限公司;FA2004N電子天平 上海菁海儀器有限公司;HH數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠;XTP-200型高速多功能粉碎機 永康市紅太陽機電有限公司;SHZ-111型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 金線草水分含量的測定 水分含量的測定采用GB5009.3-2016《食品中水分的測定方法》[14]。

1.2.2 金線草主根多酚的提取 金線草鮮樣→拋去莖葉及須根→主根打碎→過篩→提取→真空抽濾→定容→稀釋→計算含量

上述流程中,過篩是過20目的篩子;提取:準確稱取3 g樣品于平底燒瓶中,在一定的乙醇濃度、液料比和溫度下進行乙醇回流提取一段時間;定容:濾液用提取溶劑定容到100 mL;稀釋:取1 mL濾液用提取溶劑稀釋10倍,待用。

1.2.3 沒食子酸標準曲線的制作 采用福林酚法,根據黃欣欣[15]的方法并稍做修改,標準溶液的配制:準確稱取0.0115 g沒食子酸標準品,用蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中,得濃度為0.115 mg/mL的沒食子酸標準溶液,待用。量取沒食子酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別于25 mL容量瓶中,依次加蒸餾水至5 mL,然后再依次加入福林酚試劑0.5 mL,搖勻1 min,最后依次加20% Na2CO3溶液1.5 mL,用蒸餾水定容,搖勻,避光放置2 h;以溶劑作空白,蒸餾水作參比,在752 nm(通過掃描其溶液在752 nm下有最大吸收峰)下測吸光度,以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.4 金線草主根多酚得率的計算 取1 mL稀釋液至25 mL容量瓶中,按1.2.3步驟進行并測定吸光度,由回歸方程計算樣品多酚的濃度,并按式(1)計算多酚得率(以干質量計)。

多酚得率(mg/g)=(C×Va×Vb×N)/(M-M×w)×v

式(1)

式中,C提取液多酚的濃度(mg/mL);Va是容量瓶量程(25 mL);Vb是提取液總體積(100 mL);N稀釋倍數10;M樣品質量3 g;w為水分含量57.89%;v為1 mL稀釋液。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 時間對多酚得率的影響 以70%乙醇為提取劑、液料比為30 mL/g、70 ℃恒溫水浴,乙醇回流提取,提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,考察時間對多酚提取的影響。

1.2.5.2 液料比對多酚得率的影響 以70%乙醇為提取劑、70 ℃恒溫水浴、提取時間2.5 h,分別在液料比為15、20、25、30、35 mL/g下,考察液料比對多酚提取的影響。

1.2.5.3 乙醇濃度對多酚得率的影響 70 ℃恒溫水浴、液料比為30 mL/g、提取時間2.5 h,在乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%下,考察乙醇濃度對多酚提取的影響。

1.2.5.4 溫度對多酚得率的影響 以50%乙醇為提取劑、液料比為30 mL/g、提取時間2.5 h,水浴溫度為50、60、70、80、90、100 ℃下,考察溫度對多酚提取的影響。

1.2.6 響應面優化實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上,根據響應面Box-Behnken的設計原理,以提取溫度、乙醇濃度、料液比、時間為因子,以金線草主根多酚得率(mg/g)為響應值,設計4因素3水平的響應面實驗,因素水平表見表1。

表1 響應面分析實驗設計因素與水平

1.2.7 提取次數對多酚得率的影響 在乙醇回流提取的最佳工藝條件下,分別提取1、2、3、4次,研究最佳工藝條件下提取次數對多酚得率的影響。

1.2.8 抗氧化活性的測定

1.2.8.1 DPPH·清除率的測定 不同濃度提取液的配制:準確稱取3.0 g樣品,在最適工藝條件下進行提取,計算出多酚含量,并將提取液分別稀釋成多酚濃度為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200和0.250 mg/mL的溶液。配制濃度為0.025、0.050、0.075、0.100、0.125、0.150、0.175、0.200和0.250 mg/mL的VC和VE溶液。

參考李西柳等[16]、石恩慧等[17]和吳林秀等[18]的方法并稍作修改,分別取上述不同濃度的提取液、VC溶液和VE溶液2.0 mL于具塞試管中,再加入2.0 mL DPPH·無水乙醇溶液(0.2 mmol/L),搖勻避光放置30 min,用無水乙醇調零,測定517 nm波長處的吸光度(A1);同法,用等量的無水乙醇代替2.0 mL DPPH·溶液,測吸光度作為對照(A2);測2.0 mL DPPH·無水乙醇溶液與2.0 mL無水乙醇溶液的混合液作為空白(A3)。DPPH·清除率按式(2)計算。

式(2)

1.2.8.2 羥基自由基清除率的測定 采用水楊酸法[19],并稍作修改,分別取1.2.8.1中不同濃度提取液和VC溶液2 mL于具塞試管中,依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4、2 mL 6 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液,在37 ℃的鼓風干燥箱中反應30 min后,在波長510 nm處測定吸光度A1,未加入H2O2的溶液的吸光度A2,按相同方法測定未加入樣品的溶液吸光度A3,均以蒸餾水為參比溶液。羥基自由基清除能力按式(3)計算。

式(3)

1.3數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,驗證實驗為5次重復實驗的平均值,并表示為平均值±標準差,單因素實驗數據運用Origin 8.5軟件繪制趨勢圖,響應面實驗采用Design-Expert 8.06軟件進行方差分析,并優化出最佳提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1金線草主根水分含量的測定

按照GB5009.3-2016《食品中水分的測定方法》測得金線草主根的水分含量為57.89%±0.02%。

2.2標準曲線的建立

以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標注曲線。得到標準曲線的回歸方程為:Y=95.652X+0.007,R2=0.9988,表明沒食子酸濃度在0～0.0046 mg/mL范圍內,沒食子酸濃度與吸光度值線性關系良好。

2.3金線草主根多酚提取的單因素實驗

2.3.1 提取時間對多酚得率的影響 如圖1可見,隨著提取時間的增加,多酚得率出現先增加后迅速減小的變化趨勢,2.5 h為多酚提取的最佳時間。分析其原因,可能是在較短的時間內,多酚還沒有完全提取出來,所以隨著提取時間的延長,多酚的得率逐漸增加,但如果時間過長,在較高溫度下,多酚被破壞,從而導致得率下降。

圖1 提取時間對多酚得率的影響

2.3.2 液料比對多酚得率的影響 如圖2可見,在液料比小于30 mL/g時,隨著液料比的增加,多酚得率增加,在液料比為30 mL/g左右時,多酚得率達到最大,之后隨著液料比的增加,多酚得率減少。這可能是因為,增大液料比,溶劑的量也就相應增多,樣品在溶液中的分散程度增大,接觸面積也增大,有利于多酚提取,但當液料比過大時,其中的雜質如可溶性的蛋白、多糖、果膠溶出,這些雜質可能吸附多酚或者和多酚結合,從而導致其多酚浸出率較少[20]。因此液料比為30 mL/g時,多酚得率達到最大。

圖2 液料比對多酚得率的影響

2.3.3 乙醇濃度對多酚得率的影響 如圖3可見,在乙醇濃度小于50%時,隨著乙醇濃度的增加,多酚得率增加,在乙醇濃度大于50%時,隨著乙醇濃度的增加,多酚得率減少,這可能由于乙醇濃度過大,容易揮發,同時其他一些醇溶性物質和脂溶性雜質的溶出的增加,或可能是高濃度的乙醇使蛋白質變性,影響與之結合多酚的溶出[21],從而導致多酚得率的下降,當乙醇濃度為50%時,得率達到最大,這有可能是金線草主根多酚的極性與50%乙醇的極性相同[23]。

圖3 乙醇濃度對多酚得率的影響

2.3.4 提取溫度對多酚得率的影響 如圖4可見,在80 ℃之前,隨著提取溫度的增加,多酚得率增加,在80 ℃以后,隨著提取溫度的增加,多酚的得率減少,80 ℃時多酚得率達到最大。這可能是因為高溫有利于引起細胞膜結構的變化,加劇分子的運動,從而使多酚得率增加,但隨著溫度升高,由于溫度過高,從而引起多酚類物質結構發生氧化,破壞了多酚類物質[23],使得多酚的得率又有所下降。

圖4 提取溫度對多酚得率的影響

2.4響應面優化實驗

2.4.1 二次響應面回歸模型的建立與分析 響應面的設計與結果見表2,本次實驗中,共進行了5次中心實驗,用于估計實驗誤差。

表2 響應面實驗設計與結果

表3 回歸方程系數顯著性檢驗表

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

應用Design-Expert 8.06軟件進行分析,得到各因素與響應值的二次多項式方程模型:多酚得率Y=88.18+5.79A-4.16B+0.22C-1.59D-2.26AB-3.05AC+3.23AD-0.18BC+0.21BD-0.16CD-9.89A2-3.76B2-8.64C2-5.84D2。

由表3回歸方程系數顯著性檢驗表可知,該模型的p值小于0.0001,模型極顯著,失擬誤差p值等于0.708(p>0.05),失擬誤差不顯著,模型R2=0.9997,RAdj=0.9995,說明模型的誤差較小,擬合度較高,能夠較準確的反應實驗因素對響應值的影響。

對回歸模型的顯著性檢驗可知,A、B、C、D、AB、AC、AD對多酚的提取有極顯著影響,BD對多酚的提取有顯著影響,BC、CD對多酚提取的影響不顯著。各因素對多酚提取的影響依次為A(溫度)>B(乙醇濃度)>D(時間)>C(液料比)。

2.4.2 兩因子間交互作用分析 圖5是由響應值和實驗因素構成的立體曲面圖,其圖顯示了提取溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間中任意兩個變量取零水平時,其余兩個變量對金線草主根多酚提取的影響。每個圖的交互作用都呈現先增加后減小的趨勢,從各圖的變化幅度及等高線可以看出,圖5a、圖5b、圖5c有極顯著交互作用;圖5e有顯著交互作用;圖5d、圖5f的交互作用不顯著。

圖5 任意兩變量對總酚得率影響的響應曲面圖

2.4.3 最佳工藝條件的預測及實驗驗證 通過Design-Expert 8.06軟件進行分析,可以預測乙醇回流提取金線草主根多酚的最佳工藝條件為:溫度83.68 ℃、乙醇濃度43.35%、液料比29.78∶1 mL/g、時間2.48 h,此時能夠得到的多酚理論得率為90.663 mg/g。結合實際生產,將各影響因素調整為溫度83.7 ℃、乙醇濃度43%、液料比30 mL/g、時間149 min。在此條件下,進行5次平行驗證實驗,金線草主根多酚的平均得率為(90.065±0.123) mg/g,與理論值90.663 mg/g相比誤差僅為0.66%,驗證了該模型是可行有效的。

2.4.4 提取次數的影響 在最佳提取工藝條件下,進行實驗,研究提取次數對多酚得率的影響,結果如圖6。由圖6可以看出,提取一次時,得率為90.065 mg/g,提取量占4次總量的百分比最大,為95.79%,提取兩次時,得率為93.380 mg/g,占到99.33%,基本已經把多酚類物質提取完全,考慮到成本問題,在最佳工藝條件下提取兩次金線草主根多酚為最佳。

圖6 提取次數對多酚得率的影響

2.5金線草主根多酚抗氧化活性的分析

2.5.1 金線草主根多酚提取液對DPPH·清除作用 由圖7可知,隨著金線草多酚提取液和VC濃度的增加,對DPPH·的清除率也在逐漸增大。對于多酚粗提物,當濃度達到0.175 mg/mL時,其對DPPH·的清除率達到50.27%,當濃度達到0.200 mg/mL以后,其對DPPH·清除率趨于穩定;對VC溶液,當濃度達到0.100 mg/mL時,對DPPH·的清除率達到50.11%,濃度達到0.150 mg/mL以后,對DPPH·清除率趨于穩定;VE溶液對DPPH·的清除率隨著濃度的增加其清除率成線性增加,線性方程為y=130.61x-1.4933(R2=0.9847)。DPPH·的清除率的大小常用半清除率IC50表示,指當清除率達到50%時所需要的抗氧化劑的濃度,IC50越小表示其抗氧化能力越強。多酚提取液、VC、VE對DPPH·清除率的IC50分別為0.175、0.100和0.394 mg/mL,多酚提取液對DPPH·的清除率低于同濃度下的VC,高于VE,這可能與金線草主根中的多酚活性物質的種類有關,具體原因將有待進一步的研究和分析。

圖7 金線草主根提取液對DPPH·的清除作用

2.5.2 金線草主根多酚提取液對羥自由基清除作用 由圖8可知,隨著金線草多酚提取液、VC濃度的增加,其對羥基自由基的清除率也在逐漸增大。對多酚粗提物,當濃度達到0.025 mg/mL時,其對羥基自由基的清除率達到49.62%,當濃度達到0.175 mg/mL以后,其對羥基自由基清除率趨于穩定;對VC溶液,當濃度達到0.200 mg/mL時,對羥基自由基的清除率達到50.86%,濃度達到0.350 mg/mL以后,對羥基自由基清除率趨于穩定;多酚提取液、VC對羥基自由基的清除率的IC50分別為0.025、0.200 mg/mL。多酚提取液對羥基自由基清除作用高于VC,表明金線草主根多酚提取物對羥基自由基具有較強清除作用,這可能與金線草多酚粗提物中主要活性物質的種類有關,具體原因將有待進一步的研究和分析。

圖8 金線草主根提取液對羥自由基清除作用

3 結論

采用乙醇回流提取法提取金線草主根中的多酚物質,在單因素實驗基礎上,通過響應面Box-Benhnken實驗設計,建立金線草主根多酚得率的二次多項式數學模型。金線草主根多酚的最佳工藝條件為:溫度83.7 ℃、乙醇濃度43%、液料比30 mL/g、時間149 min,在此條件下實際測定的多酚可達到(90.065±0.123) mg/g,所得值與模型預測值90.663 mg/g高度相符,誤差僅為0.66%,驗證該模型是可行有效的。金線草主根多酚提取液對DPPH·和羥基自由基具有較強清除作用,其IC50分別為0.175 mg/mL和0.025 mg/mL。

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OptimizationofextractiontechniqueofpolyphenolsfromAntenoronfiliformetaprootbyresponsesurfacemethodologyanditsantioxidantactivity

FANGLan1,2,QIUShu-yi1,2,ZHOUHong-xiang1,2,ZENGHai-ying1,2,WANGXiao-dan1,2,*

(1.Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineeringand Biological Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The polyphenols in taproot ofAntenoronfiliformewas extracted by ethanol reflux extraction,and the mathematical model of the yield of polyphenol with temperature,ethanol concentration,liquid ratio and time was established by response surface methodology. Through this model,the optimum extraction process parameters of polyphenols were determined,and their antioxidant capacity was evaluated byinvitroantioxidant assay. The results showed that the polyphenol extraction rate model had a good reliability,the optimized extraction conditions were extraction temperature of 83.7 ℃,ethanol concentration of 43%,liquid to solid ratio of 30 mL/g and extraction time 149 min. Under these conditions,the polyphenol extraction rate was 90.065 mg/g for the first extraction,and two times extraction could be as high as 93.380 mg/g. Polyphenols inAntenoronfiliformetaproot had strong DPPH· and hydroxyl free radical scavenging activity,and their half inhibitory concentration(IC50)were 0.175 mg/mL and 0.025 mg/mL,respectively.

Antenoronfiliformetaproot;polyphenols;response surface;antioxidant activity

2017-05-11

方蘭(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：生物活性物質的提取分離，E-mail:fl18786110476@163.com。

*

王曉丹(1980-)，女，博士，高級實驗師，研究方向：應用生物技術，E-mail:wangxiaodan0516@126.com。

貴州大學教育教學改革研究項目(JGYB201531)；貴州大學品牌特色專業建設(培育)項目(PTPY201303)；貴州大學“本科教學工程”建設項目(JG201641)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)22-0150-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.030